一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器，以[email protected]磁性纳米颗粒和双功能化金纳米颗粒作为固相载体，活化的羧基化[email protected]磁性纳米颗粒与氨基修饰的核酸适体结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物，再与双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物，最后与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶结合，得到所述传感器。本发明还公开了其制备方法和应用。该核酸适体传感器具有磁性便于快速磁分离，又具有化学发光法快速、高效检测的优点，在生物医学检测方面具有很大的应用价值。
【专利说明】一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸适体传感器【技术领域】，特别是一种以纳米颗粒为固相载体和化学发光法为检测手段的核酸适体传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]磁性纳米颗粒具有分离速度快、效率高、操作简单、易实现功能化、易实现自动化及不影响分离物质的活性等优越的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离分选，生物大分子的分离、纯化和检测，靶向诊断与治疗等诸多领域。其中，以磁性纳米颗粒进行生物大分子检测主要是通过在其表面修饰上特异性的探针或抗体后即可利用它们对目标靶分子进行特异性的检测。
[0003]金纳米颗粒是纳米材料领域研究的热点，具有小尺寸效应、表面效应、量子效应和良好的生物相容性，在纳米电子学、纳米涂层材料、纳米催化、分子识别和生物标记等领域有着巨大的潜在应用价值。
[0004]核酸适体传感器是以核酸适体作为生物识别分子的生物传感器。与抗体相比，核酸适体具有体外合成、特异性高、结合力强、稳定性好、易于修饰等优点，构建基于核酸适体的生物传感器具有广阔的应用前景。将核酸适体与不同的方法或仪器结合，可形成不同的核酸适体传感器，如电化学核酸适体传感器、突光核酸适体传感器、化学发光核酸适体传感器、表面等离子体共振核酸适体传感器等。现有化学发光核酸适体传感器分离操作比较繁琐，而且不便于化学发光信号的放大，导致检测速度和灵敏度受到一定的影响。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器，以纳米颗粒为固相载体和化学发光法作为检测手段，便于快速磁分离，又具有化学发光法快速、高效检测的优点，本发明还公开了其制备方法和应用。
[0006]本发明采用以下技术方案:
[0007]一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器，以Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒和双功能化金纳米颗粒作为固相载体，所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒与氨基修饰的核酸适体结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物，然后再与双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物，最后与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶结合，得到所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒是经过羧基化并活化；所述双功能化金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列。
[0008]上述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，包括如下步骤:
[0009]步骤一、制备Fe3O4磁性纳米颗粒,在所述Fe3O4磁性纳米颗粒表面包覆一层娃壳，得到Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，再对Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面羧基化修饰，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，之后进行羧基活化，得到活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒;
[0010]步骤二、制备金纳米颗粒，在所述金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列，得到双功能化金纳米颗粒；
[0011]步骤三、氨基修饰的核酸适体与步骤一制备的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物；
[0012]步骤四、将步骤三制备的磁性纳米颗粒-核酸适体复合物与步骤二制备的双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物；
[0013]步骤五、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶与步骤四制备的磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物结合，得到所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器。
[0014]步骤一所述Fe3O4磁性纳米颗粒采用软模板法制备,所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒经种子聚合法和经典StOber法制备；所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面羧基化修饰是先将Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面氨基化，再利用丁二酸酐进行表面羧基化修饰；所述羧基活化为碳化二亚胺一步法活化羧基。
[0015]步骤二所述金纳米颗粒采用柠檬酸钠还原法制备。
[0016]步骤四所述杂交条件为37 V杂交45min。
[0017]上述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量分析中的应用。
[0018]上述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量分析中的应用方法，包括如下步骤:在所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器中加入待测靶分子，待测靶分子与核酸适体特异结合，将连接链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的双功能化金纳米颗粒替换下来；之后磁分离，在上清液中加入化学发光底物，进行化学发光信号检测。
[0019]所述化学发光底物为AMPro。
[0020]本发明的有益效果:
[0021]1、本发明以纳米颗粒作为固相载体，将核酸适体固定在磁性纳米颗粒表面，利用其磁性便于快速磁分离，将催化化学发光的碱性磷酸酶固定在双功能化金纳米颗粒表面，有利于化学发光信号放大，同时可避免Fe3O4颗粒对化学发光的遮蔽性。
[0022]2、本发明以化学发光法作为检测手段，具有快速、高效、灵敏度高的优点，并且采用碱性磷酸酶催化的AMPro化学发光体系，具有背景低、发光时间长的特点，因此具有广阔的应用前景。
[0023]3、本发明的适用范围广，通过改变使用不同的核酸适体及在双功能化金纳米颗粒表面修饰与相应核酸适体部分互补的DNA序列，可实现对不同靶分子进行检测及定量分析。
【专利附图】

【附图说明】[0024]图1是实施例1制备的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒的透射电镜图。
[0025]图2是实施例2制备的金纳米颗粒透射电镜图。
[0026]图3是基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器构建原理图。
[0027]图4是实施例4凝血酶浓度与化学发光强度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。以下特定的实施例旨在更详细地描述本发明。这些实施例的目的在于解释本发明，而不应理解为限定本发明的范围。
[0029]在外磁场作用下磁性纳米颗粒表现出良好的磁响应性，可方便地将微粒与介质分离开来；当撤去外加磁场后，磁性纳米颗粒又可重新悬浮于液相介质中而不聚集。因此使用磁性纳米颗粒作为载体可实现快速分离而又不影响其特性。金纳米颗粒可简单、方便地与巯基修饰的配体通过金硫键共价结合，也是一种良好的纳米载体。
[0030]一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器，以Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒和双功能化金纳米颗粒作为固相载体，所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒与氨基修饰的核酸适体结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物，然后再与双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物，最后与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶结合，得到所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒是经过羧基化并活化；所述双功能化金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列。
[0031]上述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，以磁性纳米颗粒和金纳米颗粒作为固相载体，以化学发光法作为检测手段，包括如下步骤:
[0032]步骤一、采用软模板法制备粒径在500nm左右的Fe3O4磁性纳米颗粒，经种子聚合
法和经典StOber法在其表面包覆一层硅壳，制备粒径在550nm左右的Fe3O4OSiO2磁性纳米
颗粒，再对其表面进行羧基化修饰，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，保存于无水乙醇中。羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒在使用前需要进行羧基活化。
[0033]所述Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法包括共沉淀法，溶剂热法，软模板法，微乳液法，热分解法等物理或化学方法。这些方法都可以用于本发明Fe3O4磁性纳米颗粒的制备，所列举的制备方法只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。
[0034]所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面羧基化修饰是先将Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面氨基化，再利用丁二酸酐进行表面羧基化修饰。
[0035]所述羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒的羧基活化包括碳化二亚胺(EDC) —步法活化和EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)两步法活化。以下实施例采用的是EDC —步法活化。
[0036]步骤二、采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，再将金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列，得到双功能化金纳米颗粒。
[0037]所述金纳米颗粒的制备方法包括真空蒸镀法、激光消融法、柠檬酸钠还原法、硼氢化钠还原法、反胶束法、喷雾热解法等。这些方法都可以用于本发明金纳米颗粒的制备，所列举的制备方法只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。[0038]步骤三、氨基修饰的核酸适体与步骤一制备的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物；
[0039]步骤四、将步骤三制备的磁性纳米颗粒-核酸适体复合物与步骤二制备的双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物。
[0040]所述的杂交条件为37 V杂交45min。
[0041]步骤五、催化化学发光的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶与步骤四制备的磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物结合，得到所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器。
[0042]上述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量分析中的应用方法，包括如下步骤:在所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器中加入待测靶分子，待测靶分子与核酸适体特异结合，将连接链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的双功能化金纳米颗粒替换下来；之后磁分离，在上清液中加入化学发光底物AMPPD，利用碱性磷酸酶催化AMPH)化学发光体系进行化学发光信号检测。
[0043]所述化学发光体系常见的有鲁米诺化学发光体系、酸性高锰酸钾化学发光体系、光泽精化学发光体系、AMPro化学发光体系、过氧草酸酯化学发光体系等。所列举的化学发光体系只是举例说明本发明，不能以任何方式限制本发明的范围。
[0044]以下实施例选用凝血酶的核酸适体并对其进行氨基修饰(以下简称序列1)，其序列如 SEQ ID N0.1 所示(3，-NH2 修饰):5’ -AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-NH2-3’。与序列I部分互补的巯基修饰的DNA序列(以下简称序列2)，其序列如SEQ ID N0.2所示(3’ -SH修饰):5’ -CTACCACGGACTGATCTCTAG-SH-3’。巯基与生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列(以下简称序列3)，其序列为:5’-Biotin-TCGCAGTGT-SH-3’。
[0045]实施例1活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒的制备
[0046]Fe3O4磁性纳米颗粒采用软模板法制备，Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒采用种子聚合法和经典StOber法制备；具体制备过程参照发明申请CN102568728A实施例1进行。所制备的
颗粒具有大小均一、分散性好的特点；然后对其表面进行羧基化修饰。
[0047]具体实验过程如下所述。
[0048](I)、首先采用软模板法制备粒径在500nm左右的Fe3O4磁性纳米颗粒，再经种子聚合法和经典SlObcr法在其表面包覆一层硅壳，制备粒径在550nm左右的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒。图1给出了 Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒的透射电镜图，可以看出颗粒呈球形、大小均匀，内层黑色区域为Fe3O4核而外层灰色区域为SiO2壳，该颗粒具有较好的分散性，粒径约为 550nmo
[0049](2)、Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面氨基化。取上述5mL浓度为10mg/mL的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，磁分离弃掉上清液后,加入20mL无水乙醇/水(体积比19.9/0.1)混合溶液，超声30min ;再加入40 μ L3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在室温下混合振荡5h ；然后，利用外加磁场将APETS修饰的磁性纳米颗粒从反应介质中分离出来，并用无水乙醇对其清洗5次；最后将表面氨基化修饰的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒分散在20mL N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，保存备用。
[0050](3)、[email protected]磁性纳米颗粒表面羧基化修饰。将上述20mL分散在DMF中的氨基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒逐滴加入20mL DMF溶解的0.lmol/L 丁二酸酐(SA)溶液中，在室温下混合振荡24h。用双蒸水清洗数次，获得羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，并保存备用。
[0051](4)、EDC —步法活化羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒
[0052]用25mmol/L pH5的2_ (N-吗啉)-乙磺酸一水合物(MES)缓冲液在外加磁场作用下清洗上述羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒2次，使羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒分散于5mL MES缓冲液中。
[0053]临用前用保存于4°C的25mmol/L pH5的MES溶液配制10mg/mL的EDC溶液，取上述分散于MES中的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒lmL，加入IOOyL EDC溶液，在37°C缓慢震摇30min。
[0054]在磁场作用下弃去上清液，用25mmol/L pH5的MES缓冲液清洗3次，洗去未参与活化反应的EDC，获得活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，并保存于IOmL MES缓冲液中。
[0055]实施例2双功能化金纳米颗粒的制备
[0056]首先采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，再将金纳米颗粒与两种不同的巯基修饰的DNA结合,制备双功能化金纳米颗粒。
[0057]具体实验过程如下所述。
[0058](I)、采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒。带冷凝管的烧瓶内先加入48ml双蒸水，再加入2mllwt%的HAuCl4.3H20溶液，剧烈搅拌下加热至沸腾，搅拌转速750r/min ;沸腾5min后，快速加入5ml38.8mmol/L的柠檬酸钠溶液；变色后继续回流15min，然后移走加热设备，自然冷却至室温，4°C贮存。图2给出了金纳米颗粒透射电镜图，可以看出颗粒呈球形，大小均匀，分散性好，粒径在15nm左右。
[0059](2)、10 μ LI μ mol/L 的序列 2 与 200 μ LI μ mol/L 的序列 3，加入 20μ L30mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，37°C缓慢震摇活化Ih ;然后加入0.5mL上述制备的金纳米颗粒，37°C缓慢震摇2h ;最后13000rpm离心30min，红色油状沉淀物溶解在0.2mL双蒸水中，得到双功能化金纳米颗粒。
[0060]实施例3基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的构建
[0061](1)、0.1nmol序列I与lmLlmg/mL的已活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，37°C缓慢震摇lh，用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，最后溶解在0.5mL双蒸水中，得到磁性纳米颗粒-核酸适体复合物。
[0062](2),0.5mL上述磁性纳米颗粒-核酸适体复合物与0.2mL实施例2制备的双功能化金纳米颗粒在37 V杂交45min，用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，得到磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物，溶解在0.5mL双蒸水中。
[0063](3)、0.5mL上述磁性纳米颗粒_核酸适体_双功能化金纳米颗粒复合物与100 μ L1: 3000稀释的lmg/mL的链霉亲和素标记的碱性磷酸酶溶液，37°C缓慢震摇1.5h，用
0.01mol/L pH7.4的PBS溶液清洗3次，最后溶解在0.6mL双蒸水中，构建具有催化化学发光性能的核酸适体传感器。图3给出了基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器构建原理图。
[0064]实施例4利用所制备的核酸适体传感器检测凝血酶
[0065]实施例3构建的用于检测凝血酶的核酸适体传感器，每管取200 μ L，磁分离弃掉上清液后加入不同浓度的凝血酶各300 μ L，37°C缓慢震摇lOmin，使凝血酶与核酸适体特异结合从而替换出结合有碱性磷酸酶的双功能化金纳米颗粒；磁分离后，取上清液50 μ L，加入150 μ L0.25mmol/L的AMPH)溶液，测定化学发光强度。图4给出了不同浓度凝血酶与化学发光强度的线性关系图，从图中可以看出，在I?lOOng/mL范围内两者之间具有良好的线性关系。
【权利要求】
1.一种基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器，其特征在于，以Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒和双功能化金纳米颗粒作为固相载体，所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒与氨基修饰的核酸适体结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物，然后再与双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物，最后与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶结合，得到所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器；所述的Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒是经过羧基化并活化；所述双功能化金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列。
2.权利要求1所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、制备Fe3O4磁性纳米颗粒,在所述Fe3O4磁性纳米颗粒表面包覆一层娃壳,得到Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，再对Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面羧基化修饰，得到羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒，之后进行羧基活化,得到活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒; 步骤二、制备金纳米颗粒，在所述金纳米颗粒表面修饰两种DNA序列，一种是巯基修饰的与核酸适体部分互补的DNA序列，另一种是巯基和生物素双修饰的与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶特异结合的DNA序列,得到双功能化金纳米颗粒； 步骤三、氨基修饰的核酸适体与步骤一制备的活化的羧基化Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒结合形成磁性纳米颗粒-核酸适体复合物； 步骤四、将步骤三制备的磁性纳米颗粒-核酸适体复合物与步骤二制备的双功能化金纳米颗粒杂交形成磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物； 步骤五、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶与步骤四制备的磁性纳米颗粒-核酸适体-双功能化金纳米颗粒复合物结合，得到所`述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器。
3.根据权利要求2所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤一所述Fe3O4磁性纳米颗粒采用软模板法制备,所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒经种子聚合法和经典St0bcr法制备；所述Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面羧基化修饰是先将Fe3O4OSiO2磁性纳米颗粒表面氨基化，再利用丁二酸酐进行表面羧基化修饰；所述羧基活化为碳化二亚胺一步法活化羧基。
4.根据权利要求2所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤二所述金纳米颗粒采用柠檬酸钠还原法制备。
5.根据权利要求2所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤四所述杂交条件为37V杂交45min。
6.权利要求1所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量分析中的应用。
7.—种权利要求1所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量分析中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤:在所述基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器中加入待测靶分子，待测靶分子与核酸适体特异结合，将连接链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的双功能化金纳米颗粒替换下来；之后磁分离，在上清液中加入化学发光底物，进行化学发光信号检测。
8.根据权利要求7所述的基于纳米颗粒和化学发光的核酸适体传感器在待测靶分子定性和定量 分析中的应用方法，其特征在于，所述化学发光底物为AMPH)。
【文档编号】G01N21/76GK103743722SQ201410001112
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】何农跃, 习志江 申请人:东南大学