专利名称：一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，属于分子信标检测技术领域。
背景技术：
传统的分子信标是在发夹结构信标分子两端同时标记小分子，如德克萨斯红(Texas Red)、突光素(Fluoresein)等作突光基团,4_(4’ - 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)等作猝灭基团。自由状态时，这两类分子靠近(约为疒10 nm)，发生荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光被猝灭分子吸收。当检测体系中加入与信标分子碱基相互作用的待测样品(互补的单链DNA/RNA，与信标环适配体区域特异性作用的分子等)后，形成杂交体，信标茎杆互补区被拉开，荧光基团与猝灭基团的距离增大，荧光得到回升。通过检测荧光信号的响应则可对待测样品的含量进行测定。这类分子信标从操作难以程度上来说，可以克服生物分子检测中异相分析手段(如酶联免疫法、化学发光免疫、放射性免疫等)需要洗涤分离的缺点，但是在信标茎两端分别标记两种基团，一般费时费力，价格昂贵。就已有报道的单标记分子信标体系而言，具有石墨结构的碳材料，如石墨烯/氧化石墨烯、碳纳米管、C60、C70等，由于其所富含的π电子，使之能与分子信标单链DNA上的碱基中芳环结构所赋予的η电子进行η — η堆积，以非共价键结合在一起，因此只需对信标一端进行荧光基团的单标记。但是上述碳材料都较难以制备，多需要购买特殊的制备原料或使用较为复杂的实验条件，制备周期长，成本也不够低；且制备过程或分散过程均要使用有机溶剂，这样会大大降低材料的生物相容性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题为克服现有技术的不足，提供一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法。本发明为解决上述技术问题提供的技术方案为:一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，以碳纳米颗粒为荧光受体，包括以下步骤:
一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，以碳纳米颗粒为荧光受体，其特征在于:包括以下步骤:
I)配制两组体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶
液；
2)向第一组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中加入体积不同浓度相同的碳纳米颗粒溶液，得到体积不同的系列混合标准溶液；向每个混合标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合标准溶液的体积相同，孵育3(T60 min ;然后对每个混合标准溶液进行荧光检测，得到荧光猝灭效率最大时所需的碳纳米颗粒溶液的体积；
3)以第二组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中的一个标准溶液作为空白溶液不加入待测样品，其余的标准溶液分别加入相同浓度不同体积的待测样品，得到体积不同的系列混合待测样品标准溶液；然后向每个混合待测样品标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育2(T120 min ;向每个混合待测样品标准溶液中加入与步骤2 )中荧光猝灭效率最大时相同体积的碳纳米颗粒溶液，得到系列样品标准溶液，孵育3(T60 min，测定每个样品标准溶液的荧光强度，空白溶液的荧光强度为F0，对每个样品标准溶液的荧光强度与空白溶液的荧光强度H)的比值和待测样品的浓度进行标准曲线的绘制；
4)向未知浓度的待测样品中加入与步骤3)中体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液并补加缓冲溶液，得到混合待测样品溶液，使该混合待测样品溶液与步骤3)中每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育2(Tl20min ;加入与步骤3)中相同体积的碳纳米颗粒溶液，孵育3(T60min后，测定溶液的荧光强度，计算其与步骤3)中空白溶液荧光强度H)的比值，通过标准曲线得到该待测样品的浓度。所述碳纳米颗粒包括十二烧基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒或水溶性氧化碳纳米颗粒；所述荧光基团包括有机染料或荧光纳米颗粒。所述能够与一端标记过荧光基团的核酸信标发生特异性相互作用的物质包括单链核酸或三磷酸腺苷。
本发明涉及到碳纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下:
(I)十二烷基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒的制备:点燃日用照明蜡烛(普通蜡烛)，用洁净玻璃片在蜡烛火焰外焰上来回移动， 收集黑色蜡烛灰8 mg，置于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，10 mL超纯水。将混合溶液放置在超声仪中，功率360W，超声2.5 h。所得的黑色溶液以3000 rpm离心2 min,上清液以6000 rpm离心6 min,得黑色沉淀。真空干燥后，称取3 mg溶于30 mL 0.02% (wt)的十二烧基苯磺酸钠水溶液中超声分散备用。(2)水溶性氧化碳纳米颗粒的制备:将按(I)中方法得到的8 mg新鲜蜡烛灰置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL，6 mol/L的硝酸溶液，于115°C冷凝回流10 h。溶液冷却至室温后用碳酸钠固体调节溶液pH至中性，于12000 rpm离心20 min，得到黑色沉淀用超纯水洗涤三次。于真空干燥箱中干燥。使用前用超纯水配成一定浓度的溶液，超声分散备用。本发明方法构建了一个“荧光基团-信标链-碳纳米颗粒”的生物分子检测平台，即将信标链一端标记上荧光供体材料(有机染料、荧光纳米材料等)后，向体系中直接加入碳纳米颗粒(十二烧基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒、水溶性氧化碳纳米颗粒等)，则在激发光的照射下，荧光团发出的荧光被碳纳米颗粒吸收，荧光被猝灭。向体系中加入不同浓度的待测样品，信标环与之发生碱基互补配对作用拉开荧光供体材料与碳纳米颗粒的距离，荧光得以恢复；通过绘制标准曲线，得到待测样品的浓度。
与现有技术相比，本发明所述的基于碳纳米颗粒的纳米信标检测平台有如下优点:
1.与传统分子信标相比，此单标记体系的构建操作简便，只需对信标链一端标记上荧光基团。2.与使用其他碳材料作荧光受体的体系相比，碳纳米颗粒的制备简化了受体材料的制备难度，无需购买昂贵的原料，材料的生物相容性得以提高，可高效、灵敏、迅速、低成本地对生物分子进行检测。


图1为实施例1中的荧光检测情况，其中，图1A为本实施例的信标链TAMRA-SSDNA和体系的荧光检测情况；图1B为本实施例的目标DNA和体系的荧光检测情况。图2为实施例2中荧光检测情况，其中，图2A为本实施例的信标链ssDNA和体系的荧光检测情况；图2B为本实施例的目标DNA和体系的荧光检测情况。图3为实施例3中的荧光检测情况，其中，图3A为本实施例的信标链ssDNA和体系的荧光检测情况；图3B为本实施例加入三磷酸腺苷的荧光检测情况。图4为实施例1和2中所使用的碳纳米颗粒的表征数据图，其中，4A为透射电镜图；4B为X射线粉末衍射图；4C为Raman谱图；4D为UV-Vis图；4E为FT-1R图。图5为实施例3中所使用的氧化碳纳米颗粒的表征数据图，其中，5A为透射电镜图；5B为X射线粉末衍射图；5C为Raman谱图；为UV-Vis图；5E为FT-1R图。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1
取 3 μ M 四甲基罗丹明-单链 DNA (TAMRA-ssDNA) Tris-HCl (10 mM，pH 为 7.4，含0.15 M的NaCl,下同)溶液6 μ L,分别加入不同体积的0.1 mg/mL十二烧基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒溶液(SDBS-CNPs))，补加Tris-HCl定容到600 μ L，使SDBS-CNPs浓度为0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055 mg/mL，37°C孵育 I h 后检测下转换荧光。配制一系列含不同浓度目标DNA的Tris-HCl溶液(0，0.5，I, 5，10，30，50 和 100 nM)，42°C孵育 2 h 后，加入 SDBS-CNPs 溶液使之浓度为 0.055 mg/mL。37°C孵育40 min,检测下转换突光，对目标DNA的浓度和样品突光强度与不含目标DNA样品的突光强度的比值作图。对于未知浓度的样品，向其中加入6 UL, 3 μ M TAMRA-ssDNA溶液，补加Tris-HCl定容至Ij 600 μ L，42°C孵育2 h后，加入SDBS-CNPs溶液，补加Tris-HCl定容至Ij600 μ L，使SDBS-CNPs浓度为0.055 mg/mL，37°C孵育40 min，测定溶液的荧光强度，计算其与不含目标DNA的样品荧光强度H)的比值，在标准曲线上得到未知样品中目标DNA的浓度。图1A表明所选用的荧光受体碳纳米颗粒可以有效猝灭有机染料TAMRA的荧光；图1B表明基于本发明方法所构建的纳米信标，能够对一定浓度范围内的单链目标DNA有所响应。IB中被指出的点为未知目标DNA浓度的样品，从F/R)的值可得到目标DNA浓度为22nMo如图1所示。实施例2
Cl)上转换荧光纳米颗粒(UCPs)的制备:取2 ml 0.25 mo I/L的稀土硝酸盐溶液(其中稀土离子摩尔比为钇离子:镱离子:铒离子=80:18:2，向其中加入18 ml无水乙醇，再加入含900 mg聚丙烯酸的水溶液8 ml,搅拌10 min ;向上述混合溶液中加入含0.210 g氟化钠的水溶液8 ml，继续搅拌20 min后，置于高压反应釜中，在搅拌条件下于200°C水热反应10 h ;停止加热并保持搅拌冷却至室温，离心分离出固体产物，用无水乙醇和超纯水各洗3次，室温下真空干燥12 h，得到表面带有羧基的上转换荧光纳米颗粒。
(2) UCPs的表面标记:5 mg上步制得的上转换纳米颗粒溶于2 mL 10 mM，pH为
5.5的MES缓冲液，置于30°C，转速为150 rpm恒温振荡器中依次滴加2 mM (含0.76 mg)EDC.HCl,5 mM (含 2.2 mg) SuIfo-NHS，孵育 2 h。反应后的溶液于 9000 rpm 离心 6 min,用高纯水洗涤二次，加入溶含2.5 M信标DNA的2 mL 10 mM, pH为7.2的HEPES溶液，以同样条件孵育4 h后,9000 rpm离心6 min,高纯水洗漆三次,溶于Tris-HCl (10 mM,含0.15MNaCl，pH为7.4)缓冲中，，4°C保存备用。(3)将0.03 mg/mL标记后的信标DNA-上转换荧光纳米颗粒(信标DNA-UCPs)复合物与含不同浓度的 SDBS-CNPs (O, 0.01, 0.02, 0.03, 0.035, 0.04 和 0.05 mg/mL)Tris-HCl溶液600 yL，25°C孵育40 min，使用980 nm激发光检测上转换荧光。向含0.03mg/mL信标DNA-UCPs，0.045 mg/mL SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液中加入不同浓度的目标DNA (O, 0.1, 0.5, I, 5，10, 30,和 50 nM)，42°C孵育 20 min，使用 980 nm激发光检测上转换荧光，计算加入了目标DNA的样品荧光强度F与不含目标DNA的样品荧光强度H)的比值，以目标DNA浓度对F/R)的比值作图得到标准曲线。对于未知浓度的样品，加入信标DNA-UCPs, SDBS-CNPs 的 Tris-HCl 溶液，补加 Tris-HCl 溶液至 600 μ L,使信标 DNA-UCPs、SDBS-CNPs浓度分别为0.03 mg/mL,0.045 mg/mL，42°C孵育20 min后，测定溶液的荧光强度，计算其与不含目标DNA的样品荧光强度H)的比值，在标准曲线上得到未知样品中目标DNA的浓度。图2A表明所选用的荧光受体碳纳米颗粒可以有效猝灭上转换纳米材料的荧光；图2B表明基于本发明方法所构建的纳米信标，能够对一定浓度范围内的单链目标DNA有所响应；2B中被圈出的点为未知浓度的目标DNA样品，从F/R)的值可得到目标DNA浓度为17nMo如图2所示。从实施例1和实施例2中的碳纳米颗粒的表征数据可以看出:图4A经测量统计，所使用的碳纳米颗粒平均粒径为42 nm ;图4B、图4C说明碳纳米颗粒具有石墨碳的结构特征；图4D表明碳纳米颗粒具有很宽的吸收谱带，可用于与许多荧光供体发生荧光共振能量转移效应。如图4所示。实施例3
取30 μ L 0.6 mg/mL标记过信标DNA的UCPs Tris-HCl溶液(UCPs的合成及标记方法与实施例2中的相同)，加入不同量的氧化碳纳米颗粒(CNPs oxide)水溶液，定容到600 UL0 30°C孵育90 min后，使用980 nm激发光检测上转换荧光。向含0.03 mg/mL的信标DNA-UCPs、0.04 mg/mL CNPs oxide的Tris-HCl溶液中加入不同量的三磷酸腺苷(ΑΤΡ)，30°C孵育90 min后用980 nm激发光测量上转换荧光，计算加入了 ATP的样品荧光强度F与不含ATP的样品荧光强度H)的比值，以ATP浓度对F/R)的比值作图得到标准曲线。对于未知浓度的样品，向其中加入信标DNA-UCPs溶液、CNPs oxide水溶液补加Tris-HCl定容到 600 μ L，使信标 DNA-UCPs、CNPs oxide 的浓度分别为 0.03 mg/mL,0.04 mg/mL, 30°C孵育90 min后用980 nm激发光测量上转换荧光强度，计算其与不含ATP的样品荧光强度FO的比值，在标准曲线上得到未知样品中ATP的浓度。图3A表明所选用的荧光受体氧化碳纳米颗粒可以在一定程度上猝灭上转换纳米材料的荧光；图3B表明基于本发明方法所构建的纳米信标，能够对一定浓度范围内的ATP产生线性响应；3B中被圈出的点为未知浓度的ATP样品，从F/R)的值可得到ATP浓度为140μ Mo如图3所示。从实施例3中的碳纳米颗粒的表征数据可以看出:图5Α经测量统计，所使用的氧化碳纳米颗粒平均粒径为36 nm ;图5B说明氧化碳纳米颗粒具有很宽的吸收谱带，可用于与许多荧光供体发生荧光共振能量转移效应；图5C、图表明氧化碳纳米颗粒也具有石墨碳的结构特征，并且较图4B而言XRD谱图的衍射峰向小角度的位移、较图4C而言Raman谱图上的ID/Ie值的减小都进一步说明了碳纳米颗粒被部分氧化；图5E中FT-1R谱图与图4E相比，1394 cm-1的吸收证明了经硝酸氧化后碳纳米颗粒表面羧基的存在。
权利要求
1.一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，以碳纳米颗粒为荧光受体，其特征在于:包括以下步骤: I)配制两组体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液； 2)向第一组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中加入体积不同浓度相同的碳纳米颗粒溶液，得到体积不同的系列混合标准溶液；向每个混合标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合标准溶液的体积相同，孵育3(T60 min ;然后对每个混合标准溶液进行荧光检测，得到荧光猝灭效率最大时所需的碳纳米颗粒溶液的体积； 3)以第二组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中的一个标准溶液作为空白溶液不加入待测样品，其余的标准溶液分别加入相同浓度不同体积的待测样品，得到体积不同的系列混合待测样品标准溶液；然后向每个混合待测样品标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育2(T120 min ;向每个混合待测样品标准溶液中加入与步骤2 )中荧光猝灭效率最大时相同体积的碳纳米颗粒溶液，得到系列样品标准溶液，孵育3(T60 min,测定每个样品标准溶液的荧光强度，空白溶液的荧光强度为F0，对每个样品标准溶液的荧光强度与空白溶液的荧光强度H)的比值和待测样品的浓度进行标准曲线的绘制； 4)向未知浓度的待测样品中加入与步骤3)中体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液并补加缓冲溶液，得到混合待测样品溶液，使该混合待测样品溶液与步骤3)中每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育2(Tl20min ;加入与步骤3)中相同体积的碳纳米颗粒溶液，孵育3(T60min后，测定溶液的荧光强度，计算其与步骤3)中空白溶液荧光强度H)的比值，通过标准曲线得到该待测样品的浓度。
2.根据权利要求1中所述的一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，其特征在于:所述碳纳米颗粒包括十二烷基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒或水溶性氧化碳纳米颗粒；所述荧光基团包括有机染料或荧光纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，其特征在于:所述能够与一端标记过荧光基团的核酸信标发生特异性相互作用的物质包括单链核酸或三磷酸腺苷。
全文摘要
本发明公开了一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，包括以下步骤向一定浓度的一端标记荧光基团的核酸信标溶液中加入不同浓度的碳纳米颗粒溶液，孵育后，室温下测定荧光强度，得到猝灭曲线;若干组含一定浓度一端标记过荧光基团的核酸信标溶液中，加入不同浓度的目标物，孵育后，加入一定体积的碳纳米颗粒溶液，孵育后，室温下测定荧光强度，作标准曲线，计算目标物的浓度。本方法操作简便，原料易得，生物相容性好，可高效、灵敏、迅速、低成本地对生物分子进行检测。
文档编号G01N21/64GK103175819SQ201310129229
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者刘志洪, 曾令瑜, 袁云霞, 沈佩 申请人:武汉大学