专利名称：检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量rt-pcr的方法及其引物组、探针和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法及其引物组、探针和试剂盒。
背景技术：
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)(原被鉴定为拟穴青蟹(Scylla serrata)因肉质鲜美、生长迅速、分布广泛，是我国海洋渔业重要的养殖品种。但随着养殖规模的逐步扩大，病害问题也不断严重。青蟹双顺反子病毒_1 (Mud Crab Dicistrovirus-l,MCDV_l)是在近几年发病的青蟹中新发现的一种病原体。感染MCDV-1的拟穴青蟹体色没有明显变化，食欲不振，活动乏力，即使白天也不会潜入沙中，人工感染死亡率达100%。该病毒属于单正链RNA，双顺反子病毒科，能通过浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染拟穴青蟹。到目前为止，对于MCDV-1感染还没有有效的治疗方法，杜绝传染源、防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断青蟹双顺反子病毒-1是减少损失的有效途径。因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防具有重要意义。实时突光定量Real time-PCR(Real time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction, Rea-1 time PCR),是指预先在 RT-PCR 反应体系中加入突光基团，可以是荧光染料，也可以是特异性标记的荧光探针，利用相应软件实时监测整个PCR进程中的荧光信号积累情况，最后通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其中Taqman探针技术是以Taqman突光探针为基础，Taqman突光探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统从而可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与RT-PCR产物形成完全同步，从而实现定量。实时荧光定量RT-PCR方法实时检测、速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已得到广泛应用。该技术应用于病毒检测中，不仅可以对病毒定性，还能准确定量病毒核酸，使研究病毒载量的变化规律成为可能，并可对抗病毒治疗和药物筛选做出评估，为相关研究工作提供了有效的技术平台。目前尚无青蟹双顺反子病毒-1荧光定量PCR用于检测的相关报道。

发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，该引物组和探针对青蟹双顺反子病毒-1具有高特异性，可用于实时荧光定量RT-PCR技术检测青蟹双顺反子病毒-1。本发明所要解 决的第二个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，该方法快速、高效，特异性高。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒_1中应用。本发明所要解决的第五个技术问题是提供上述对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。本发明所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.1所不，所述的下游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示,所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID N0.3所示,在所述的Taqman探针的5'端标记有FAM为荧光发射基团，3'端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。本发明所要解决的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，利用上述的引物组和Taqman探针通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。该方法具体包括以下步骤:一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，包括待测病毒RNA的提取及其cDNA的合成，在Taqman荧光定量RT-PCR反应体系进行Taqman突光定量RT-PCR反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立,计算得出待测结果，Taqman荧光定量RT-PCR反应体系中含有上述引物组和Taqman探针，可以通过荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。作为本发明的一种具体实施方式
，本发明所述引物组中上游引物和下游引物的摩尔浓度优选为0.4 μ mol/L , Taqman探针的摩尔浓度优选为0.2 μ mol/L。本发明对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，具体含以下步骤:(I)选择MCDV-1基因的一段100 200bp长度的保守片段，利用primerpremier5.0软件设计病毒特异性定量PCR引物对和探针，扩增片段大小为119bp，引物对和探针序列为:上游引物Dic-taqF:5' -ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3'；下游引物Dic-taqR:5' -CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3'；Taqman 探针:5' -FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3'，其中 FAM 为荧光发射基团，TAMRA为荧光淬灭基团。(2)构建和制备重组质粒标准品pMD 18-T-dic以上、下游引物进行常规PCR获得目的片段，利用DNA重组技术将包含目的片段的基因克隆到质粒载体pMD 18-T中，构建重组质粒pMD β 18-T-dic作为建立荧光定量PCR标准曲线的阳性标准品。(3)待测样本总RNA的提取和逆转录反应，获得样本cDNA。(4) MCDV-1荧光定量PCR检测方法的优化和建立经过对反应条件的优化，对建立的方法进行灵敏度、稳定性、特异性以及对临床标本的有效性进行综合评价。
本发明所要解决的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的:一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，含有上述的Taqman探针和引物组。作为本发明的一种具体实施方式
，本发明上述试剂盒中还可以含有荧光定量Realtime-PCR探针法反应预混液、阳性标准品(即含有目的片段基因的质粒)和无RNase水等。其中荧光定量PCR探针法反应预混液优选为iQTM Supermix(2x)，购自美国BIO-RAD公司，iQTM Supermix配方如下:2X反应缓冲液(含dNTPs)、iTaq DNA聚合酶、6mM MgCl2和稳定齐U，阳性标准品的质粒浓度优选为IO8Copies/ μ L。该试剂盒在使用时，先提取待测样品RNA反转录得到cDNA，然后用上述青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和探针进行荧光定量PCR反应，反应结果判定:I)若Ct值>35，且未出现标准扩增曲线，试验结果判断为阴性；2)若Ct值在15 35之间且出现标准扩增曲线，试验结果判断为阳性；3)结果为阳性的样品，根据Ct值带入已建立的标准曲线，可计算出病毒拷贝数。因为本发明的青蟹双顺反子病毒-1为RNA病毒，所以在试剂盒的制备时，配置有核酸提取和逆转录(RT)的试剂，会更加方便试验进展，如Trizol (总RNA提取试剂)、氯仿(可自备)、异丙醇(可自备)、体积百分含量为75%的乙醇(可自备)、无RNase水、RT反应液和逆转录酶等，其中，RT反应液优选含有IX反应缓冲液、0.5mM dNTPs、20mg/L随机引物和200units逆转录酶，逆转录酶可选择本领域做RT实验时常用的逆转录酶，如逆转录酶M-MLV等；所述IX反应缓冲液优选含有50mM pH8.3的Tris_HCl、75mM KClUOmM DTT和3mM MgCl2。在实际操作中，该试剂盒还可以包括盒子、泡沫板等，其中泡沫板的大小与盒子的底板的大小相同，可以装在盒子中，泡沫板上有不少于用于封装反应试剂小管数量的小孔，用于封装反应试剂的小管对应置于相应的小孔中，从而使得试剂都能处于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用时残留在管壁上的液体自动回到管底，节约试剂。上述快速诊断试剂盒的生产工艺，可以包括如下步骤:(I)将上下游引物及探针合成纯化后，定量配制，浓度检测，分装后抽样质检；(2)将Trizol分装后抽样质检；(3)将氯仿无菌分装，抽样质检；(4)将异丙醇无菌分装，抽样质检；(5)将体积百分含量为75%的乙醇无菌分装，抽样质检；(6)将无RNase水无菌分装,抽样质检；(7)将RT反应液无菌分装，抽样质检；(8)将iQTM Supermix无菌分装,抽样质检；

(9)将逆转录酶无菌分装，抽样质检；(10)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；(11)准备带有小孔的泡沫板；(12)组装试剂盒。本发明所要解决的第四个技术问题是通过如下技术方案来实现的:上述的青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒_1中应用。
本发明所要解决的第五个技术问题是通过如下技术方案来实现的:上述对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子病毒-1中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下优点:(I)本发明通过构建青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，建立实时荧光定量RT-PCR，由于Taqman法采用杂交的方式对靶基因进行甄别，准确性高，同时，因目的基因由引物组和探针双重控制，保证了特异性，降低了产生假阳性的概率；(2)本发明建立的基于Taqman探针的荧光定量RT-PCR方法可对待测样本进行定量检测，检测范围可达到9个数量级，在IO8 10°COpieS范围内具有很好的线性关系(R2=0.992)，其最低检测限可达到10个拷贝以下，灵敏度达到国际先进水平，适合检测低病毒含量的实验标本；(3)本发明检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法重复性和稳定性高,批内重复性试验的CT值变异系数(CV)为1.11%，批间重复性试验的CT值变异系数(CV)小于 1.3% ；(4)本发明检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，可进行高通量检测，自动化程度高，反应过程中无需开盖，避免了污染，PCR扩增和产物检测同步完成，操作简单，易于实现自动化；(5 )本发明建立的基于Taqman探针的荧光定量RT-PCR方法较常规RT-PCR，灵敏度和特异性均得到了很大的提高，并缩短了实验时间，简化了操作步骤，可对病毒进行定量，结果更为客观和准确，该检测试剂盒和检测方法对拟穴青蟹MCDV-1的早期诊断、临床检测及相关病毒研究的开展具有重要意义，具备广泛的适用性。


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图1是实施例2中荧光定量RT-PCR灵敏度检测的荧光信号图；图2实施例2中青蟹双顺反子病毒-1绝对定量的标准曲线，Υ=_3.3191gX+ 44.53(注:X表示反应体系中表示标准质粒拷贝数)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。实施例1青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组选择MCDV-1基因的一段100 200bp长度的保守片段，利用primer premier5.0软件设计病毒特异性定量PCR引物和探针，扩增片段大小为119bp，引物对和探针序列为:上游引物Dic-taqF:5 ' -ACGAAGAATCTATCACTGGAATTGAA-3 '，具体如 SEQ IDN0.1所示；下游引物Dic-taqR:5' -CGTCTGCTTCCCGGGTTT-3'，具体如 SEQ ID N0.2 所示；Taqman 探针:5' -FAM-AATGCTCTGAACCGGAGTACGTCTGCC-TAMRA-3 '，具体如 SEQID N0.3所示，探针5'端标记的荧光发射基团为FAM，3'端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。其中Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。
实施例2青蟹双顺反子病毒-1荧光定量RT-PCR检测方法的优化和建立( I)定量RT-PCR反应条件的优化对反应体系中引物浓度(0.1 0.5 μ M)、探针浓度(0.1 0.4 μ Μ)和退火延伸温度(55 64°C )进行了优化，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值作为标准，筛选出最佳的引物和探针浓度、退火延伸温度。本发明使用的荧光定量PCR仪为德国Eppendorf公司生产的Mastercyclerep realplex突光定量PCR仪,在每个循环的第二步结束时收集
突光信号。经优化后的定量PCR反应体系(15 μ L反应体系):
权利要求
1.一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，其特征在于:所述引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述的下游引物的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.2所不；所述的Taqman探针的喊基序列如序列表中SEQ ID N0.3所示；所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间；在所述的Taqman探针的5'端标记有FAM荧光发射基团，3'端标记有TAMRA荧光淬灭基团。
2.一种检测青蟹双顺反子病毒-1实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征是:利用权利要求I中所述的引物组和Taqman探针通过实时荧光定量RT-PCR反应对青蟹双顺反子病毒-1进行定性和定量检测。
3.一种对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征是:含有权利要求1所述的引物组和Taqman探针。
4.权利要求1所述的青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针在检测青蟹双顺反子病毒-1中应用。
5.权利要求3所述的对青蟹双顺反子病毒-1进行实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒在检测青蟹双顺反子 病毒-1中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种青蟹双顺反子病毒-1检测用引物组和Taqman探针，引物组由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，在所述的Taqman探针的5′端标记有FAM为荧光发射基团，3′端标记有TAMRA荧光淬灭基团，所述的Taqman探针位于所述上游引物和下游引物之间。还公开了采用该引物组和探针的检测青蟹双顺反子病毒-1的方法和试剂盒，该方法成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果差异显著，验证率高，更加明显可靠。
文档编号G01N21/64GK103243180SQ20131017524
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者郭志勋, 张迪, 马红玲, 冯娟, 苏友禄 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所