专利名称：ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用，它属于医学免疫学 诊断技术领域，具体是关于ELISpot结核感染诊断试剂盒及其在结核菌感染 检测中的应用。
技术背景在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋 病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结 核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新 增结核病人800 1000万，每年死亡人数约300万。1993年世界卫生组织(WHO) 史无前例地宣布"全球结核病紧急状态"，1998年又重申遏制结核病的行动刻不 容缓。我国的结核病疫情和结核菌感染情况都相当严重，是全球22个结核病高负 担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病 流行病学抽样调査初步结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病 人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，在传染病中 居第一位。面对这种严峻的形势，结核病的预防和控制已引起国内外政府及学者 的高度重视。因此，结核病的早期诊断、鉴别诊断和流行病学调查对结核病的早 期、有效化疗和控制结核菌传播都有极其重要的意义。机体的抗结核免疫主要是细胞免疫应答。旧结核菌素、纯蛋白衍化物(PPD) 是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，其作用于人体会激发已致敏机体产生细胞免疫反 应，激活T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞 增殖、聚集，包裹抗原形成结节，这就是迟发型变态(DTH)反应，其反应强度 与细胞免疫呈平行关系。旧结核菌素不易标准化和易发生非特异性反应，目前已 经很少使用。PPD皮肤试验己成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染 诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，中国一直使用硬结》5mm为 阳性，》20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童》15mm 为强阳性的标准。但由于PPD中含有许多分枝杆菌(包括致病性分枝杆菌、环境 中非致病性分枝杆菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染，还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏，诊断的特异性差，只能根据皮肤的反应强弱辅助诊断，其灵敏度只有70-80 %。1983年建立的酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked I咖unospot ，简称 ELISPOT)技术具有高度的敏感性和应用的广泛性，已成为近年来最吸引人的免 疫监测候选方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等多个方面得到广 泛应用。ESAT6和CFP10蛋白由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌 基因组的RD1区域编码，但所有卡介苗菌株及绝大部分环境分枝杆菌基因组均丢 失该区域，不表达ESAT6和CFP10蛋白，这两个蛋白均含有多个T淋巴细胞抗原表 位，其蛋白或多肽可作为T细胞刺激抗原。结核感染者或结核病患者外周血中T淋 巴细胞在结核特异性抗原的激活下，可释放不同水平的Y干扰素，与正常人或非 结核患者具有显著差异。英国牛津免疫技术公司应用ELISpot技术研发了一个T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒，是通过ESAT6多肽和CFP10多肽分别刺激 外周血中T淋巴细胞，然后检测分泌IFN-Y的外周血T淋巴细胞。该实验不受卡介 苗接种和环境分枝杆菌感染的影响，其检测的灵敏度和特异性高，但其采用2种 抗原的一系列合成多肽作为刺激抗原，使试剂盒的成本高，检测费用高，而难以 广泛推广应用。本发明与其不同，是采用结核分枝杆菌特异性CFP10—ESAT6融合 抗原刺激受检者外周血T淋巴细胞，使其分泌特异性IFN-Y ，然后通过ELISpot检 测，整个过程需2天时间，可了解受检者是否感染结核菌，并辅助结核病诊断。 其检测结核菌感染的灵敏度和特异性均显著高于PPD皮试法，与英国的T SPOT-TB 相当，但其CFP10—ESAT6融合抗原为基因工程重组蛋白，制备简便、价廉，并使 检测孔数减少，检测费用较低。 发明内容本发明的目的之一是为克服已有技术的不足，提供灵敏度高、特异性强的重 组融合蛋白抗原作为细胞刺激剂，组成ELISpot结核感染诊断试剂盒，用于检测 外周血中分泌结核特异性IFN-Y的T淋巴细胞，提高结核感染检测的灵敏度和特 异性，辅助结核病的诊断和鉴别诊断。本发明的目的是通过以下技术方案达到的—种ELISpot结核感染诊断试剂盒，含有96孔滤膜板、IFN-r捕获抗体、牛 血清白蛋白(BSA) 、 CFP10—ESAT6融合蛋白、生物素标记的IFN-r检测抗体、亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3』引哚磷酸，其特征在 于所述CFP10—ESAT6融合抗原的氨基酸序列如下AAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATEL丽ALQNLARTISEAGQAMASTEGNVT GMFA。本发明的另一 目的是提供ELISpot结核感染诊断试剂盒在检测结核感染的应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的一种ELISpot结核感染诊断试剂盒在检测结核感染的应用，其特征在于，包 括以下步骤(一) 、包被(1) 96孔滤膜板中加入1 : 60稀释的IFN-r捕获抗体100pL/孔，加盖，37'C孵 育l一2h或4'C过夜；(2) 弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；(3) 每孔加200 nL含l^一3X牛血清白蛋白的PBS，加盖，37。C孵育l一2h;(4) 弃上清液，将板直接用于检测；或放于密封袋中，置4'C保存，l周内使 用；(二) 、检测(1) 取4-5ml血液加入含肝素钠或柠檬酸钠的采血管，在采集血液后颠倒 混匀5次以上，得到抗凝血；(2) 实验前将含抗凝血的釆血管颠倒混匀5次以上避免血液分层，按1:1-1:3的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面, 在室温下2000-3000rpm离心20-30min;(3) 可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸 取淋巴细胞层至一干净的离心管中；(4) 加入8ml预热至37'C的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000rpm离 心10min;(5) 弃去上清培养液，加入6ml预热至37'C的无血清1640培养液重悬沉淀细胞，于室温1500rpm离心8min;(6) 弃去上清洗液，加入400^il预热至37。C的含10^小牛血清的1640培养液 重悬沉淀细胞，取10 pl细胞悬液加入40pl台酚蓝，取10pl台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37"C的含10X 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl(^细胞/ml;(7) 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50 pl培养液至每个阴性对 照孑U 50 pl 60pg/mL的植物血凝素至每个阳性对照孑L; 50 pl 30pg/mL至12(^g/mL 的CFP10—ESAT6融合蛋白至每个检测孔；(8) 每孔加入10(Hil细胞悬液；(9) 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。C、 5%C02培养18—24小时；(10) 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板 后鬼干；(11) 在每个孔中加入IOO pl用含l一3X牛血清白蛋白的PBS稀释成1:60的 生物素标记的IFN-r检测抗体，置37。C孵育1小时；(12) 孵育后用PBS洗板3次，3min/次，洗板后甩干，加入IOO pl用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37。C孵育2小时；(13) 每孔加入100pl底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-n引哚磷酸，放置于室温 闭光显色；(14) 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，室温下过夜或37。C烤箱中2-3 小时烘干96孔滤膜板；(15) 使用放大镜或倒置显微镜计数每个反应空孔中紫色的斑点，每一个点 代表一个分泌Y干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验 结果进行扫描和分析；(16)结果判定如果阴性对照孔斑点数为0 — 5个斑点，检测孔斑点数减 去阴性对照孔斑点数26判定为阳性；如果阴性对照孔斑点数26个斑点，测试孔斑 点数必须22倍的阴性对照孔斑点数才判定为阳性。本发明的特点及技术效果本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核 分枝杆菌重组CFP10-ESAT6融合蛋白，作为细胞刺激剂，制备ELTSpot结核感染诊断试剂盒。而现有技术则无此类抗原试剂盒。英国牛津免疫技术公司应用 ELISpot技术研发的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒，是通过ESAT6多肽和CFP10多肽分别刺激外周血中T淋巴细胞，然后检测分泌IFN-y的外周血 T淋巴细胞。该试剂盒采用2种抗原的一系列合成多肽作为刺激抗原，而且需用 2个检测孔，使试剂盒的成本高，检测费用高，而难以广泛推广应用。本发明与 其不同，是采用结核分枝杆菌特异性CFP10—ESAT6融合蛋白刺激受检者外周血 T淋巴细胞，使其分泌特异性IFN-y，然后通过ELISpot检测，整个过程需2天 时间，可用于结核病细胞免疫诊断，了解受检者是否感染结核菌，并辅助结核病 诊断和鉴别诊断。本发明检测结核菌感染的灵敏度和特异性均显著高于PPD皮试 法，灵敏度高于英国的T SPOT-TB试剂盒，特异性与英国的T SPOT-TB相当。 本发明的关键试剂结核分枝杆菌CFP10—ESAT6融合蛋白是通过基因工程技术 克隆、筛选高表达的基因工程菌株表达、纯化所获得，制备简便、价廉，可大规 模生产，成本相对较低，而且只需1个检测孔，检测费用较低。CFP10—ESAT6 融合蛋白在CFP10和ESAT6的氨基酸之间连接了一段由12个甘氨酸和3个丝氨 酸组成的连接臂，使CFP10—ESAT6融合蛋白中的CFP10和ESAT6肽段能保持 相对独立的空间构象，能更好地曝露CFP10和ESAT6各自的抗原决定簇，维持原有蛋白特异的抗原性。下面通过附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发 明保护范围的限制。


图1为对比例1应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测志愿者 李某的结果。图2为本发明的CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果。 图3为本发明的CFP10-ESAT6基因工程菌超声破碎后的上清液和包涵体的 SDS-PAGE结果。图4为本发明的纯化的CFP10-ESAT6融合蛋白的SDS-PAGE结果。 图5为本发明实施例1中应用ELISpot结核感染诊断试剂盒检测志愿者李某 的结果。图6为对比例2应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测王某的 结果。图7为本发明实施例2中应用ELISpot结核感染诊断试剂盒检测王某的结果。 图8为对比例3中应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测吴某 的结果。图9为本发明实施例3中应用ELISpot结核感染诊断试剂盒检测吴某的结果。 图10对比例4中应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测章某的结果。图11为本发明实施例4中应用E:LISpot结核感染诊断试剂盒检测章某的结果。
具体实施方式
具体实施方式
对比例l采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒和 PPD皮肤试验检测来自解放军总医院第二附属医院健康的志愿者李某，男，25岁。一、 采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂 盒进行检测1. 人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养抽取志愿者李某静脉血4ml， 放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离 心20分钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37。C的无血清1640培养液， 混悬后，于室温2000rpm离心10min;重复l次；弃去上清液，加入400ri预热至37'C 的含10%小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数后，用含10%小牛血 清的1640培养液调整细胞至2xl()e细胞/ml。2. 在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50 iiL无血清培养液；在阳性对照 孔内加入50 wL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌混合多肽A;在B测试 孔内加入结核杆菌混合多肽B。3. 每份样品在阴性对照、阳性对照、测试孔A和测试？LB内分别加入IOO uL含有2xl()5个外周单核细胞。4. 将96孔滤膜板放入5% C02培养箱在37。 C培养18小时。5. 每孔加入200 y LPBS洗板4次。6. 加入50 u L新鲜配制的工作浓度标记抗体。7. 在4 ° C孵育60分钟。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 y L氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物液。10. 室温避光反应7分钟。11. 用双蒸水洗漆细胞培养孔。12. 将板放在37。 C烘箱中干燥。13. 将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行 扫描和分析。14. 结果显示检测孔A和检测孔B的斑点数均为1，为阴性，说明无结核菌感 染，见图l。图1中的数字表示96孔滤膜板中的酶联免疫斑点数目(下同)。二、 PPD皮肤试验1. 吸取结核PPD试剂O.lml，皮内注射于志愿者李某前臂掌侧中央；2. 注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径，并记录有 无异常反应；3. 结果皮肤反应硬结平均直径〈5mra，为阴性反应，说明无结核菌感染。 实施例1一、 一种ELISpot结核感染诊断试剂盒的制备方法(一)通过基因工程技术制备CFP10—ESAT6融合蛋白1、 引物设计与合成 cfplO引物设计Pl(上游)5， -CCGGATCCATGGCAGAGATGMGAC-3， P2(下游)5' -GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACC GMGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3 ， 扩增片段353 bp esat6引物设计 P3(上游)5' -GGTGGCGGTGGMGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGMTTTCGCGG-3' P4(下游)5， -CC AAGCTTTGCGAACATCCCAGTGA-3， 扩增片段338bp2、 PCR扩增cfp10和esat6基因分别用Pl、 P2和P3、 P4引物，在Taq plti s I DNA聚合酶的作用下，以 结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增CFP10和ESAT6基因。PCR反应程 序95°C 5min; 94°C 20sec， 60°C 20sec， 72°C 2min，循环25次；最后72°C 延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定353 bp (cfp10)、 338bp (esat6)的扩增 DNA片段；回收这2个片段，分别取lul回收片段作为模板，以P1和P4为引 物扩增，于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定681bp的扩增咖A片段。3、 回收目的基因片段琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切 下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的 说明书回收目的基因片段，具体方法如下向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加 入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出 注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排 出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器 插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用 力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新 的1.5ral离心管拧紧，向离心柱中加入150WII型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1. 5ml离心管拧紧，向 离心柱中加入40W TE缓冲液，静置一分钟，12，000rpm离心20s;回收DNA洗 脱液，定量，浓度约为50ng/W。贮存于-2(TC备用。4、 目的基因与pGEM-T载体连接参照Promega公司pGEM-T vector System- I产品说明，将50ng纯化后的 PCR产物与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合， 10 ul反应体系如下2X连接缓冲液 5H1pGEM-T载体PCR产物 0. T4 DNA连接酶 1W无菌水补至 10 w混匀后置于4'C冰箱反应12h， 75'C灭活10min，冰浴后直接进行转化。 5.大肠杆菌DH5a和大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞的制备 挑取大肠杆菌DH5a (或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37。C振 荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37'C 振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h,待菌浓度OD柳为0.6-0.8时，放入用冰 预冷的大离心管中，于4°C、 4000rpra、离心10min，弃上清；20 ml冰预冷的 0. lmol/LCaQ2重悬菌沉淀，冰浴30min; 4。C、 6000rpm、离心10min，弃上清； 用4ml 0. lmol/L CaC12重悬菌沉淀，置4'C冰箱放置过夜；次晨加入1 ml无菌 甘油，吹打混合均匀，每分装于一个1. 5ml的离心管中，置-70'C保存备用o° 6.连接产物的转化将目的基因片段与PGEM-T的连接产物各分别加入含有大肠杆菌 DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱热休克90s，迅速取 出冰浴2 min;加入LB培养液400W， 37'C恒温摇床培养1 h;加入X-Gal 60W， IPTG 414，混匀，取出200—400W涂布于含有60ii g/ml氨苄青霉素的LB平板 上。倒置平板，放37'C恒温培养箱培育14 h。 7.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落5个，分别接种于5 ml含有60Pg/ml 氨苄青霉素的LB培养基中，置37。C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方 法，小量提取质粒。(1) 质粒小量提取试剂的配制 溶液I : 50 ramol/L葡萄糖25隨1/L Tris CL ( pH 8. 0 ) 10咖ol/L EDTA ( pH 8. 0 )在10 lbf/in2 ( 6.895X104 Pa )高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于rc备用。溶液II: 0.2 mmol/L NaOH， 1% SDS 临用前配制 溶液III: 5 mol/L乙酸钾60 iml 冰乙酸 11.5 ml去离子水 28. 5 ml' 贮存于4。C,备用。(2) 小量提取质粒分别取约3.0 ml菌液置离心管中，于12， OOOrpm离心1 min，弃上清；细 菌沉淀重悬于200 W溶液I中，冰浴10min;加400 W新配制的溶液II ，冰浴 5 min;力H 300 W溶液III，冰浴10 min;于4'C 12， OOOrpm离心10 min;上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无 水乙醇充分混合，于-20'C放置2h沉淀DNA;于4。C 12， 000rpra离心10 min，弃 上清；用lml 70%乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20W TE缓冲 液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为2(Hig/ml，于37'C水浴30 min， 消化RNA;取2 进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置一20'C储存备用。8.鉴定重组质粒(1) PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，以Pl和P4引物进行 PCR扩增，扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，阳性重组质粒命名为 PGEM-CFP10-ESAT6。(2) 酶切鉴定取重组质粒5Ml，分别用限制性内切酶BamH I和Hind III 双酶切2h;于1%琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶 切后的片断与扩增片断一致。(3)序列测定直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。9. 重组表达质粒的构建用限制性内切酶BamH I及HindUI双酶切pGEM-CFP10-ESAT6重组质粒DNA 和表达载体pET28a质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶中电泳，切取630bp的CFP10-ESAT6 基因片段和5. 344kb的pET28a质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯 化。定量后，CFP10-ESAT6基因片段与pET28a质粒DNA片段按2 : 1的摩尔比混 合，在L DNA连接酶催化下，于16。C连接过夜，次日取连接产物转化大肠 杆菌DH5a感受态细胞，置37。C恒温箱孵育14h。挑选4个克隆分别转种于5ml 含50ng/nil硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37。C恒温振荡器培养过夜，用碱裂 解法提取质粒。10. 重组表达质粒的鉴定分别用牙签随机调取7个克隆，提取质粒，采用PCR扩增和双酶切鉴定方法 挑选重组子；鉴定正确的阳性克隆命名为pET28a-CFP10-ESAT6。 11、 pET28a-CFP10-ESAT6工程菌的诱导表达及鉴定将pET28a-CFP10-ESAT6质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，挑单克隆转种于 5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37'C恒温振荡器培养过夜，然 后按1%转种到10 ml含5(^g/ral硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37'C恒温振 荡器培养至0D6。。为0.6 — 0.8时，加入:[PTG，诱导3—4hr。将1X载样缓冲液15(mi加入来自linl菌液的沉淀样本二混悬后，置IOO'C 沸水浴5min，于12000rpm离心10 min,,取上清液40 Pl进行SDS-PAGE，电泳条 件为积层胶恒流lOmA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电 泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h;用脱色液脱色至条带清晰，观察是否有 目的蛋白表达条带。应用0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0和1.2mM浓度的IPTG诱导， pET28a-CFP10-ESAT6大肠杆菌工程菌的蛋白表达量无明显区别(见图2)。与对 照菌pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-CFPIO-ESAT6-BL21 (DE3)菌体在相对分子 质量28kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4h表达量最多。将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分进行SDS-PAGE,重组蛋白均出现 在破碎的上清中，沉淀极少，说明该重组蛋白主要以可溶性形式表达(图3)。图2中的1表示含pET-28a载体质粒的大肠杆菌IPTG诱导后；2 —8表示含 pET28a-CFPIO-ESAT6重组质粒的大肠杆菌IPTG诱导浓度分别为0. 1、 0. 2、 0. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2mM; 9表示蛋白分子量标准(175、 83、 62、 48、 33、 25、 17、 7kDa )。图3中的1表示含pET-28a质粒细菌IPTG诱导；2表示含 pET28a-CFPIO-ESAT6重组子细菌未诱导；3表示pET28a-CFP10-ESAT6重组子细 菌IPTG诱导；4表示CFPIO-ESAT6基因工程菌超声破碎后上清液；5、 6表示 CFPIO-ESAT6基因工程菌超声破碎后包涵体；7、 8表示纯化的CFPIO-ESAT6融合 蛋白；9表示蛋白分子量标准(175、 83、 62、 48、 33、 25、 17、 7kDa )。12. CFPIO-ESAT6重组蛋白的纯化采用Novagen公司生产的His. Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书直接纯 化CFPIO-ESAT6融合蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的CFPIO-ESAT6融合蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白(见图4)。图4中，1表示IPTG诱导的含pET-28a质粒的大肠杆菌；2表示IPTG诱导的含 pET28a-CFP10-ESAT6重组质粒的大肠杆菌；3表示未诱导的含pET28a-CFP10-ESAT6 重组质粒的大肠杆菌；4表示纯化的CFP10-ESAT6融合蛋白。 二、应用ELISpot结核感染诊断试剂盒进行检测采用本发明提供的ELISpot结核感染诊断试剂盒检测来自解放军总医院第二 附属医院健康的志愿者李某，男，25岁。 (一)包被1. 96孔滤膜板中加入l : 60稀释的IFN-r捕获抗体100Wy L，加盖，置 4'C过夜。2. 弃包被液，无菌PBS洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含1X牛血清白蛋白的PBS，加盖，37。C孵育l h。4. 弃上清液，将板直接用于检测。1. 取4ml血液加入含肝素钠的釆血管，在采集血液后和实验前颠倒混匀5次 以上避免血液分层；2. 按l:l的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中， 形成明显界面，在室温下3000rpm离心20min;3. 可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞层至 一干净的离心管中；4. 加入8ml预热至37。C的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000 rpm离心 10min;5. 弃去上清培养液，加入6ml预热至37t:的无血清1640培养液重悬沉淀细胞， 于室温1500 rpm离心8min;6. 弃去上清洗液，加入400W预热至37t:的含10X小牛血清的1640培养液重 悬沉淀细胞，取IO W细胞悬液加入40W台酚蓝，取10W台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37'C的含10X 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl()6细胞/ml;7. 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50 W培养液至每个阴性对照 孔；50 Pl 60^/mL的植物血凝素至每个阳性对照孔；50 W 304g/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每个检测孔；8. 每孔加入100W细胞悬液；9. 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。 C、 5 % C02培养18小时。10. 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板后甩干；11. 在每个孔中加入100 W用含"/。牛血清白蛋白的PBS稀释成1:60的生物素 标记的IFN-r检测抗体，置37° C孵育l小时；12. 孵育后用PBS洗板3次，3min/次，洗板后甩干，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37° C孵育2小时；13. 每孔加入IOO W底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温 闭光显色；14. 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，置37° C烤箱中2小时烘干培养板； 15.将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。结果显示检测孔斑点数为3，为阴性，说明无结核菌感染，见图5。 对比例2采用英国牛津免疫技术公司的T SP0T-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检 测来自解放军总医院第二附属医院消化内科住院患者王某，女，36岁，住院号 241298，诊断幽门不完全梗阻。一采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒 进行检测1. 人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养抽取王某静脉血5ml，放入肝素 抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离心 20分钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37。C的无血清1640培养 液，混悬后，于室温2000rpm离心10min;重复l次；弃去上清液，加入400W 预热至37。C的含10X小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数 后，用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞至2><106细胞/1111。2. 在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50 uL无血清培养液；在阳性对照孔 内加入50 nL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌混合多肽A;在B 测试孔内加入结核杆菌混合多肽B。3. 每份样品在阴性对照、阳性对照、测试 LA和测试孔B内分别加入IOO uL 含有2xl()5个外周单核细胞。4. 将96孔滤膜板放入5% C02培养箱在37。 C培养24小时。5. 每孔加入200 ii LPBS洗板4次。6. 加入50 ixL新鲜配制的工作浓度标记抗体。7. 在4 ° C孵育60分钟。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 uL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。10. 室温避光反应7分钟。11. 用双蒸水洗涤细胞培养孔。12. 将板放在37。 C烘箱中干燥。13. 将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行 扫描和分析。14.结果显示检测孔A和检测孔B的斑点数均为1，为阴性，说明无结核菌感染，见图6。 实施例2应用ELISpot结核感染诊断试剂盒进行检测采用本发明提供的ELISpot结核感染诊断试剂盒检测来自解放军总医院第二 附属医院消化内科住院患者王某，女，36岁，住院号241298，诊断幽门不完 全梗阻。(一) 包被1. 96孔滤膜板中加入1 : 60稀释的IFN-r捕获抗体100叱/孔，加盖，37°C 孵育lh;2. 弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含3X牛血清白蛋白的PBS，加盖，37。C孵育2h;4. 弃上清液，将板放于密封袋中，置4'C保存1天；(二) 检测1. 取5ml血液加入含肝素钠的采血管，在采集血液后和实验前颠倒混匀5次以上避免血液分层；2. 按1:3的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中， 形成明显界面，在室温下2500rpm离心25min;3. 可见外周血单核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴 细胞层至一干净的离心管中；4. 加入8ml预热至37。C的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000 rpm离心 10min;5. 弃去上清培养液，加入6ml预热至37'C的无血清1640培养液重悬沉淀细胞， 于室温1500 rpm离心8min;6. 弃去上清洗液，加入400W预热至37。C的含1()Q^小牛血清的1640培养液重 悬沉淀细胞，取IO W细胞悬液加入40W台酚蓝，取10W台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37'C的含10X 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl()6细胞/ml;7. 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50 W培养液至每个阴性对照 孔；50 W 60Pg/mL的植物血凝素至每个阳性对照孔；50 W 12(mg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每个检测孔；8. 每孔加入100W细胞悬液；9. 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。 C、 5 % C02培养24小时。10. 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板后甩干；11. 在每个孔中加入IOO W用含2X牛血清白蛋白的PBS稀释成1:60的生物素 标记的IFN-r检测抗体，置37° C孵育l小时；12. 孵育后用PBS洗板3次，3min/次，洗板后甩干，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37° C孵育2小时；13. 每孔加入IOO W底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温 闭光显色；14. 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，室温下过夜凉干96孔滤膜板；15. 将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。 结果显示检测孔斑点数为l，为阴性，说明无结核菌感染，见图7。 对比例3采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒和 结核PPD皮肤试验检测来自解放军总医院第二附属医院神经内科住院患者吴某， 男，81岁，住院号108764，诊断L脑梗塞；2.高血压病III级。一、 采用英国牛津免疫技术公司的T SP0T-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒进 行检测1. 人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养抽取吴永福静脉血4ml，放入肝 素抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离心20分 钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37。C的无血清1640培养液，混悬后， 于室温2000rpm离心10min;重复l次；弃去上清液，加入400W预热至37'C的含10 0%小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数后，用含10%小牛血清的 1640培养液调整细胞至2xl()e细胞/ml。2. 在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50 yL无血清培养液；在阳性对照孔 内加入50 uL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌混合多肽A;在B测试孔 内加入结核杆菌混合多肽B。3. 每份样品在阴性对照、阳性对照、测试孔A和测试孑LB内分别加入IOO uL 含有21105个外周单核细胞。4. 将96孔滤膜板放入5% C02培养箱在37。 C培养20小时。5. 每孔加入200ixLPBS洗板4次。6. 加入50 uL新鲜配制的工作浓度标记抗体。7. 在4° C孵育60分钟。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 UL底物液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。10. 室温避光反应7分钟。11. 用双蒸水洗涤细胞培养孔。12. 将板放在37。 C烘箱中干燥。13. 将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行 扫描和分析。H. 结果显示检测孔A的斑点数为44，检测孔B的斑点数为107，为阳性，说明 有结核菌感染，见图8。二、 PPD皮肤试验I. 吸取结核PPD试剂0. lml，皮内注射于吴某前臂掌侧中央；2. 注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径，并记录 有无异常反应；3. 结果皮肤反应硬结平均直径18mm，为阳性反应，说明有结核菌感染。 实施例3应用ELISpot结核感染诊断试剂盒进行检测采用ELISpot结核感染诊断试剂盒检测来自解放军总医院第二附属医院神经 内科住院患者吴某，男，81岁，住院号108764，诊断l.脑梗塞；2.高血压病 III级。(一) 包被1. 96孔滤膜板中加入1 : 60稀释的IFN-r捕获抗体100叱/孔，加盖，37'C 孵育2h;2. 弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含2X牛血清白蛋白的PBS，加盖，37。C孵育2h;4. 弃上清液，将板放于密封袋中，置4。C保存1周；(二) 检测1. 取4ml血液加入含肝素钠的采血管，在采集血液后和实验前颠倒混匀5次 以上避免血液分层；2. 按1:2的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中， 形成明显界面，在室温下3000rpm离心25min;3. 可见外周血单核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中；4. 加入8ml预热至37t:的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000 rpra离心 10min;5. 弃去上清ii养液，加入6ml预热至37。C的无血清1640培养液重悬沉淀细胞， 于室温1500 rpm离心8min;6. 弃去上清洗液，加入400W预热至37'C的含10X小牛血清的1640培养液重 悬沉淀细胞，取IO W细胞悬液加入40Pl台酚蓝，取10W台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37"的含10% 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl06细胞/ral;7. 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50 W培养液至每个阴性对照 孔；50 W 60Pg/mL的植物血凝素至每个阳性对照孔;50 W 60Pg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每个检测孔；8. 每孔加入100W细胞悬液；9. 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。 C、 5 % C02培养20小时。10. 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板后甩干；11. 在每个孔中加入IOO 14用含2X牛血清白蛋白的PBS稀释成1:60的生物素 标记的IFN-r检测抗体，置37° C孵育l小时；12. 孵育后用PBS洗板3次，3min/次，洗板后甩干，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37° C孵育2小时；13. 每孔加入IOO Pl底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温 闭光显色；14. 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，置37° C烤箱中3小时烘干96孔滤 膜板；15.将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。 结果显示检测孔斑点数为28，为阳性，说明有结核菌感染，见图9。 对比例4采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检 测来自解放军总医院第二附属医院结核2科住院患者章某，男，43岁，住院号 801202，诊断月市结核。采用英国牛津免疫技术公司的T SP0T-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒 进行检测1. 人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养抽取章某静脉血5ml，放入肝 素抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离心20分 钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37'C的无血清1640培养液，混悬后， 于室温2000rpm离心10rain;重复l次；弃去上清液，加入400W预热至37'C的含10 %小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数后，用含10%小牛血清的 1640培养液调整细胞至2xl0e细胞/ml。2. 在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50 HL无血清培养液；在阳性对照 孔内加入50 uL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌混合多肽A;在B测试 孔内加入结核杆菌混合多肽B。3. 每份样品在阴性对照、阳性对照、测试孔A和测试孔B内分别加入IOO y L含有2xl()5个外周单核细胞。4. 将96孔滤膜板放入5% C02培养箱在37。 C培养22小时。5. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。6. 加入50 u L新鲜配制的工作浓度标记抗体。7. 在4 ° C孵育60分钟。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 uL氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物液。10. 室温避光反应7分钟。11. 用双蒸水洗涤细胞培养孔。12. 将板放在37。 C烘箱中干燥。13. 将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行 扫描和分析。14. 结果显示检测孔A的斑点数为66，检测孔B的斑点数为ll，为阳性，说 明有结核菌感染，见图io。实施例4应用ELISpot结核感染诊断试剂盒进行检测采用ELISpot结核感染诊断试剂盒检测来自解放军总医院第二附属医院结核 2科住院患者章某，男，43岁，住院号801202，诊断肺结核。(一)包被-1. 96孔滤膜板中加入l : 60稀释的IFN-r捕获抗体100叱/孔，加盖，置 4'C过夜。2. 弃包被液，无菌PBS洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含3X牛血清白蛋白的PBS，加盖，37。C孵育l h;4. 弃上清液，将板放于密封袋中，置4'C保存1天； (二)检测1. 取5ml血液加入含肝素钠的采血管，在釆集血液后和实验前颠倒混匀5次以上避免血液分层；2. 按1:2的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中， 形成明显界面，在室温下3000rpm离心30min;3. 可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞层至 一干净的离心管中；4. 加入8ml预热至37。C的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000 rpm离心 10min;5. 弃去上清培养液，加入6ml预热至37'C的无血清1640培养液重悬沉淀细胞， 于室温1500 rpm离心8min;6. 弃去上清洗液，加入40(^1预热至37°(:的含10%小牛血清的1640培养液重 悬沉淀细胞，取IO W细胞悬液加入4(Htl台酚蓝，取10W台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37匸的含10% 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl()6细胞/ml;7. 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50 W培养液至每个阴性对照 孔；50 W 60Hg/mL的植物血凝素至每个阳性对照孔；50 Pl 100Pg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每个检测孔8. 每孔加入100W细胞悬液；9. 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。 C、 5 % C02培养22小时。10. 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板后甩干；11. 在每个孔中加入IOO W用含3X牛血清白蛋白的PBS稀释成1:60的生物素 标记的IFN-r检测抗体，置37° C孵育l小时；12. 孵育后用PBS洗板3次，3min/次，洗板后甩干，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37° C孵育2小时；13. 每孔加入IOO W底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温 闭光显色；14. 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，置37° C烤箱中2小时烘干培养板; 15.将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。 结果显示检测孔斑点数为42，为阳性，说明有结核菌感染，见图ll。
权利要求
1. 一种ELISpot结核感染诊断试剂盒，含有96孔滤膜板、IFN-r捕获抗体、牛血清白蛋白(BSA)、CFP10-ESAT6融合蛋白、生物素标记的IFN-r检测抗体、亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，其特征在于所述CFP10-ESAT6融合抗原的氨基酸序列如下MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGGSGGGGSMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA。
2、 一种ELISpot结核感染诊断试剂盒在检测结核感染的应用，其特征在于， 包括以下步骤(一) 、包被(1) 96孔滤膜板中加入1 : 60稀释的IFN-r捕获抗体100pL/孔，加盖,37r孵 育1—2h或4X:过夜；(2) 弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，3min/次；(3) 每孑L加200nL含1^—3X牛血清白蛋白的PBS,加盖，37。C孵育1 —2h;(4) 弃上清液，将板直接用于检测；或放于密封袋中，置4'C保存，l周内使 用；(二) 、检测(1) 取4-5ml血液加入含肝素钠或拧檬酸钠的采血管，在釆集血液后颠倒 混匀5次以上，得到抗凝血；(2) 实验前将含抗凝血的采血管颠倒混匀5次以上避免血液分层，按1:1-1:3 的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面, 在室温下2000-3000rpm离心20-30min;(3) 可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾状层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中；(4)加入8ml预热至37'C的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000rpm离心10min;(5) 弃去上清培养液，加入6ml预热至37'C的无血清1640培养液重悬沉淀细 胞，于室温1500rpm离心8min;(6) 弃去上清洗液，加入400nl预热至37。C的含10X小牛血清的1640培养液 重悬沉淀细胞，取IO nl细胞悬液加入40pl台酚蓝，取10pl台酚蓝混合细胞液加入 血球计数板，在显微镜下计数，计数每ml悬液细胞数量，用预热至37'C的含10X 小牛血清的1640培养液稀释细胞悬液至2xl()S细胞/ml;(7) 在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂50pl培养液至每个阴性对 照孔；50pl60pg/mL的植物血凝素至每个阳性对照孔；50 pl 30吗/mL至120吗/mL 的CFP10—ESAT6融合蛋白至每个检测孔；(8) 每孔加入100pl细胞悬液；(9) 将96孔滤膜板放入湿润的培养箱在37。C、 5%C02培养18—24小时；(10) 将96孔滤膜板取出，弃培养上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板后甩干；(11) 在每个孔中加入ioo h1用含1一3X牛血清白蛋白的pbs稀释成1:60的 生物素标记的IFN-r检测抗体，置37。C孵育1小时；(12) 孵育后用PBS洗板3次，3mirV次，洗板后甩干，加入IOO pl用PBS 1:1000 倍稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，置37。C孵育2小时；(13) 每孔加入100nl底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温 闭光显色；(14) 在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，室温下过夜或37。C烤箱中2-3 小时烘干96孔滤膜板；(15) 使用放大镜或倒置显微镜计数每个反应空孔中紫色的斑点，每一个点 代表一个分泌Y干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析；(16)结果判定如果阴性对照孔斑点数为0 —5个斑点，检测孔斑点数减 去阴性对照孔斑点数26判定为阳性；如果阴性对照孔斑点数26个斑点，测试孔 斑点数必须22倍的阴性对照孔斑点数才判定为阳性。
全文摘要
本发明涉及一种ELISpot结核感染诊断试剂盒及其应用，采用基因工程技术从结核分枝杆菌克隆、表达、纯化获得CFP10-ESAT6融合蛋白抗原，作为结核特异的细胞刺激剂用于刺激受检者外周血T淋巴细胞，使其分泌特异性IFN-γ，然后通过ELISpot检测，整个过程需两天时间。利用本发明，根据产生的蓝紫色斑点数用肉眼或用仪器判读结果，可用于检测受检者是否感染结核菌，辅助结核病诊断和鉴别诊断。
文档编号G01N33/543GK101221173SQ20071006269
公开日2008年7月16日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者吴雪琼, 张俊仙, 娟 李, 李峤坷, 艳 梁, 阳幼荣 申请人:中国人民解放军总医院第二附属医院