一种定量测定植物中生长素与脱落酸含量的方法
【专利摘要】本发明提供一种定量测定植物中生长素和脱落酸含量的方法，步骤如下：将样品研磨后用甲醇进行浸提，加入内标D5-IAA和D6-ABA，用净化-定量-浓缩多联机系统的EVA功能浓缩溶液，用乙酸乙酯等体积萃取激素，用氮气吹干，再用HAc溶解，用净化-定量-浓缩多联机系统中的SPE功能过固相萃取柱纯化，收集洗脱样品；将洗脱样品干燥后，用甲醇溶解得到待测样品，将待测样品采用液质联用方法测定生长素和脱落酸的含量。本发明建立了一个省时、高效的分析方法，分离效果理想。大大减少了分析样品的用量，有利于操作步骤的简化，杂质少。本发明实现前处理的自动化，缩短了操作时间，减少系统误差，使前处理过程更加精准。
【专利说明】一种定量测定植物中生长素与脱落酸含量的方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种定量测定植物中生长素与脱落酸含量的方法。

【背景技术】
[0002]植物体内具有多种内源激素，其含量及存在形式不断变化，并产生一系列生理生化反应，在一定程度上影响和控制植物的生长、发育、成熟和衰老等过程。生长素参与根和茎的发育和生长、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育，以及植物的向地和向光反应等。ABA能促进果实与叶片脱落、器官衰老和气孔关闭、影响植物开花、调节种子和胚的发育等生理功能。果实中激素的种类及含量的多少直接影响果实的发育，因此建立合理实用的激素含量分析方法，对研究植物的生长发育有重要意义。
[0003]植物组织中生长素(吲哚-3-乙酸，IAA)和脱落酸(ABA)含量甚微，测定困难，目前植物内源激素的分析方法主要有酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)等。液相色谱选择性和特异性差，气质联用衍生过程繁琐。液质联用不需目标物衍生处理，操作简便，而且灵敏度高、选择性和特异性好，然而目前所报道的液质方法，前处理净化只采用传统的固相萃取净化，操作繁琐、耗时费力，无法实现标准化、自动化，人为误差较大，无法保证定量结果的准确性和可靠性。


【发明内容】

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种定量测定植物中生长素与脱落酸含量的方法。本发明在多种分析方法的基础上，通过改进液质联用分析方法中的前处理方法，采用在线SPE/凝胶净化/定量浓缩多联机系统的固相萃取(SPE)和定量浓缩(EVA)功能，该仪器可以自动完成SPE净化过程，且EVA由真空、加热、氮吹三位一体构成，三道红外传感器可精确定容，具有多种溶剂转换、蒸发至干、自动稀释、定量转移等功能，该系统常见于果蔬中农药的残留、土壤及动物血液中有毒物质及食品中塑化剂的前处理过程，在植物激素测定的方法中未见报道。对待测样品中IAA和ABA进行液相色谱串联质谱(high-performance liquid chromatography-tandem massspectrometric, LC-MS/MS)石开究，采用添加同位素(D5-1AA, D6-ABA)到样品中作为定量测定的手段，保证了定性、定量结果的可靠性，为植物体内源激素的研究提供了关键技术方法。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
本发明提供了一种定量测定植物中生长素和脱落酸含量的方法，步骤如下:将样品研磨后用甲醇进行浸提，加入内标D5-1AA和D6-ABA，用净化-定量-浓缩多联机系统的EVA功能浓缩溶液，用乙酸乙酯等体积萃取激素，用氮气吹干，再用HAc溶解，用净化-定量-浓缩多联机系统中的SPE功能过固相萃取柱纯化，收集洗脱样品；将洗脱样品干燥后，用甲醇溶解得到待测样品，将待测样品采用液质联用方法测定并计算生长素和脱落酸的含量。
[0006]优选地,所述样品的质量为0.5g-2.0g。
[0007]进一步地,所述样品的质量为0.5g。
[0008]优选地，所述甲醇的体积百分比浓度为70-90%。
[0009]进一步地，所述甲醇的体积百分比浓度为80%。
[0010]优选地，所述浓缩溶液时的浓缩温度为35_45°C。
[0011]进一步地，所述浓缩溶液时的浓缩温度为35°C。
[0012]优选地，所述固相萃取柱为C18柱。
[0013]本发明建立了净化-定量-浓缩多联机系统一液相色谱一质谱联用仪(GPC-HPLC-MS/MS)，内标法定量测定植物组织中吲哚_3_乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的方法。实验以板栗为材料，通过正交试验筛选出最适的提取与纯化方法，结果表明:经检测，取材料0.5g,80%甲醇(预冷)4°C冰箱中浸提过夜，并加入500ngD6-ABA，100ngD5_IAA35°C浓缩至水相，用乙酸乙酯等体积萃取激素，氮吹至干，用HAc溶解，经C18小柱纯化，ABA与IAA的含量相对较高。
[0014]本发明通过优化板栗IAA、ABA两种内源激素的提取纯化条件，建立了一个省时、高效的LC-MS/MS分析方法，分离效果理想。仅0.50g的样品用量，大大减少了分析样品的用量，并有利于操作步骤的简化，杂质少。实验中采用GPC纯化系统完成多个步骤，实现前处理的自动化，缩短了操作时间，减少系统误差，使前处理过程更加精准。内源激素与所用内标的结构式非常相近，因而在提取、纯化过程中内源激素与内标均同步进行，两者同时进入色谱柱，几乎有相同的保留时间。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为板栗果实样品及激素标准样的色谱图；其中，Al为IAA和ABA标样及内标的总峰图；A2为D5-1AA的子离子峰图；A3为IAA的子离子峰图；A4为D6-ABA的子离子峰图；A5为ABA的子离子峰图。BI为样品中IAA和ABA的总峰图；B2为样品中D5-1AA的子离子峰图；B3为样品中IAA的子离子峰图；B4为样品中D6-ABA的子离子峰图；B5为样品中ABA的子离子峰图。此处将“B3为样品中d5-1AA的子离子峰图；”修改为“B3为样品中IAA的子离子峰图；”
图2为使用不同重量的样品应用本发明的方法检测到的IAA和ABA含量。

【具体实施方式】
[0016]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]材料与方法 1.1材料
试材选自怀柔板栗试验站种质的燕红板栗(Castanea mollissima)果实,放入液氮中冷冻，然后置于-80 V冰箱保存，用于激素测定。
[0018]1.2 仪器
高效液相色谱一质谱联用仪(Agilentl200型液相色谱仪一Agilent 6410型串联四极杆质谱);GPC (净化-定量-浓缩多联机系统)；离心机(SIGMA，3K15)。
[0019]1.3 试剂
IAA 内标(Toronto Research Chemicals Inc, D5-1AA) ；ABA 内标(Toronto ResearchChemicals Inc, D6-ABA) ；C18 柱(Cleanert S C18-SPE,500mg/3mL);阴离子交换柱(Cleanert SAX-SPE, 500mg/3mL);纤维素柱(Agilent Bond Elut-Cellulose, 500mg/3mL)；二乙基二硫代氨基甲酸钠(抗氧化剂);交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP);甲醇(色谱纯);超纯水为实验室提供；其他有机试剂均为分析纯，来自北京化工厂。
[0020]1.4样品的制备
准确称取1.1中保存的板栗果实样品，研磨，加入抗氧化剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和掩蔽剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(BHJ)各0.1?0.15g，加入体积百分比浓度为80%甲醇(预冷)，约20倍体积，4°C静置过夜；取出样品，8000rpm，4°C离心15min，取上清；用1ml体积百分比浓度为80%甲醇(预冷)洗沉淀3次，混合上清；加入10ngD5-1AA和500ngD6_ABA，加入两滴氨水，摇匀；用净化-定量-浓缩多联机系统的EVA功能，在一定温度下将溶液浓缩至5ml ;浓缩后的液体，3500rpm,4°C离心25min ;用2mol/L HCl调pH至2.5 ;加入少量PVPP，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相；加入两滴氨水，混匀^EVA中将乙酸乙酯用N2吹干；用0.lmol/LHAc定容至3mL ;用净化-定量-浓缩多联机系统中的SPE功能过固相萃取柱，收集洗脱样品；加两滴氨水，真空冷冻干燥至干；用ImL甲醇溶解，得到待测样品。将待测样品采用液质联用方法测定并计算IAA和ABA的含量。
[0021]采用正交试验设计对前处理过程进行优化，将样品量设为2g、lg、0.5g ;甲醇抽提体积百分比浓度设为90%、80%、70% ;GPC浓缩温度设为45°C、40°C、35°C;固相萃取柱为C18、阴离子交换色谱、纤维素柱。
[0022]1.5色谱条件
色谱柱:ZORBAXSB-Aq 柱:5 μ m,4.6 mmX 150 mm ;流速:0.3mL/min ;柱温:30°C ;进样量:5 μ L ;流动相Α，含体积百分比0.1%的乙酸水溶液；流动相B，甲醇。
[0023]1.6质谱条件
ESI离子源，正负离子检测方式，MRM模式。离子源条件为干燥气温度350°C，干燥气流量12L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压，4000V，最优碎裂电压(frag)均为155V，最优碰撞能量(CE)为30V。
[0024]1.7净化-定量_浓缩多联机系统条件 1.7.1浓缩条件
水加热温度(Temperature water heating):35 °C ;浓缩枪底部温度(Temperaturebottom cone):35°C ;吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;定容溶液(Constant volumesolut1n):超纯水。
[0025]1.7.2固相萃取条件
吸液速度(Suct1n speed):20ml/min ;加样速度(Dispending speed):20ml/min ;甲醇和0.lmol/L醋酸对SPE柱进行活化、洗柱和洗脱。
[0026]2.结果与分析
2.1标样与样品的全谱图(参见图1)。
[0027]如图1所示，在以上色谱条件下，IAA和ABA能与其他成分得到很好地分离。从图中可以看出，标样从六、05-^^48六和06-六8六保留时间分别为:9.089min,9.123min,9.514min,9.539min。样品中IAA、D5-1AA, ABA和D6-ABA的保留时间与标样一致。IAA和ABA的特征离子，如表I所示。
[0028]表I ABA、IAA及相应内标产物的选择特征离子激素种类 ^ΙΠ/Ζ.......................................................................................1AA.....................................................................................^..........................................................................................176........................................................................................;D5-1AA.1Sl
ABA263
ID6-ABA269丨
2.2板栗果实中IAA与ABA的含量
从图1中得到内源激素与内标物的峰面积，按照以下公式计算内源激素ABA、IAA的浓度，结果如表2所不。

IflllX加入内■ X氘代率
__麵』變歷.......￥,γ5-

徉品重:1

ΣΑ176
—--，D5-1AA的加入量为

IAiSi
10ng,氣代率为98% ；
一 1C-1 A263
ABA内源峰面积/内标峰面积=\ ___，D6-ABA的加入量为500ng,氘代率

Ζ.*ΣΑ2_
为 100%O
[0030]通过以上公式计算得到IAA和ABA的含量,如表2所示。
[0031]通常测定激素需要大量的样品，有时候很难满足，在提取液用量一定的情况下，适当减少样品的用量，使得提取液提取的更加充分，得到更好的效果。本 申请人:将样品量设为三个梯度，分为0.5、1和2g。本 申请人:发现甲醇的提取率高、杂质较少，采用甲醇为提取溶齐U，设置三个浓度梯度70%、80%和90%。在体外的条件下，植物激素很容易降解或转化为其它形式，控制温度很重要，在甲醇浓缩过程中要既要将甲醇去除又要保持激素不被破坏，因此在浓缩的过程中采用了 35°C、40°C和45°C三个温度。在纯化过程中，为了达到更好的分离效果，选取了三种类型的纯化小柱，分别为C18、阴离子交换柱和纤维素柱。综合以上的结果，发现:取0.5g样品在80%甲醇中浸泡抽提，35°C下浓缩，经C18柱纯化达到的效果最好，如表2所示，使用组8提取纯化方法，IAA和ABA的含量都较高，这个方法适合用于这两种激素的提取。
[0032]表2不同处理条件板栗果实中IAA、ABA含量

【权利要求】
1.一种定量测定植物中生长素和脱落酸含量的方法，其特征在于:步骤如下:将样品研磨后用甲醇进行浸提，加入内标D5-1AA和D6-ABA,用净化-定量-浓缩多联机系统的EVA功能浓缩溶液，用乙酸乙酯等体积萃取激素，用氮气吹干，再用HAc溶解，用净化-定量-浓缩多联机系统中的SPE功能过固相萃取柱纯化，收集洗脱样品；将洗脱样品干燥后，用甲醇溶解得到待测样品，将待测样品采用液质联用方法测定并计算生长素和脱落酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述样品的质量为0.5g-2.0g。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述样品的质量为0.5g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述甲醇的体积百分比浓度为70-90%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述甲醇的体积百分比浓度为80%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述浓缩溶液时的浓缩温度为35-45°C。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述浓缩溶液时的浓缩温度为35°C。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述固相萃取柱为C18柱。
【文档编号】G01N30/06GK104165947SQ201410413383
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】杨柳, 秦岭, 王建立, 刘帅, 曹庆琴, 邢宇, 张卿 申请人:北京农学院