一种gc-ms靶向性烟草样品甾醇提取方法
【专利摘要】一种GC-MS靶向性烟草样品甾醇提取方法，包括以下工艺步骤：1）烟草样品冷冻冻干，粉碎机打碎；2）粉碎好样品50mg加入正己烷1.5ml，超声提取；3）提取完样品室温高速离心，上清转移到色谱瓶，氮气吹干，为一；4）沉淀加80%甲醇、20%KOH溶液1.2ml；5）高速离心，取上清转移至色谱瓶，加正己烷1.0ml，震荡、静置；6）取上清，加饱和NaCl1.0ml，取上清为溶液二，一二合并，氮气吹干，加氯仿0.5ml溶解后，即为专一适于GC-MS测定的烟草样品甾醇上样分析溶液。本发明的优点在于：提供了一种最适合烟草叶片甾醇的提取方法；样品用量少，仅为50mg；有机试剂使用种类少，使用量少，相对便宜，毒性较小；提取时间更短，样品重现性较好。
【专利说明】—种GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及烟草代谢组学新鲜烟叶样品留醇提取方法，具体是一种GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，本发明以GC-MS为分析平台，采用了 SIM离子模式，分析出适合烟草叶片留醇的最佳提取方法。
【背景技术】
[0003]植物留醇是一类广泛存在于自然界中的留体化合物，属于饱和或不饱和的仲醇，以往人们针对动物留醇类物质的研究较多，而对植物留醇有所忽视。烟草中含有多种甾醇类化合物，主要为胆留醇、豆留醇、菜油留醇和β -谷留醇等，是构成烟叶油分的主要成分之一。但当烟叶在燃吸时，留醇的母体多环结构也可形成稠环芳烃，如豆留醇在750°C下热解生成苯并[α ]]^(Stedman R L, 1968),因此分析烟草中的植物留醇对卷烟减害降焦研究十分必要。尽可能多的一次检测到鲜烟叶样品中的留醇化合物，并准确定性定量，为烟草代谢组学研究提供技术支撑。烟草中常见留醇的分析方法有衍生化气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法和气质联用法等。
[0004]代谢组学研究中最容易引入系统误差的是样品制备过程，其它植物留醇通常用有机溶剂(如甲醇和氯仿等)提取。目前还没有新鲜烟叶留醇通用的抽提方法，只能根据其它植物及烤后烟叶的提取方法，结合使用的检测方法(GC-MS)，建立新鲜烟叶留醇通用提取方法。
[0005]因此建立一种简单、重现性好的新鲜烟叶留醇提取方法很有必要，可为后期甾醇的定性定量提供保障，也为烟草代谢组学研究提供技术支持。

【发明内容】

[0006]本发明的目的正是基于上述现有技术状况而专门提供的一种GC-MS靶向性烟草样品甾醇提取方法，利用该方法可实现鲜烟叶样品甾醇的快速、有效提取，且具有提取简单、重现性好的特点。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的: 一种GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，包括以下工艺步骤:
1)烟草样品冷冻冻干(冻干机冻干温度为_40°C)，粉碎机打碎；
2)粉碎好样品50mg加入正己烷1.5ml，25°C下超声提取20 min ；
3)提取完样品室温(20°C)高速离心，上清转移到色谱瓶，氮气吹干，为一；
4)沉淀加80% 甲醇、20%K0H 溶液 1.2ml, 700C 30min ；
5)高速离心，取上清转移至色谱瓶，加正己烷1.0ml，震荡、静置；
6)取上清，加饱和NaCl1.0ml，取上清为溶液二，一二合并，氮气吹干，加氯仿0.5 ml溶解后，即为专一适于GC-MS测定的烟草样品留醇上样分析溶液。
[0008]在本发明中我，所述烟草样品为新鲜烟草叶片。[0009]步骤3)、5)中的高速离心时离心速率为12000rpm，时间lOmin，所用的色谱瓶为尖
底色谱瓶(以便于溶液混合和氮气吹干)。
[0010]本发明提取时所用抽提溶液为正己烷，相对其他溶剂(氯仿等)，因正己烷密度小(0.6594g/ml)、挥发性小、毒性小，便于烟叶样品沉淀离心，也利于提高样品检测重复性，减少对操作人员的毒害。
[0011]本发明具有以下优点:
1.提供了一种最适合烟草叶片留醇的提取方法。
[0012]2.样品用量少，仅为50mg。
[0013]3.有机试剂使用种类少，使用量少，相对便宜，毒性较小。
[0014]4.提取时间短，样品重现性好。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为本发明工艺流程图。
[0016]图2为本提取方法的实验样本植物甾醇的色谱峰图。
[0017]图3为采用本发明方法对中烟100成熟期新鲜烟叶进行6次重复的植物留醇色谱峰图。
【具体实施方式】
[0018]本发明以下结合实施例作进一步描述 实施案例
I)本提取方法的实验样本留醇的色谱峰图
采用该方法对2012年河南中烟100新鲜烟叶样品进行提取，通过GC-MS (SIM)法分析，色谱峰如图2所示，可明确定性7种留醇(依据已有标样，1、2为内标)，已经为所见文献中最多。本发明所确立的提取方法:以正己烷作为提取溶剂(便于烟叶样品沉淀离心，利于提高样品检测重复性，减少对操作人员的毒害)，超声提取20min，80%甲醇、20%K0H溶液作为皂化剂，饱和氯化钠溶液洗涤。
[0019]2)方法重复性考查
采用该方法对中烟100成熟期新鲜烟叶进行了 6次重复的进样分析，分析结果见图3，随机序列分析中，单独提取的6次重复实验，重现性好。
【权利要求】
1.一种GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，其特征在于:包括以下工艺步骤:1)烟草样品冷冻冻干，粉碎机打碎； 2)粉碎好样品50mg加入正己烷1.5ml，25°C下超声提取20 min ； 3)提取完样品室温(20°C)高速离心，上清转移到色谱瓶，氮气吹干，为一； 4)沉淀加80% 甲醇、20%K0H 溶液 1.2ml, 700C 30min ； 5)高速离心，取上清转移至色谱瓶，加正己烷1.0ml，震荡、静置； 6)取上清，加饱和NaCl1.0ml，取上清为溶液二，一二合并，氮气吹干，加氯仿0.5 ml溶解后，即为专一适于GC-MS测定的烟草样品留醇上样分析溶液。
2.根据权利要求1所述的GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，其特征在于:所述烟草样品为新鲜烟草叶片。
3.根据权利要求1所述的GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，其特征在于:步骤3)、5)中的高速离心时离心速率为12000rpm,时间lOmin。
4.根据权利要求1所述的GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，其特征在于:步骤3)、5)中所用的色谱瓶为尖底色谱瓶(以便于溶液混合和氮气吹干)。
5.根据权利要求1所述的GC-MS靶向性烟草样品留醇提取方法，其特征在于:冷冻冻干时的冻干机冻干温度为_40°`C。
【文档编号】G01N30/06GK103713072SQ201410004090
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】翟妞, 陈千思, 刘萍萍, 金立锋, 周会娜, 陈霞, 赵阁, 张丽, 王晓瑜, 孙世豪 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院