专利名称：西马特罗胶体金试纸条及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全领域中涉及β2_受体激动剂残留检测领域。具体而言，本发明涉及西马特罗胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术：
β 2受体激动剂(β 2-agonist)是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物，西马特罗(CimateiOl)作为β 2_受体激动剂的代表药物之一，它能调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌，但是长期用高剂量的西马特罗给动物饲喂时，西马特罗会对动物体内的营养进行再分配，促进蛋白质沉积而抑制脂肪形成，从而显著提高动物的瘦肉率。因此，近年来西马特罗成为了盐酸克伦特罗的一个主要的替代品应用于动物饲料中。西马特罗在体内代谢缓慢、作用时间久、性质稳定、药物残留率高，当人类食用残留该药物的动物性食品后势必会对健康产生相当的危害，所以研发出一种能够方便、快速、准确的定量检测动物性食品中西马特罗的方法具有相当的必要性。目前，国内外检测西马特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱质谱联用技术(LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)。在食品安全检测中，往往先用ELISA进行初筛后，再对阳性样本用HPLC或GC-MS、LC-MS进行确证。但是上述方法所用的仪器设备昂贵复杂、成本高，同时需要对操作人员进行特殊培训，且实验结果不能立即显示，因此不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。胶体金试纸条是以胶体金作为免疫层析的指示物，其原理是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接运用可目测的胶体金标记物而得到直观的实验结果。虽然该方法快速方便，但是胶体金试纸条仍有以下缺点:(I)只有当金颗粒集聚到一定量(IO7个/mm2)时，才出现肉眼可见的紫红条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。(2)样品基质效应明显，背景干扰大。(3)无法实现定量检测。因此，目前对于西马特罗的定量检测手段仍有待改进。

发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效检测西马特罗的试纸条和其制备方法及其用途。在本发明的第一方面，参考图1，本发明提出了一种西马特罗胶体金试纸条，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合物垫上是含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。由此，可以有效地获得西马特罗胶体金试纸条，从而对样品中西马特罗进行定量检测。在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述的西马特罗胶体金试纸条的方法，其包括下列步骤:制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线；制备结合物垫；以及组装试纸条，其中，用能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线；用能与抗西马特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。由此，由本发明提供的方法能有效制备前面所述的西马特罗胶体金试纸条，从而对样品中西马特罗进行定量检测。根据本发明的实施例，用于制备检测线的西马特罗检测抗原是通过下列方法获得的:称取50mg西马特罗，用IOmL pHl.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作为C液；冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4摄氏度磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及最终产物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的西马特罗偶联物。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有西马特罗检测抗原的检测线，从而获得具有检测线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。根据本发明的实施例，用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的:通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能够与西马特罗检测抗原结合的抗体的质控线，从而获得具有质控线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。根据本发明的实施例，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的:将硝酸纤维素膜按20mm 30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL 1.0mg/mL的西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm 18mm ;将经纯化浓度调整为0.5mg/mL 1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边Ilmm 13_ ;将所述硝酸纤维素膜室温干燥30分钟，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37摄氏度下孵育30分钟。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备大小均一、位置固定并且分别具有特定浓度抗原、抗体的检测线和质控线，从而获得具有检测线和质控线的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。根据本发明的实施例，结合物垫是通过下列步骤获得的:选用能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记胶体金；以及把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记的胶体金的结合物垫，从而获得具有结合物垫的西马特罗胶体金试纸条，进而有效地对西马特罗进行定量检测。在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的西马特罗胶体金试纸条检测西马特罗的方法，包括以下步骤:配制已知系列浓度的西马特罗标准品并加入胶体金读取仪样本孔中，IOmin后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，读取检测数值，以及通过所述标准曲线计算所述检测样品中的西马特罗含量。由此，通过本发明所提供的方法，可以有效地制备采用该胶体金读取仪的校准曲线，从而配合本发明提供的西马特罗胶体金试纸条有效地对西马特罗进行定量检测。有益效果1、灵敏度高:本发明采用西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，能通过仪器替代肉眼观察实验结果，克服了肉眼判断带来的误差，从而提高了检测灵敏度，检测限低至Ippb。2、定量:本发明采用西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，可以根据胶体金读取仪显示器上的显示数值和标准曲线即可得出被检样品中的西马特罗的含量。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明实施例的检测西马特罗的胶体金试纸的结构图；图2是根据本发明实施例的一种胶体金读取仪的示意图；图3是根据本发明实施例的定量检测西马特罗流程图。
具体实施例方式本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1免疫抗原的合成
权利要求
1.一种西马特罗胶体金试纸条，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫， 其中，所述结合物垫上是含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆抗体， 所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。
2.一种制备权利要求1所述的西马特罗胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括下列步骤: 制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有检测线和质控线； 制备结合物垫；以及 组装试纸条， 其中， 用能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为检测线； 用能与抗西马特罗单克隆抗体结合驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于制备检测线的西马特罗检测抗原是通过下列方法获得的: 称取50mg西马特罗，用IOmL pHl.0的蒸馏水将其溶解作为A液，称取60mg亚硝酸钠用2mL蒸馏水将其溶解作为B液，称取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作为C液；冰浴条件下把B液缓慢滴入A液中，4摄氏度磁力搅拌反应4小时后，在冰浴条件下将其缓慢地加入C液中，加完后调pH至8.0，室温磁力搅拌反应过夜；以及 最终产物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去杂质得到用于制备检测线的西马特罗偶联物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于制备质控线的抗体是通过下列步骤获得的: 通过在驴体内注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗体的血清经纯化后制得的，以便获得用于制备质控线的抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的: 将硝酸纤维素膜按20mm 30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL 1.0mg/mL的西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边 15mm 18mm ； 将经纯化浓度调整为0.5mg/mL 1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边Ilmm 13mm; 将所述硝酸纤维素膜室温干燥30分钟，置于1%牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30分钟，取出吸干水分，于37摄氏度下孵育30分钟。
6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于，结合物垫是通过下列步骤获得的:选用能与西马特罗结合的抗西马特罗单克隆抗体标记胶体金；以及 把经过标记的胶体金，分散在玻璃纤维纸上。
7.一种采用如权利要求1所述的西马特罗胶体金试纸条配胶体金读取仪定量检测西马特罗的方法，其特征在于，包括下列步骤: 配制已知系列浓度的西马特罗标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中， 10分钟后检测对应的光密度数值并建立标准曲线， 将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中， 读取检测数值，以及 通过所述标准曲线 计算所述检测样品中的西马特罗含量。
全文摘要
本发明提出了一种西马特罗胶体金试纸条及其制备方法，其中西马特罗胶体金试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合物垫上含有胶体金标记的抗西马特罗单克隆的抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有检测线和质控线，所述检测线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。利用该试纸条能有效检测西马特罗。
文档编号G01N33/558GK103207270SQ201310121618
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者赖卫华, 彭涛, 杨万春, 陈媛, 刘文娟 申请人:江西中德生物工程有限公司