一种稳定的液体脂类校准品的制作方法
【专利摘要】本发明公开的稳定的液体脂类校准品包括：缓冲液20-200mmol/L；蛋白质类稳定剂2-10%（w/v）；电解质NaCl10-200mmol/L；抗氧化增效剂5-100mmol/L；糖类稳定剂10-100g/L；防腐剂0.09%（w/v）；抗氧化剂0.02-100mmol/L；蛋白酶抑制剂0.1-5mmol/L；载脂蛋白A-Ⅰ2.0-3.0g/L；载脂蛋白B2-2.5g/L。本发明有效地提高了载脂蛋白A-Ⅰ与载脂蛋白B的稳定性，可在2-8℃稳定冷藏一年，使用保存更为方便高效，并且能够提高测定样本中载脂蛋白A-Ⅰ与载脂蛋白B含量测定的准确性。
【专利说明】一种稳定的液体脂类校准品

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种稳定的用于载脂蛋白A-1与载脂蛋白B含量测定的校准品，特别是一种稳定的液体脂类校准品。

【背景技术】
[0002]传统的临床检验，要使检验结果可靠或有依据，往往有一个标准品(Standard)。以临床化学检验的比色测定为例，常作三个检测:空白、标准、测定。用空白液调整吸光度为零，读出测定比色液和标准比色液的吸光度，分别为As和Au ；已知标准液浓度为Cs。在一定范围内，某分析物浓度和吸光度呈良好比例关系。为了克服纯标准液和病人样品间的基体差异，20年前开始引用具有与病人样品基体相似的校准品替代标准品，用于日常工作。由于以往在使用标准品时不强调它的专用性，国内在应用校准品时忽略了它的专用性。任何方法或仪器、试剂使用一个校准品，严重影响检验质量。
[0003]为了克服基体效应，推荐使用校准品。校准品的大多来源为人的样品混合物，如混合血清。本身内含被检分析物，制备时可添加某些分析物增加含量。校准品中被检分析物的含量无法由称量法和容量法确定，只能倚赖于分析方法。校准品的校准值必须取决于分析方法或检测系列。
[0004]新鲜病人标本是最佳校准品，由于所有校准品都是处理过的样品，和新鲜病人标本有着基体差异。若使用公认的参考方法去标化测定校准品，测定程序是严密的，测定值是可靠的。但使用该测定值去校准常规的检测系列时，校准品中被检分析物参与反应时的表现明显不同于新鲜病人标本，不能将参考方法系列的准确度通过校准品传递给病人标本。
[0005]现有技术中载脂蛋白A-1与载脂蛋白B标准品易受干扰，不易保存并且保存时间不长，给临床检验带来了很大的困难。
[0006]现阶段，动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerosis card1vasculardisease, ACVD)包括冠心病、脑卒中和周围动脉疾病。2003年国际动脉粥样硬化学会发表的“预防ACVD临床指南”中确定载脂蛋白异常作为新的ACVD危险因素。而载脂蛋白A-1和B异常除了可见于肾肝疾病、糖尿病和内分泌代谢疾病外，主要作为ACVD危险因素，用于ACVD危险程度划分、预防和治疗。由此可见，载脂蛋白A- 1、B测定结果的准确性取决了整个检测分析系统的稳定可靠，其中校准品的量值溯源和其稳定性在很大程度上影响着测定结果。校准品内载脂蛋白浓度的改变直接导致样本内载脂蛋白的检测值发生错误，失去真实的参考性。
[0007]目前，国内生化类体外诊断试剂生产企业研发的用于脂类中载脂蛋白A-1和载脂蛋白B校准的校准品，主要是冻干品，这些校准品在复溶后不易保存，而且由于在冻干过程中载脂蛋白的分子结构会遭到破坏，导致载脂蛋白免疫反应性改变。复融后，在高温及反复冻融条件下同样可引起部分分析物质破坏。如果不注意使用会导致校准结果偏高，实际测得病人标本结果也会影响临床判断。国外知名诊断试剂公司像罗氏诊断以及朗道公司研发的血脂校准品，稳定时间长，准确度好，产品可溯源性强，但价格较贵。临床中综合考虑到成本、操作等因素，中小医院使用起来不是很方便。


【发明内容】

[0008]为解决上述问题，本发明公开了一种稳定的液体脂类校准品，通过在含有载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的血清基质液中添加适量硫代二丙酸、没食子酸丙酯、EDTA和抑肽酶等成份，均能提高载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的稳定性，由此制成液体脂类校准品，可在2-8°C稳定冷藏一年，并且对载脂蛋白A-1与载脂蛋白B具有良好的检测性能，检测精度高，响应效果好。
[0009]本发明公开的稳定的液体脂类校准品包括:
[0010]
缓冲液20-200ramol/L
蛋Cl质类稳定剂2-10% ( W/ V )
电解质 NaC I10-200mmo I /1.抗1?化增效剂5-1 OOmmo I/L
[0011]
糖类稳定剂10-1 OOg/丨.防腐剂0.09% (W/Y)
抗氧化剂O, 02-1 OOmmo I / L
蛋P酶抑制_0.l-5mmol/L
载脂蛋 H Λ-12.0-3.0g/L
载脂蛋 Q B2-2.SgZLc
[0012]作为一种优选，所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PB缓冲液中的一种，并且缓冲液的酸碱度为PH = 7-8。
[0013]作为一种优选，所述稳定剂包括蛋白质类稳定剂或者糖类稳定剂中一种或几种混合物，所述蛋白质类稳定剂为BSA、HGG、HAS中一种或几种，所述糖类稳定剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一种或几种。
[0014]作为一种优选，所述蛋白酶抑制剂为EDTA、抑肽酶、PMSF中的一种或几种。
[0015]作为一种优选，所述抗氧化剂为硫代二丙酸、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚中的一种或几种。
[0016]作为一种优选，所述抗氧化增效剂为柠檬酸、乳酸钠、EDTA中的一种。
[0017]作为一种优选，所述防腐剂为叠氮盐类或proclin系列防腐剂，其中叠氮盐类防腐剂主要为NaN3, proclin系列防腐剂主要为Proclin300。
[0018]作为一种优选，本发明公开的稳定的液体脂类校准品主要包括以下组分:
[0019]
IiIiP1-S (缓冲液，pH7-?)20-200mmo丨/1.人沾丨---- (稳定剂)卜;5% (w/v)
人 Y 球---- C 稳记剂)1-5% (w/ V)
XaCl (电解质)10-200m1 丨/L
乳酸钠(抗氣化增效剂)5-1 OOmmo I/1.海藻糖(稳定剂)ICM00g/L
呑鉍钠(防腐剂)0.0!? (w/v)
硫代—:W酸(.抗％〔化剂)5-1OOmmo 1,.1,
没食 /-酸WSi (抗铽化剂)O, 02-1.0mmol/1.EDTA ( M 丨:J ft抑制剂)0.1 -5mmo:l / L
抑呔_ (蛋1+'丨_抑制剂)1-25mg/l.栽脂蛋Π Λ-12.0-3.0g/1.载脂-- 1-H B2~2.0g/1.c
[0020]机理
[0021]1、该校准品为液体形式，其优势在于不用冻干，不易破坏载脂蛋白的结构，比干粉更稳定。
[0022]2、加入的稳定剂主要从两方面提高复合校准品的稳定性:
[0023]载脂蛋白在液体状态下极易发生自发氧化，使校准品值在短时间内下降，所以必须使用有效的抗氧化剂阻止或减缓载脂蛋白的氧化速度。然而普通抗氧化剂抗氧化效果经过长时间后均会下降。有研究表明硫代二丙酸与酚类抗氧化剂联合使用可以产生一种协同效应，从而增强抗氧化效果。
[0024]另一方面自然界中存在许多种蛋白水解酶，载脂蛋白在蛋白酶作用下发生降解，校准品中有效成分不断减少。在校准液中加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性，保存载脂蛋白结构的完整性。EDTA是一种金属蛋白酶抑制剂，通过螯合金属离子夺取金属蛋白酶活性必需的金属离子，使其失活；抑肽酶也称胰蛋白酶抑制剂，是一种天然广谱蛋白酶抑制剂，能与多种蛋白酶的活动中心竞争一个赖氨酰基而抑制其活性。
[0025]通过在含有载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的血清基质液中添加适量硫代二丙酸、没食子酸丙酯、EDTA和抑肽酶等成份，均能提高载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的稳定性，由此制成液体脂类校准品，可在2-8°C稳定冷藏一年。

【具体实施方式】
[0026]下面结合【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解下述【具体实施方式】仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0027]本发明公开的稳定的液体脂类校准品包括:
[0028]缓冲液20-200mmol/l.饭「1质炎稳记剂2-10% (w/v)
电解质 \a(:l10-200mmo!;1.化増效剂10mmo I / L
糖类稳定剂HMOOg-L
防腐剂0.09% (w/v)
抗鉍化剂0.02-1OOtiB1 1/L
SiClfti抑制剂0.1-SfnmoI/L
载脂蛋 I+1 Λ-12.0-3.0g/1,
载脂蛋丨?Β2-2.Sgv1.,
[0029]作为一种优选，所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PB缓冲液中的一种，并且缓冲液的酸碱度为PH = 7-8。
[0030]作为一种优选，所述稳定剂包括蛋白质类稳定剂或者糖类稳定剂中一种或几种混合物，所述蛋白质类稳定剂为BSA、HGG、HAS中一种或几种，所述糖类稳定剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一种或几种。
[0031]作为一种优选，所述蛋白酶抑制剂为EDTA、抑肽酶、PMSF中的一种或几种。
[0032]作为一种优选，所述抗氧化剂为硫代二丙酸、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚中的一种或几种。
[0033]作为一种优选，所述抗氧化增效剂为柠檬酸、乳酸钠、EDTA中的一种。
[0034]作为一种优选，所述防腐剂为叠氮盐类或proclin系列防腐剂，其中叠氮盐类防腐剂主要为NaN3, proclin系列防腐剂主要为Proclin300。
[0035]作为一种优选，本发明公开的稳定的液体脂类校准品主要包括以下组分:
[0036]
HHPHS (缓冲液，pH7-8)20-2()0mmol/+l.人血沾(:稳定剂)1-5% (w/v)
人Y球蛋丨1I (稳定剂)1-5?) (w/v )
SaC I (电解质)I O-200mn1 I / L
乳酸钠(抗氧化增效剂)5-1 OOmmo I /1.海藻糖(稳定剂)10-1OOgZL
叠||1钠(防腐剂)0.09% (w/v)
硫代-.....:内酸(抗氣化剂)5-1 OOmmo I / L
没食了酸丙Si (抗氧化剂)0,02-1.0mmol/!.EDTA C 蛋 P Si 抑制剂)0.1 /I
抑肽隱(蛋Ι.Η _抑制剂)1-25mg/1.载脂蛋 ? A-12.0-3.0g/L
载脂蛋 H B2-2,5g/U
[0037]实施例1
[0038](I)不同稳定剂对校准品稳定性的影响
[0039]按以下配方配制含有待测目标物载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的血清基质液，在此基质内添加不同浓度的稳定剂，在37°C水浴中放置16小时，分别在水浴前后，应用瑞源公司在售载脂蛋白A-1与载脂蛋白B检测试剂盒(免疫比浊法)及其校准品，按各自说明书检测血清基质液中的ApoA-1和ApoB含量，根据水浴前后测定含量的变化考察稳定性，分析添加的不同稳定剂的效果。表I中4种添加剂均能提高血清基质中ApoA-1和ApoB的稳定性，且与各稳定剂浓度呈正相关。
[0040]含有ApoA-1与ApoB的血清基质液:ρΗ7.4
[0041]
绥冲液〗(Μ)ι_?Ι/?,
人血沾 ? I ill -- (I luin1-m S<%rum Λ i biimi η, I ISA)2.5% (w/v )
人 Y 球?Κ-- (I in man gamin<i globulin, IKSG)2, 5% (w/v )
鼠”50i 腿
乳酸蚋lOinmol / I,
海藻糖20g/l,
Proclin 3000.05% (w/v)
[0042]
载脂蛋 0 A-12.5g/L
载脂蛋N B2.0g/1.
[0043]表I不同添加剂对ApoA-1和ApoB在37°C稳定性的影响
[0044]
ApoA-1含量ApoB含量添加物 ft度水浴前I水浴后—^Ll她率水前水浴后 N收率_____(g/L) [ (g/L) (%) (g/L) (g/L) (?): ______________2'j53______________________________2_.__02_______________ ——79_._8________________ ^^97...............................1"；51 _______________76,_5_______________
硫代.'.W酸 5 2.48 2.02 ' 61.3.98 1.；T1 ^ 76.4
(inmo 1/L) 25~ 2:.:15.................2......15...............'.............87.7...............................................1:98...............................?.'70^...............85:8
(inmol/U 0.厂 2.16 2.27 — 92.1 1.91 1.86^ 96.1
EDTA(,ol/L)2.46 L984^
0.5 2.47 2.08 84.1 1.95 1.66 84.9
TZTIZ^:,、 I — 2.49 I 2.01 ^80.8 1.98^ 1.72 画 86.7jlHA_lmg/U 丨 5 2.,t6 I 2, U) 85,4 L 95 1.74 89.3
(2)本发明脂类校准品配制与标定
[0045]该脂类校准品为含有高值载脂蛋白A-1与载脂蛋白B的复合校准品，配方如下:
[0046]
\10PS 缓冲液(ρΗ7.0)lOOmml/L
人血沾广丨叛㈧(Hunan Seruii Alburain, USA) 2, 5% (w/v)
人 Y 球--? (llnmm gaiaiia globulin, HGG)2.δ% (w/v)
XaC I5()mmol/l,
乳酸钠I Ommo I/L
海藻糖20g/丨.flM 钠0.09% (w/v)
硫代.25mmo 1:1.没食子酸内0.lmn1l/1,
ΗΙ)ΤΛ0,5mmol/L
挪肽_5mg/L
载斷蛋 Ι?Λ?!2, Dg/L
载詣蛋Ι? B2.3g/L
[0047]用Roche校准品配合公司在售载脂蛋白A-1和载脂蛋白B检测试剂(免疫比浊法)测定复合校准品中的载脂蛋白A-1和载脂蛋白B含量，每个测定10次，以平均值作为该校准品的标示值。最终标定此脂类校准品中载脂蛋白A-1的标示值为2.54g/L，载脂蛋白B的表示值为2.33g/L
[0048]表2脂类复合校准品中载脂蛋白A-1和载脂蛋白B含量标定
[0049]
测定次数 ApoA-1 (g/L) ApoB (g/L)
?2.572.28
22.552.30
32.532.35
42?522?36
52.552?32
62.572.35
72?562?32
82?522.35
92?512.35
102.552.35
平均值~ 2.542.33

STDEV 0.02160.0267

【权利要求】
1.一种稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述稳定的液体脂类校准品包括: 缓冲液20-200mmol/L 蛋白质类稳定剂2-10% (w/v)
电解质 NaCl10-200mmol/L 抗氧化增效剂5-100mmol/L 糖类稳定剂10-100g/L 防腐剂0.09% (w/v) 抗氧化剂0.02-100mmol/L 蛋白酶抑制剂0.l-5mmol/L
载脂蛋白 A-12.0-3.0g/L 载脂蛋白B2-2.5g/L。
2.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、Tris缓冲液、GOOD’ S缓冲液、PB缓冲液中的一种，并且缓冲液的酸碱度为PH=7_8。
3.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述稳定剂包括蛋白质类稳定剂或者糖类稳定剂中一种或几种混合物，所述蛋白质类稳定剂为BSA、HAS、人Y球蛋白中一种或几种，所述糖类稳定剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中一种或几种。
4.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为EDTA、抑肽酶、PMSF中的一种。
5.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述抗氧化剂为硫代二丙酸、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述抗氧化增效剂为柠檬酸、乳酸钠、EDTA中的一种。
7.根据权利要求1所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，所述防腐剂为叠氮盐类或proclin系列防腐剂,其中叠氮盐类防腐剂主要为NaN3, proclin系列防腐剂主要为Proclin300o
8.根据权利要求1至7所述的稳定的液体脂类校准品，其特征在于，主要包括以下组分:
HEPES (缓冲液，pH7-8)20-200mmol/L 人血清白蛋白(稳定剂)1-5% (w/v) 人Y球蛋白(稳定剂)1-5% (w/v) NaCl (电解质)10-200mmol/L
乳酸钠(抗氧化增效剂)5-100mmol/L 海藻糖(稳定剂)10-100g/L 叠氮钠(防腐剂)0.09% (w/v)
硫代二丙酸(抗氧化剂)5-100mmol/L
没食子酸丙酯(抗氧化剂)0.02-1.0mmoI/L
EDTA (蛋白酶抑制剂)0.l-5mmol/L 抑肽酶(蛋白酶抑制剂)l-25mg/L载脂蛋白 A-12.0-3.0g/L载脂蛋白B2-2.5g/L。
【文档编号】G01N33/68GK104198733SQ201410431757
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】陈媛, 张闻, 周海滨, 王建飞 申请人:宁波瑞源生物科技有限公司