纳米等离子体激元共振器的制造方法
【专利摘要】本发明提供纳米等离子体激元共振器(NPR)，其包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘,具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。NPR以高度重现性的方式将拉曼信号增强至6.1×1010倍，使得能够在6pM(0.2ng/ml)的灵敏度下以3个数量级的动态范围实时地进行蛋白酶和酶活性如前列腺特异性抗原(paPSA)的快速检测。对来自paPSA-阳性细胞的细胞外液(ECF)的实验证明了在复杂的生物流体背景中的特异性检测。这种方法提供了以非常小的样品量检测蛋白酶活性的快速、灵敏、精确且单步的手段。
【专利说明】纳米等离子体激元共振器
[0001] 本申请是国际申请日为2008年11月3日、申请号为200880123805. 8、发明名称 为"具有超高灵敏度的使用纳米等离子体激元共振器的实时单步生物测定"的发明专利申 请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2007年11月2日提交的美国临时专利申请No. 60/984, 859的优先权， 其全部内容引入本文作为参考。
[0004] 政府支持的声明
[0005] 本工作得到以下支持：NSF Nano-scale Science and Engineering Center(DMI-0327077)、NSFSST/Collaborative Research Program(DMI-0427679)、和 NASA Institute for Cell Mimetic Space Exploration(CMISE),以 Award No. NCC2-1364 ； NHLBI/NIH HL078534 和 NCI/NIH R1CA95393-01;DARPA 和 UCSF Prostate Cancer SPORE award(NIH Grant P50CA89520和P01CA072006)，以Contract no. DE-AC02-05CH11231，由美 国會泛源部授予，在University of California/Lawrence Berkeley National Laboratory〇
[0006] 参考序列表
[0007] 纸张形式序列表的全部内容引入本文作为参考，如附在说明书后一样。

【技术领域】
[0008] 本发明涉及使用单独的纳米等离子体激元共振器（nanoplasmonic resonator)和 纳米等离子体激元共振器阵列检测酶活性的表面增强拉曼散射（SERS)的领域。本发明具 体涉及蛋白酶活性，例如用于前列腺癌诊断应用的前列腺特异性抗原（PSA)和蛋白水解活 性PSA的检测。

【背景技术】
[0009] 最早在1928年开发的拉曼光谱已经广泛地用于表征分子性质（Kazuo Nakamoto John R. Ferraro, Chris ff. Brown, Introductory Raman Spectroscopy,第二版（Elsevier Science，2003)。表面增强拉曼光谱学（SERS)通过靠近表面的增强电磁场显著提高拉 曼信号（C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang 等，Anal Chem76 (1)，78 (2004) ;Α· E. Grow, L. L. Wood, J.L.Claycomb 等，J Microbiol Methods53 (2) ,221 (2003) ;K.Nithipatikom，M. J. McCoy, S.R.Hawi 等，Anal Biochem322 (2) ,198(2003) J.B. Jackson 和 N.J.Halas，P Natl Acad Sci USA101 (52) ,17930 (2004))。在粗糙金属表面或分散的金属纳米颗粒聚集 体上进行的SERS测量显示对于下至单个分子水平的检测的高达10 14的最高拉曼增强因子 (Katrin Kneipp, Harald Kneipp, Irving Itzkan 等，Current Science (Bangalore) 77 (7) ，915(1999) ;S. Nie 和 S. R. Emory, Science275(5303), 1102(1997))，但是这些测量经常遭 受差的重现性（M.Moskovits, Reviews of Modern Physics57 (3) ,783 (1985))。为了改善 重现性，已经开发了其它方法以高达108的重现性增强因子在大面积上制造由同质特征组 成的SERS基底，所述方法包括金属胶体纳米颗粒的自组装（R. G. Freeman，K. C. Grabar，Κ. J. Allison 等，Science267 (5204)，1629 (1995))、纳米球平版印刷术（lithography) (NSL)和纳米球上的金属膜（MFON) (C. L. Haynes 和 R. P. Van Duyne, Journal of Physical Chemistry B107 (30)，7426 (2003))、抛光的金基底的电化学糙化（J. M Sylvia, ΙΑ. Janni, J. D. Klein 等， Analytical Chemistry72 (23) ， 5834 (2000)) 和 使用电 子束平 版印刷术的周期结构化的金属基底（M. Kahl, E. Voges, S. Kostrewa等，Sensors and Actuators B-Chemical51 (1-3)，285 (1998))。虽然这些努力导致 SERS 分析成功用 于许多有前途的应用中，但是缺少在特定位置制造 SERS热点的能力限制了对于非常 小的样品量的应用，所述有前途的应用包括基因和蛋白质鉴别（Y. C. Cao, R. C. Jin，J. M.Nam 等，J Am Chem Socl25(48)，14676(2003) ;Y.W.C.Cao，R.C.Jin 和 C.A.Mirkin，S cience297 (5586) ,1536 (2002) ;T.Vo_Dinh，F.Yan 和 M.B.Wabuyele，Journal of Raman Spectroscopy36 (6-7)，640 (2005))、生物战剂检测（D. A. Stuart, K. B. Biggs 和 R. P. Van Duyne, Analystl31 (4) ,568 (2006))和实时葡萄糖监测（O.Lyandres，N.C. Shah, C. R. Yonzon 等，Analytical Chemistry77 (19)，6134 (2005))。
[0010] 为了克服这种限制，我们最近开发了可调的纳米等离子体激元共振器（NPR)，其由 夹在引入本文作为参考的 Durant S.Su K, Steel M.J·，Xiong Y. Sun C, Zhang X，Journal of Physical Chemistry B110(9), 3964(2006)中所述的金属纳米盘之间的薄5;[02层组成。 可通过改变介电层厚度和NRP的纵横比精确地调控共振频率。在对于单独的SERS基底或 纳米颗粒所得的最大值之中，个别NPR可增加拉曼强度至6. 1 X 101°倍。使用已经确立的 (well established)纳米平版印刷术方法制造，基于NPR的方法使得能够在所需位置以小 得多的尺度可重现地制造 SERS热点，容许多重的（多路的，multiplexed)高通过量检测和 芯片上的实验室应用。
[0011] 前列腺癌生物标记物前列腺特异性抗原（PSA)，一种激肽释放酶（hK)家族丝氨 酸蛋白酶（S. R. Denmeade 和 J. T. Isaacs, BJU Int93Suppll, 10 (2004) ;J. A. Clements, N. M.Willemsen,S.A.Myers 等，Crit Rev Clin Lab Sci41(3), 265(2004))用作本申请中 的模型蛋白酶。通常使用的前列腺特异性抗原（PSA)血液测试已经被广泛地用于前列 腺癌（最主要的男性癌症）的早期诊断和处理（H.Gronberg，Lancet361(9360)，859(200 3) ;S.R.Denmeade 和 J.T.Isaacs，Nat Rev Cancer2(5)，389(2002))。然而，血清 PSA 浓 度更经常地反映良性前列腺增生（BPH)的存在，而不是癌症（A.Caplan和A.Kratz，Am J Clin Patholll7Suppl，S104 (2002) ;Ε·Ι· Canto, S.F. Shariat 和 K.M.Slawin，Cu;rr Urol Rep5(3)，203(2004))。特异性的缺乏导致高的假阳性率并且经常导致昂贵的 用于诊断的前列腺针吸活组织检查和活组织检查后的并发症（complication))以及 相当大的焦虑（M.B.Gretzer 和 A.W. Partin, Urol Clin North Am30 (4) ,677 (2003); A.Haese，M.Graefen，H.Huland 等，Curr Urol Rep5(3)，231(2004))。最近的研究已经 鉴定了 一类高度特异性的肽，其可在异种移植模型（S. R. Denmeade, C. M. Jakobsen, S. Janssen等，J Natl Cancer Inst95 (13) ,990 (2003))和人类样品（P.Wu，U.H.Stenman，M. Pakkala 等，Prostate58 (4) ,345 (2004) ;P.Wu，L.Zhu，U.H.Stenman 等，Clin Chem50(l)，125(2004))中被paPSA同种型（isoform)切割，因此，来自体内样品的paPSA 蛋白酶活性的测量是可能的，并且作为前列腺癌的更特异性的筛选剂（掩蔽剂，screening agent)和在复发性疾病的检测中是潜在有价值的。然而，基于免疫肽分析（IMPA)的报道 结果显示出低的荧光信噪比，妨碍在临床上重要的60?300pM范围内较低的浓度下的可 靠测量（P. Wu, U. H. Stenman, M. Pakkala 等，Prostate58 (4)，345 (2004) ;P. Wu, L. Zhu，U. H. Stenman等，Clin Chem50(l)，125(2004))。此外，通常从细针吸活组织检查或循环细胞 捕获中分离有限数量的前列腺癌细胞（〈1000)。不存在对于临床分期可以在少量细胞上进 行paPSA蛋白酶活性测定的商业化方法。因此，本发明的一个目的是提供容许以非常少的 样品量进行用于前列腺癌检测的paPSA的特异性和灵敏的测量的方法。


【发明内容】

[0012] 本发明提供使用由纳米等离子体激元共振器（NPR)组成的纳米传感器以至 少皮摩尔灵敏度在体外和原位检测和测量酶活性。在一个实施方式中，生物结合的 (bioconjugated) NPR增强在表面增强拉曼光谱学（SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够 以非常小的量灵敏地单步检测酶活性。
[0013] 在一些优选的实施方式中，本发明提供包括纳米等离子体激元共振SERS平台的 纳米传感器。所述平台包括特征在于单独的或阵列形式的表面增强拉曼散射（SERS)纳米 等离子体激元共振器的基底，其中所述纳米等离子体激元共振器（NPR)具有与其结合的生 物分子（biomolecule)。在一个实施方式中，所述NPR包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘， 具有结合或束缚（tether)到所述NPR表面的被标记的生物分子。在优选的实施方式中，所 述标记物是拉曼活性标记物。
[0014] 在一个实施方式中，所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述肽包 括可被特异性修饰或者通过酶切割的特异性序列。因此，这种肽结合的纳米等离子体激元 共振器意图用作特异性筛选工具以提供关于酶例如蛋白酶、激酶和肽酶的存在、浓度和活 性的信息。在一个实施方式中，筛选将测量在生物样品中癌生物标记例如前列腺特异性抗 原（PSA)的活性。在一个实施方式中，所述肽应为被待检测的相应酶特异性识别、修饰和/ 或发挥作用的底物。
[0015] 在另一实施方式中，实时反应监测还提供关于酶活性的关键（临界，critical)信 息，而不是仅测量蛋白质的存在。可使用不同的拉曼标记物分子，使得可通过多重肽结合的 NPR进行两种或更多种类型酶的检测。而且，在基底上的肽结合的NPR的阵列描述用于进一 步放大或扩展检测。
[0016] 在另一实施方式中，彼此正交或者具有特异性的较小重叠的不同生物分子底物可 用于检测相应的酶。在一个实施方式中，生物分子库可与NPR结合并且以无规阵列或有序 的微阵列形式空间分离。生物分子-纳米等离子体激元共振器的多重阵列可用于同时检测 多种酶。
[0017] NPR也可通过激光或磁场操作以在空间上以高精确度寻址（address)，使得其可 多重化为高密度阵列（具有亚微升容量）。以微阵列或纳米阵列形式的用于多种蛋白酶的 另外的空间多重化是预期的。另外，磁场或激光操纵性容许在所需的位置处生物传感，这对 于在细胞内得到原位测量是有用的。
[0018] 在另一实施方式中，本文中所述的纳米传感器可集成到微流体系统或其他芯片系 统中。在一个实施方式中，基于纳米传感器的测定可以液相进行，其中样品与NPR纳米传感 器或NPR阵列接触，和可进行SERS测量。
[0019] 更具体地说，本发明涉及如下方面。
[0020] 1.纳米等离子体激元共振器（NPR)，包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘，具有结 合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。
[0021] 2.根据1的共振器，其中所述标记物是用于表面增强拉曼散射（SERS)检测的拉曼 活性标记物。
[0022] 3.根据1的共振器，其中所述标记物是荧光或其它能检测的标记物。
[0023] 4.根据1的共振器，其中所述纳米盘包括金属薄层、半导体材料、金属多层、金属 氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料。
[0024] 5.根据4的共振器，其中所述纳米盘由金属组成。
[0025] 6.根据1的共振器，其中所述屏蔽层包括具有恒定拉曼光谱的材料。
[0026] 7.根据6的共振器，其中所述屏蔽层选自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
[0027] 8.根据1的共振器，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述 肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
[0028] 9.根据1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
[0029] 10.纳米等离子体激元共振SERS检测平台，包括特征在于单独的或阵列形式的表 面增强拉曼散射（SERS)纳米等离子体激元共振器（NPR)的图案化基底，其中所述纳米等离 子体激元共振器具有与其结合的生物分子。
[0030] 11.根据10的平台，其中其上图案化所述纳米等离子体激元共振器的基底可由石 英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光谱的任意其它材料组成。
[0031] 12.根据10的平台，其中所述纳米等离子体激元共振器包括具有交替屏蔽层的金 属纳米盘，具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子， 其中所述标记物是用于SERS检测的拉曼活性标记物。
[0032] 13.根据12的平台，其中所述纳米盘包括金或银的薄层。
[0033] 14.根据12的平台，其中所述屏蔽层包括二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、或右旋 糖酐。
[0034] 15.根据10的平台，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述 肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
[0035] 16.根据10的平台，其中所述阵列形式的纳米等离子体激元共振器是相同或不同 的。
[0036] 17.根据15的方法，其中生物分子库与所述纳米等离子体激元共振器结合并且以 无规阵列或有序的微阵列形式空间分离。
[0037] 20.用于使用纳米传感器以至少皮摩尔灵敏度体外检测和测量酶活性的方法，所 述纳米传感器包括纳米等离子体激元共振器（NPR)，其中所述NPR增强在表面增强拉曼光 谱学（SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够以非常小的量灵敏地单步检测酶活性。
[0038] 21.用于酶活性的实时反应监测的方法，包括：
[0039] (a)提供在基底上图案化的肽结合的纳米等离子体激元共振器阵列，其中各纳米 等离子体激元共振器（NPR)包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘并且具有结合或束缚到所 述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子，其中所述标记物是拉曼标记物 分子，各自相同或不同，和其中各个肽包括通过特异性酶使用特异性反应识别和修饰的序 列；
[0040] (b)提供怀疑含有酶的生物样品；
[0041] (c)使所述样品与所述纳米等离子体激元共振器阵列接触；
[0042] ⑷使所述反应进行；
[0043] (e)通过SERS检测测量所述酶的检测。
[0044] 22.根据21的方法，其中生物分子库可与所述纳米等离子体激元共振器结合并且 以无规阵列或有序的微阵列形式空间分离。
[0045] 23.根据22的方法，其中所述生物分子-纳米等离子体激元共振器的阵列可用于 同时检测多种酶的活性。

【专利附图】

【附图说明】
[0046] 图1 :使用肽结合的NPR SERS纳米传感器检测PSA蛋白酶活性的工作原理的示意 性图解。（a)NPR通过耦合的等离子体激元共振呈现出可调的等离子体激元共振和高度增强 的局部电磁场。短轴150nm和长轴200nm的NPR由厚度分别为25nm和5nm的银和Si0 2层的 多重叠层制成。（b)由拉曼染料R19、PSA特异性肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID N0:1)和半胱 氨酸组成的生物标记的分子结构。所述肽可通过PSA酶在HSSKLQ和LAAAC之间切割。（c) 用肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO: 1)和拉曼染料R19 (星）官能化的NPR的检测图。PSA 酶的存在将切割所述肽序列。切割之后，通过R19部分的SERS标志（signature)的消失监 测R19(星）离开表面的扩散。填充分子辛烷硫醇（HS-(CH 2)2-CH3)用于减小NPR表面上的 报告肽的填充密度，由此容许PSA酶达到所述报告肽。（d)使用标准电子束平版印刷术和薄 膜沉积方法制造的NPR阵列的光学显微图像。制造的NPR阵列由间隔500nm的30 X 30NPR 组成。可在相同的基底上便利地制造多个NPR阵列和对准标记。（e)通过扫描电子显微镜 测量的NPR阵列的放大图像。使用精确平版印刷术方法，可以受控的方式制备NPR。（f)使 用原子力显微镜（AFM)在较高的放大率下测量的NPR图像。（g)在425?650nm的波长范 围内所测量的NPR阵列的消光光谱。已调节NPR的共振峰以紧密匹配激光激发和拉曼发射 频率，并由此使拉曼信号的总体增强最大化。（h)在不同的NPR阵列上测量的结合在NPR表 面上的对巯基苯胺（PMA)分子的高度重现性拉曼光谱。积分时间为30秒。
[0047] 图2 :PSA蛋白酶活性的实时动态测量。（a)对于在30分钟内所取的6nMPSA培养 的SERS光谱，积分时间为30秒。（b)对于在30分钟内所取的阴性对照6nM粒酶B的SERS 光谱。（c)添加 PSA蛋白酶之前和之后在131601^145601^1526(^1和1597CHT1处的拉曼 峰强度的相对变化的时间分辨的测量。负时间表示添加蛋白酶之前的时间。
[0048] 图3 :通过改变活性PSA浓度的PSA活性的时间分辨的测量。（a)对于1316(^1峰 在6pM?6nM的活性PSA浓度下的归一化的SERS强度变化。可清楚地测量SERS强度的降 低，而在不含活性PSA蛋白酶的对照实验中不能观察到显著的改变。（b) 30分钟时获得的 归一化SERS强度变化与浓度的关系。（c)从未处理的细胞外流体（ECF)中获得的蛋白酶 活性测量结果：在将LNCaP细胞（阳性对照）ECF暴露于NPR纳米传感器开始时（t = 0分 钟）和30分钟之后所得的拉曼光谱。（d)在1316CHT1峰处的归一化的SERS强度变化，表 示从LNCaP和K562细胞系中提取的流体中PSA蛋白水解活性。
[0049] 图4 :使用拉曼检测和光谱学的PSA检测图。
[0050] 图5A :SERS显微光谱学系统以及纳米等离子体激元共振器目测和实时酶反应检 测。图5B:光谱测量设备的示意图。
[0051] 图6(a)具有各个金属层的单独纳米盘的模拟散射光谱。所述纳米盘是圆形的，直 径为90nm，而金属层和Si0 2层的总厚度均保持为30nm。入射光的偏振在Y-轴方向偏振。 (b)共振频率下单独Au层纳米盘（Si02/Au/Si0 2)的局部电场分布的Y-Z面横截面。（c)共 振频率下6Au层纳米盘（Si02/Au) 6/Si02的局部电场分布的Y-Z面横截面。

【具体实施方式】
[0052] 本发明证明使用由纳米等离子体激元共振器（NPR)组成的纳米传感器以至少皮 摩尔灵敏度在体外检测和测量酶活性。在一个实施方式中，生物结合的NPR增强表面增 强拉曼光谱学（SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够以非常小的量灵敏地单步检测酶活 性。
[0053] 小量性质的主要优点和应用之一是其在单细胞水平上检测癌细胞的蛋白酶例如 前列腺特异性抗原（PSA)的活性中是有用的。小量的要求和灵敏度水平使得可能在捕获的 循环前列腺癌细胞中检测PSA活性用于指示各种疾病状态例如转移，这是使用常规技术不 可行的。在精液中，PSA浓度为10?150 μ M，大约三分之二的PSA是酶活性的。使用NPR PSA探针实现的灵敏度水平（纳摩尔范围）足以进行基于精液的测定，因此本文所述的纳米 等离子体激元共振SERS平台意图具有临床应用。
[0054] 在优选的实施方式中，本发明提供包括纳米等离子体激元共振SERS平台的纳米 传感器。所述平台包括特征在于单独的或阵列形式的表面增强拉曼散射（SERS)纳米等离 子体激元共振器的基底，其中所述纳米等离子体激元共振器（NPR)具有与其结合的生物分 子。在一个实施方式中，所述NPR包括至少两个具有交替薄屏蔽层的纳米盘，和结合或束缚 到所述NPR的表面的被标记的生物分子。在优选的实施方式中，所述标记物是拉曼活性标 记物。
[0055] 现有技术中已知潜在用于拉曼光谱学的各种检测装置并且可使用任意已知的拉 曼检测装置。拉曼检测装置的非限制性实例公开在美国专利No. 6, 002, 471中。在该实例 中，通过532nm (纳米）波长的Nd: YAG激光或者365nm波长的Ti :蓝宝石激光产生激发束。 可使用脉冲激光束或连续激光束。激发束通过共焦光学器件和显微镜物镜，并且可聚焦在 含有连接的生物分子目标物的基底上。可通过显微镜物镜和共焦光学器件收集拉曼发射光 目标，其耦合至用于光谱分离的单色器。所述共焦光学器件可包括用于减少背景信号的反 射镜、二向色性滤光器、屏障滤光片、共焦针孔、和透镜的组合。标准全场光学器件也可用作 共焦光学器件。
[0056] 可通过拉曼检测器检测拉曼发射信号。所述检测器可包括与用于计算和数字化信 号的计算机接口的雪崩光电二极管。在待分析目标阵列时，可设计光学检测系统以检测拉 曼信号和将拉曼信号定位到芯片或格子上的特定位置。例如，发射光可引导到CCD(电荷耦 合器件）照相机或在检测区域内能够同时测量来自20个多重像素或像素组的光发射的其 它检测器。
[0057] 各种激发源包括，但不限于，337nm的氮激光器（Laser Science Inc.)和325nm的 氦-镉激光器（Liconox)(美国专利No. 6, 174, 677)。激发束可使用带通滤光器30(Corion) 光谱纯化并且可使用6 X物镜（Newport，Model L6X)聚焦在基底140上。物镜可用于激发 指示器和收集拉曼信号两者，通过使用全息分束器（Kaiser Optical Systems, Inc.，Model HB647-26NI8)产生用于激发束和发射的拉曼信号的直角几何形状。全息陷波滤波器 (Kaiser Optical Systems, Inc.)可用于减小瑞利散射福射。供选择的拉曼检测器包括， 但不限于，配置有红色增强强化电荷耦合器件（RE-ICXD)检测系统的ISA HR-320摄谱仪 (Princeton Instruments)。可使用其它类型的检测器，例如电荷注射器件、光电二极管阵 列或光电晶体管阵列。
[0058] 现在参考图1A，NPR的纳米级尺寸和高的局部电磁场增强使得能够在其表面上高 灵敏度地光学检测生物分子反应。在优选的实施方式中，所述纳米等离子体激元共振器是 包括通过屏蔽层分离的至少两个垂直堆叠的纳米盘的平版印刷限定的金属电介质纳米颗 粒。在各种实施方式中，NPR优选通过电子束平版印刷术在基底上图案化。
[0059] 其上NPR图案化的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光谱 的任意其它材料组成。在一个实施方式中，为了防止电子束平版印刷术期间的带电效应，所 述基底进一步涂布有层例如氧化铟锡。所述层可溅射、沉积、涂布或使用任意其它方法添加 到所述基底上以形成薄膜。在另一实施方式中，然后用聚合物旋涂所述基底以在曝光以产 生图案之前产生正性光刻胶。在一个实施方式中，在曝光之后，使用溶剂混合物显影图案， 随后进行多层电子束蒸发和标准的剥离过程。
[0060] 在一个实施方式中，如实施例1所述制备NPR。在另一实施方式中，如以下所述制 备 NPR :Κ· H. Su, Q. H. Wei 和 X. Zhang, ''Tunable and augmented plasmon resonances of Au/Si02/Au nanodisks"，Appl. Phys. Lett. 88, 063118, 2006 ;以及 Kai-Hung Su，St6phane Durant, Jennifer M. Steele, Yi Xiong, Cheng Sun 和 Xiang Zhang, Raman Enhancement Factor of a Single Tunable Nanoplasmonic Resonator, Journal of Physical Chemistry B，110 (9)，3964 (2006)，这两者的全部内容引入本文作为参考。
[0061] 在优选的实施方式中，所述纳米等离子体激元共振器由层叠或堆叠有交替屏蔽层 的纳米盘组成。例如，可在两个金纳米盘之间夹入Si0 2屏蔽层制备NPR。在另一实施方式 中，其间夹有Si02屏蔽层的两个金纳米盘在一端用另一 Si02屏蔽层覆盖，从而产生Si02/ Au/Si02/Au纳米等离子体激元共振器。
[0062] 在一个实施方式中，在图案化基底上蒸发纳米级层以形成NPR的纳米盘层。在优 选的实施方式中，各纳米盘在其最宽点处为50?500nm。所述纳米盘可由金属薄层、半导体 材料、金属多层、金属氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料组成。在一些实施方式中，纳米月 牙状物（nanocrescent)包括选自 Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、 V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo 的金属、及其氧化物、和 /或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或烧结基质。
[0063] 屏蔽层材料可为具有恒定拉曼光谱的任意材料。所述屏蔽层起到NPR的等离子体 激元共振频率的调节参数的作用。与单层金属纳米盘相比，多层纳米盘呈现出若干独特的 性质，包括显著增强的等离子体激元共振和可调的共振波长，所述共振波长可通过简单地 改变电介质层厚度而修整到所需值同时保持颗粒直径恒定。数值计算表明将一个金属层分 为金属多层导致较高的散射强度和更多的"热点"或者强场增强区域。图6显示具有各个 金属层的纳米盘的颜色模拟散射光谱。
[0064] 因此，在另一实施方式中，NPR中各纳米盘层可具有相同或不同的厚度。通过选择 不同的层厚度，可以调节等离子体激元共振波长和表面增强因子以匹配各种应用。例如，在 实施例1中，短轴150nm和长轴200nm的NPR由厚度分别为25nm和5nm的银和Si02层的多 重叠层制成。而且，通过选择性地屏蔽金属结构的外表面，可通过将分子集合体（assembly) 导向呈现出强电磁场的位置来进一步增强效率。因此，在另一实施方式中，所述外层为包括 具有恒定拉曼光谱的材料的屏蔽层。图1A显示优选纳米等离子体激元共振器（NPR)的示 意图和透射电子显微照片。
[0065] 在一个实施方式中，所述生物分子是包括可通过蛋白酶特异性切割的特异性序列 的肽，其与拉曼活性标记物连接。
[0066] 现有技术中已知各种拉曼标记（例如，美国专利No. 5, 306, 403 ;6, 002, 471 ; 6, 174, 677,其引入本文作为参考）并且可使用任意这种已知的拉曼标记。所述标记典型 地具有特有的（例如，独特的）和高度可见/可检测的光学标志。合适的拉曼标记包括， 但不限于，荧光团、生色团、量子点、荧光微球、生物素等。在一些实施方式中，所述拉曼标 记包括若丹明、荧光素、或外源化学分子。在一些实施方式中，所述拉曼标记包括作为拉曼 标记物的部分。标记物分子的非限制性实例包括TRIT(四甲基若丹明异硫醇）、NBC(7-硝 基苯-2-氧杂-1，3-二唑）、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲 酚固紫、甲酚蓝紫、灿烂甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、异羟洋地黄毒苷、5-羧 基-4'，5' -二氯-2'，7'-二甲氧基突光素、5-羧基-2'，4'，5'，7'四氯突光素、5-羧基突 光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-10羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-若丹明、偶氮 甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨吖啶、和氰化物（CN)、硫醇（SH)、氯（el)、溴（Br)、甲 基、磷（P)、硫⑶、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有这些部分的化合物。在一些实施方式中，碳 纳米管、量子点（参见，例如 Evident Technologies, Troy N.Y. ;Invitrogen/Molecular Probes, 15等）或者微球（例如突光微球（参见，例如来自InvitrogenIMolecular Probes 的Transfluosphres*)可用作拉曼标记物。
[0067] 在各种实施方式中，一种或多种拉曼标记（拉曼标记物）可以与附着到NPR的生 物分子（例如，多肽）连接。这种拉曼标记物的存在可以增强通过切割肽产生的拉曼信号 的变化。
[0068] 因此，在一个实施方式中，这种拉曼标记的生物分子结合的纳米等离子体激元 共振器意图用作特异性筛选工具以提供关于生物样品中酶和其它癌生物标记例如前列 腺-特异性抗原（PSA)的存在、浓度和酶活性的信息。在一些实施方式中，所述生物分子是 肽。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。所述 术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在一些实施方 式中，多个肽与纳米月牙的表面结合，各自相同或不同。在各种实施方式中，约5?500,更 优选约10?约400,还更优选约20、30或40?约200、250或300,和最优选约50?约150 个底物分子（例如肽）与纳米月牙状物连接。在一个实施方式中，约100个肽以Au与肽上 的硫醇基团之间的直接反应15结合至纳米月牙状物。
[0069] 其活性受到监测的酶可以包括，但不限于，酶、蛋白酶、激酶、肽酶或其它生物分 子。在各种实施方式中，所述生物分子是被待检测的相应酶特异性识别和修饰或切割的肽。 在另一实施方式中，所述生物分子是被待检测的激酶特异性识别和磷酸化的肽。各种类型 的蛋白酶和通过这些蛋白酶特异性识别的肽也描述于名为"Detection of Protease and Protease Activity Using a Single Nanoscrescent SERS Probe" 的共审未决国际申请 No. PCT/US2007/010722中。使用纳米月牙探针用于蛋白酶或其它生物分子的SERS检测的 相关方法也描述于PCT/US2007/010722中，其全部内容引入本文作为参考。
[0070] 在优选的实施方式中，所述生物分子是肽，其中所述肽是长度约10?12个氨基酸 残基的寡肽。然而，所述肽可短至4个氨基酸残基，和长至100个氨基酸。在一个实施方式 中，所述肽应为被相应酶特异性识别和修饰的序列。所述肽可合成和商业上得到，或者所述 肽可以根据实施例1中所述方法制备。拉曼活性分子例如生物素或若丹明6G(R19)(图1B) 优选通过短的聚乙二醇或氨基戊酸连接物接枝在所述肽的氨基末端。
[0071] 所述生物分子可直接地或者经由一个或多个连接剂"结合"（即连接）到所述纳米 等离子体激元共振器。本文中使用的"连接剂"是指在NPR和生物分子之间形成键且包括例 如官能团、亲和剂、或稳定化基团的任意化合物。合适的键包括离子相互作用，共价化学键， 物理力例如范德华或疏水相互作用，包封作用，包埋，结合亲和力，吸引或认可，和各种类型 的一级、二级、三级连接，所述连接包括，但不限于，肽、醚、酯、丙烯酰基（acryl)、醛、酮、丙 烯酰基（acryloyl)、硫醇、羧基、轻基、巯基和胺连接等。
[0072] 在一个实施方式中，数百种肽通过NPR的金属纳米盘与所述肽上的硫醇基之间的 直接反应与所述NPR结合。在另一实施方式中，NPR金属表面还可使用胺或羧基改性，从而 所述肽可以通过肽键经由与异双官能交联剂的反应束缚到NPR表面上，其中所述异双官能 受联剂可与胺基和硫醇基两者反应，或者与竣基和硫醇基两者反应。在【具体实施方式】中， Au/Si02/Au/Si02NPR可以使用胺或羧基官能团官能化，和所述肽可经由交联剂与胺和羧基 官能团交联。各种交联剂可用于硫醇活化的肽和NPR上表面官能团例如胺、羧基和羟基的 结合。
[0073] 在一个优选的实施方式中，依靠 Au_硫醇反应以形成共价键，使用在肽羧基末端 的半胱氨酸基团以将所述肽连接到Au表面将底物肽束缚到Au/Si02/Au NPR的表面上。在 优选的实施方式中，类似地将多个肽结合到NPR的表面，各自相同或不同。
[0074] 本文中所述的NPR指示物可利用包括用于需要检测的任意蛋白酶的一个或多个 识别位点的多肽序列。蛋白酶（蛋白水解活性）不仅对于维持正常的细胞功能是需要的， 而且对于各种人类疾病的发病也是重要的。寄生虫感染（例如血吸虫病和疟疾）、真菌感染 (例如白念珠菌（C. albicans))和病毒感染（例如HIV、疱疹和肝炎）以及癌症、炎症疾病、 呼吸系统疾病、心血管疾病和包括阿尔茨海默病的神经变性疾病需要蛋白水解活性用于进 展。因此蛋白酶存在、量或活性的检测作为用于疾病的存在或可能性的诊断/预示标志是 有用的。另外，蛋白酶活性（或者其抑制）的检测在筛选用于治疗许多病状的蛋白酶抑制 剂疗法中是有用的。
[0075] 可根据本发明检测和/或定量的"蛋白酶"是典型地使位于多肽链中一对氨基 20酸之间的肽键水解的酶，也称作内切蛋白酶。典型地参考酶催化中心的亲核物质来限 定蛋白酶。最通常的亲核物质来自丝氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的侧链，产生蛋白酶家族 例如丝氨酸蛋白酶（Paetzel等（1997)Trends Biochem. Sci.22:28_31)、天冬氨醜蛋白酶 (Spinelli 等（1991)Biochemie73:1391-251396)、和半胱氨酸蛋白酶（Altschuh 等（1994) Prot. Eng. 7:769-75, 1994)。金属蛋白酶通常在催化位点含有锌催化金属离子（Klimpel等 (1994)Mol. Microbiol. 13:1093-1100)。
[0076] "蛋白酶识别位点"是通过肽键连接的邻接氨基酸序列，其含有一对通过由特定 蛋白酶水解的肽键连接的氨基酸。任选地，蛋白酶识别位点可包括在待水解肽键任一侧 的一个或多个氨基酸，其也结合有所述蛋白酶的催化位点（Schecter and Berger, (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157-62)，或者蛋白质底物上的识别位点和切割位点可 为通过一个或多个（例如2?4个）氨基酸分离的两个不同位点。
[0077] 蛋白酶识别位点中的氨基酸的特异性序列典型地取决于蛋白酶的催化机理，其通 过蛋白酶活性位点处的官能团性质所限定。例如，胰蛋白酶水解其羰基官能由赖氨酸或精 氨酸残基贡献的肽键，而不管多肽链的长度或氨基酸序列。然而，因子Xa识别特异性序列 Ile-Glu-Gly-Arg并且水解在Arg的C末端侧上的肽键。各种优选的蛋白酶识别位点包括， 但不限于，对于来自丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶识别位点，或者对于金属蛋白酶 的蛋白酶识别位点，或者对于来自半胱氨酸蛋白酶家族、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/ 或谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶识别位点。在一些实施方式中，优选的丝氨酸蛋白 酶识别位点包括，但不限于，对于类似糜蛋白酶的蛋白酶、和/或类似枯草杆菌蛋白酶的蛋 白酶、和/或α/β水解酶、和/或信号肽酶的识别位点。在一些实施方式中，优选的金属 蛋白酶识别位点包括，但不限于，对于金属羧基肽酶或金属内肽酶的识别位点。说明性的蛋 白酶和蛋白酶识别位点如下表1所示。
[0078] 表1.说明性的蛋白酶和蛋白酶识别位点（*表示水解的肽键）
[0079]

【权利要求】
1. 纳米等离子体激元共振器，包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘，具有结合或束缚到 所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。
2. 权利要求1的共振器，其中所述标记物是用于表面增强拉曼散射（SERS)检测的拉曼 活性标记物。
3. 权利要求1的共振器，其中所述标记物是荧光或其它能检测的标记物。
4. 权利要求1的共振器，其中所述纳米盘包括金属薄层、半导体材料、金属多层、金属 氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料。
5. 权利要求4的共振器，其中所述纳米盘由金属组成。
6. 权利要求1的共振器，其中所述屏蔽层包括具有恒定拉曼光谱的材料。
7. 权利要求6的共振器，其中所述屏蔽层选自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
8. 权利要求1的共振器，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述 肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
9. 权利要求1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
【文档编号】G01N33/68GK104155282SQ201410331906
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2008年11月3日 优先权日:2007年11月2日
【发明者】陈帆青, 乔纳森.A.埃尔曼, 张祥, 孙诚, 苏凯宏, 韦齐和 申请人:加利福尼亚大学董事会