一种血清不饱和铁结合力检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其中试剂1、试剂2中的各组分及浓度范围为：试剂1：碱性缓冲液pH7.5～90.1-1.0mol/L过量铁离子1～5mmol/L表面活性剂0.1％-1.0％去干扰剂0～100mmol/L水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐0～200mmol/L防腐剂0～1.0％；试剂2：酸性缓冲液pH1.0～6.0 0.05-0.5mol/L抗坏血酸0～500mmol/L稳定剂0～100mmol/L表面活性剂0.1％～1.0％防腐剂0～1.0％；上述试剂盒中还包括在试剂1中或在试剂2中的色原0.1～30mmol/L。本发明具有可显著缩短显色时间并提高试剂检测血清不饱和铁结合力的准确度、精密度，显色后稳定时间长的优点。
【专利说明】一种血清不饱和铁结合力检测试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检验【技术领域】，具体涉及一种用于血清不饱和铁结合力测定的检 测试剂盒。

【背景技术】
[0002] 人体含铁量约4g，其中2/3存在于红细胞血红蛋白中，其余1/3则储备在肝、脾 和骨髓中，有Fe2+和Fe3+两种形式，血清中的Fe3+全部与转铁蛋白结合。转铁蛋白又称 为运铁蛋白（Transferrin，TRF)，负责运输体内由消化管吸收的铁和由红细胞降解的铁， 以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。通常血清中只有1/3的转 铁蛋白与铁结合，其余2/3未结合，转铁蛋白这种潜在的结合铁的能力称为不饱和铁结 合力UIBC(UnsaturatedIronBindingCapacity),能结合的最大铁量称为总铁结合力 TIBC(TotalIronBindingCapacity),等于血清铁与不饱和铁结合力之和。TIBC测定可用 于辅助临床疾病诊断，如缺铁性贫血、急性肝炎等疾病会引起TIBC增高，肝硬化、肾病、尿 毒症、慢性感染、白血病及遗传性转铁蛋白缺乏症等则会引起TIBC降低。TIBC亦可间接反 映转铁蛋白的水平，有重要的临床意义。
[0003] 总铁结合力（TIBC)、不饱和铁结合力（UIBC)的测定，根本上是基于血清中铁的测 定，即先将转铁蛋白用过量铁标准溶液饱和后，再通过测定体系中的铁来得到。
[0004] 血清铁的测定方法有原子吸收法、电化学法、比色法等。原子吸收法与电化学法虽 样品用量少，分析时间短，但因需要专门的测试仪器，且价格昂贵，应用范围有限，目前在临 床实验室广泛使用的是比色法。临床血清铁比色法测定原理：在酸性条件下使Fe3+与转铁 蛋白解离，并加入还原剂（例如羟胺、抗坏血酸、巯基乙酸、肼等）将Fe3+还原成Fe2+，再用 一种能与亚铁离子络合的色原去络合亚铁离子，然后进行比色测定。临床广泛使用的色原 有亚铁嗪、呋喃三嗪二钠盐（ferene)、红菲绕啉（BPZ)、三吡啶基三啉（TPZ)等。
[0005] 传统TIBC测定是在碱性条件（pH8. 0?8. 9)下，向血清中加入过量的Fe3+标准 溶液，使转铁蛋白饱和，剩余的未结合的铁加轻质碳酸镁（也可用其他吸附剂如铁交换树 月旨、氧化铝柱或磁珠等）吸附，然后离心沉淀除去，取上层血清，按血清铁测定铁含量，即为 总铁结合力。该法要除去多余的铁，需沉淀、离心等手工操作，样本需用量大，处理繁琐耗时 长，不适于临床大量样本检测和自动化。
[0006] Hachiro Yamanishi (Clinical Chemistry, 2002:1565-1570)报道了用3试剂法直 接测定血清总铁结合力，不用除去饱和转铁蛋白多余的铁，简化了测定步骤，具有重要的临 床意义，但因3试剂需用特殊加样功能的全自动生化仪，不能在一般生化仪上使用而限制 了发展；专利CN101226152介绍了一种直接测定血清总铁结合力的试剂方法。
[0007] 目前发展比较成熟的是计算法，即由不饱和铁结合力加上血清铁计算总铁结合 力，市场上已开发有血清铁和不饱和铁结合力检测试剂盒，可以在自动生化仪上进行快速 测定。不饱和铁结合力测定原理：向血清样本中加入含过量铁离子的碱性缓冲液，使未与铁 结合的转铁蛋白全部与铁离子结合，剩余的铁离子在还原剂、显色剂作用下生成有色物质， 在特定波长下测定吸光度，计算缓冲液中铁离子的减少量即为血清的不饱和铁结合力。
[0008]目前最广泛使用的还原剂为抗坏血酸（维生素C)，可使Fe3+还原为Fe2+，因抗 坏血酸在溶液状态下不稳定、易分解，试剂中常需加入其他具有维持VC稳定性的物质，US patent5420008中除VC外，还添加巯基乙酸、硫代苹果酸、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、 β-巯基乙醇、β-巯基丙酸、还原型谷胱甘肽、DTT等含巯基的还原性物质或盐酸羟胺来 保持VC的稳定性；专利文献JP49092219A、5903M68B中提到使用偏磷酸盐、N-乙酰半胱 氨酸、亚硫酸盐有利于维持抗坏血酸溶液的稳定，在室温下储存4周后保存约80% ;N-乙 酰半胱氨酸并添加亚硫酸盐，可稳定10天JP6247855A中采用焦亚硫酸钠作为稳定剂； CN201110233022中综合专利文献中添加还原性稳定物质并代替巯基类化合物得到一种无 不良气味、稳定性好的测定血清不饱和铁结合力试剂。
[0009] 转铁蛋白与铁的结合是可逆的，在pH7. 5?9条件下，二者结合很稳定，在酸性 条件或pH>9时，转铁蛋白会与铁解离，因此测定血清不饱和铁结合力的测定试剂组分为： pH7. 5?9的碱性缓冲液、过量铁离子（硫酸铁、氯化铁、硫酸铁铵、硫酸亚铁铵、氯化亚铁 等）、强还原剂及色原。以往专利文献中配制PH7. 5?9的碱性缓冲液多为Tris缓冲液、 三乙醇胺缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等，这些缓冲液与铁离子都有一定的结合能 力，加入还原剂和色原后显色时间较长，但显色后稳定时间有比较短，造成检测的准确度和 精密度不理想，不利于临床检测应用。


【发明内容】

[0010] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种可显著缩短显色时间并提高试剂检测 血清不饱和铁结合力的准确度、精密度，显色后稳定时间长的血清不饱和铁结合力测定试 剂盒。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明的血清不饱和铁结合力测定试剂盒，由试剂1和 试剂2组成，其中试剂1包括含过量铁离子（水溶性盐）的碱性缓冲液、表面活性剂、去干 扰剂、防腐剂，试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂、表面活性剂。
[0012] 另色原亦是试剂的重要组成成分，可与亚铁离子络合生成有色物质，呈色稳定，在 特定波长下有特定的吸光度，所述色原可包括在试剂1中，也可添加在试剂2中，择一添加。
[0013] 具体的，本发明的血清不饱和铁结合力测定试剂盒，其中试剂1、试剂2各组分及 浓度范围为：
[0014]试剂 1 :碱性缓冲液（ρΗ7· 5 ?9) 0· 1-1.Omol/L
[0015] 过量铁离子（水溶性盐）1?5mmol/L
[0016] 表面活性剂0· 1% -1. 0%
[0017]去干扰剂0?100mmol/L
[0018] 水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐0?200mmol/L
[0019] 防腐剂0?1. 0%(质量百分比）；
[0020] 试剂 2 :缓冲液（pHL0 ?6. 0) 0· 05-0. 5mol/L
[0021]抗坏血酸0?SOOmmol/T,
[0022]稳定剂0?10Ommol/T,
[0023] 表面活性剂0· 1%?1. 0%(质量百分比）
[0024] 防腐剂0?I. 0%(质量百分比）；
[0025] 上述试剂盒中还包括在试剂1中或在试剂2中的色原0. 1?30mmol/L。
[0026] 本发明的上述试剂盒中的试剂可以是干粉状态，使用前加水溶解混匀后使用；也 可以是液体试剂，直接使用。
[0027] 本发明试剂1中所述碱性缓冲液可以是乙酸、巴比妥酸、邻苯二甲酸、羟基乙酸、 α-羟基丁酸、甘氨酸、乳酸、甘油酸、羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦杏仁酸中的一 种与氢氧化钠或氢氧化钾加水配合形成ΡΗ7. 5?9的缓冲液；或上述酸中一种的碱金属盐 或上述酸中的一种与Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、乙醇胺缓冲液、硼砂缓冲液或磷酸盐 缓冲液配合后调节ΡΗ7. 5?9构成的缓冲液。
[0028] 本发明试剂1中过量铁离子为由硫酸铁、氯化铁、硫酸亚铁铵、硫酸铁铵、硫酸亚 铁、氯化亚铁、甘氨酸亚铁、甘氨酸铁、乳酸亚铁、次氮基三乙酸铁或次氮基三乙酸亚铁等中 的一种含铁化合物溶于水中构成水溶液添加到试剂1中；试剂1中的铁离子浓度范围在 1 ?5mmol/L〇
[0029] 本发明试剂1中所含的表面活性剂的浓度为0. 1 %?1.0%，为非离子表面活性 齐Ll，可消除血清样本中脂池的影响，如可选自Tween系列（Tween20、Tween40、Tween60、 Tween8O等中的一种）、TritonX系列（如TritonX-IOO等）、Brij系列（如Brij35、Brij9〇 等）中的一种或几种，其中对液体类表面活性剂所述浓度为体积百分比浓度，固体类表面 活性剂为质量百分比浓度。
[0030] 试剂1中的去干扰剂可选硫脲、氨基硫脲、N，N-二甲基硫脲、异硫脲等中的一种， 优选硫脲，浓度范围l-60mmol/L，主要作用是消除血清中铜离子的影响。
[0031] 另试剂1中加入的水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐，优选碱金属碳酸盐或碱金属 碳酸氢盐，如钠盐或钾盐等，浓度范围优选为30?150mmol/L。
[0032] 试剂2选用pHl. 0?6. 0的酸性缓冲液，有利于保持抗坏血酸的稳定性，优选醋酸 缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐或磷酸盐-盐酸缓冲液、邻苯二甲 酸-盐酸缓冲液等中的一种。
[0033] 试剂2中的表面活性剂可以选用Tween系列（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80 等）、TritonX系列（如TritonX-IOO等）、Brij系列（如Brij35、Brij9〇 等）、Span系列等 非离子表面活性剂的一种或几种，其中对液体类表面活性剂所述浓度为体积百分比浓度， 固体类表面活性剂为质量百分比浓度。
[0034] 试剂2中的稳定剂为维持抗坏血酸的的稳定性，可以选用具有还原性的物质，如 盐酸羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中的一种或几种；或具有巯基的化合物如巯 基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸等中的一种或几种；或盐酸 羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中的一种或几种与上述具有巯基的化合物中的一 种或几种的结合；稳定剂浓度优选为l_80mmol/L。
[0035] 试剂1、试剂2中防腐剂可选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐 剂（如Pr〇clin300)、尼泊金酯类（如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲 酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯）等中的一种或几 种；防腐剂的浓度为质量百分比，优选为0.01-0.8%。
[0036] 本发明所述色原可以是3-(2-吡啶基）_5, 6-双苯磺酸）_1，2, 4-三嗪（亚铁嗪 Ferrozine)及其盐类，三吡啶基三啉（TPZ三吡啶基三嗪）、红菲绕啉（BPZ)、ferene等，可 选择加在试剂1中也可选择加在试剂2中，优选加在试剂2中（因试剂1中有过量铁离子 存在，显色剂若加入会有显色；而试剂2中没有铁离子，试剂颜色为显色剂颜色（不同于与 铁结合后颜色），浓度范围在0. 1?30mmol/L。
[0037] 本发明的抗坏血酸优选30-100mmol/L。
[0038] 以上所涉及的试剂或缓冲液均可通过商业渠道获得，或按照本领域常规方法进 行配制，其中所涉及到的技术术语和相关技术术语的缩写均按本领域通常理解。例如 TritonX-IOO表示聚乙二醇辛基苯基醚，Ferrozine表示亚铁嗪，Tris表示三轻甲基氨基甲 烷，Brij表示聚环氧乙烯月桂酰醚等。
[0039] 本发明的WBC测定试剂盒，测定方法为两点终点法，温度37°C，Rl:R2:样本= 200 :40 :20,其中Rl为试剂1，R2为试剂2,测定主波长（以色原为亚铁嗪为例）为570nm， 副波长为700nm。Rl加入样本或校准品后37°C孵育5min后，记录吸光度Al,然后加入R2 继续孵育5min后记录吸光度值A2.
[0040]WBC计算方法：
[0041]WBC浓度=(ΛA样本/ΛA校准）X校准品浓度
[0042] ΔA=A待测-A空白，A=Α2 -Al
[0043] 本发明的优点和有益效果：
[0044] 1.本发明采用在碱性条件下（pH7.5?9)测定"不饱和铁结合力"（UIBC)，原理 是：血清中转铁蛋白通常仅有1/3与铁结合，其余2/3则未结合；在碱性溶液中用过量铁离 子（一般是定量的）将2/3未结合的转铁蛋白饱和，用加进去的铁离子量减去剩下的铁离 子便是不饱和铁结合力（临床上是通过与WBC校准品比较就可以计算出样本的WBC值）； 需注意的是：碱性条件下，转铁蛋白与铁不会解离，另外在碱性测定条件下也不需要将其解 离；相对于专利CN101226152(直接测定血清总铁结合力的试剂方法）在酸性条件下，原理 不同；若在酸性条件下检测的话就需要转铁蛋白与铁解离完全，检测结果才能完全反应铁 离子的浓度，从而反应总铁结合力的浓度，所以该技术中需要加入解离剂（但解离剂的作 用是否有效不太清楚，因为在酸性条件pH〈4. 5下转铁蛋白与铁不能结合，二者就已经分开 解离了）。
[0045] 2.本发明采用含多羟基的有机酸或其碱金属盐来配制碱性缓冲液或在以上缓冲 液基础上调节pH，可明显加快显色时间，使显色反应在短时间内达到终点，并可以稳定保存 较长时间；另该种物质中含〇配位键，可与铁离子结合成较稳定的配合物，提高铁离子在碱 性缓冲液中的稳定性，从而提高试剂稳定性。

【专利附图】

【附图说明】
[0046] 图1不同浓度WBC的血清样本得到线性图。
[0047] 图240份临床血清样本，分别用实施例1试剂与日本和光公司HBC试剂进行检 测，得到的线性图（其中X轴代表和光UIBC检测结果，Y轴代表实施例1所测UIBC结果）。
[0048] 图3Tris缓冲液显色效果图（结果显示显色未达终，耗时较长）。
[0049] 图4用含羟基碱性缓冲液的显色效果图。

【具体实施方式】
[0050] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0051] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。
[0052] 比较例1

【权利要求】
1. 一种血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由试剂1和试剂2组 成， 其中试剂1、试剂2中的各组分及浓度范围为： 试剂1 :碱性缓冲液PH7. 5?9 0. 1-1. Omol/L, 过量铁离子l-5mmol/L， 表面活性剂0. 1% -1.0%， 去干扰剂〇?100mm〇l/L， 水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐0-200mmol/L， 防腐剂0-1.0% ; 试剂2 :酸性缓冲液pHl. 0?6. 0 0. 05-0. 5mol/L, 抗坏血酸0-500mmol/L， 稳定剂 0_100mm〇l/L， 表面活性剂0. 1% -1.0%， 防腐剂0-1.0% ; 上述试剂盒中还包括在试剂1中或在试剂2中的色原0. 1?30mmol/L。
2. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，所述的碱性 缓冲液为乙酸、巴比妥酸、邻苯二甲酸、羟基乙酸、羟基丁酸、甘氨酸、乳酸、甘油酸、羟基 丙二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或苦杏仁酸与氢氧化钠配合构成的PH7. 5?9的缓冲液；或 上述酸的碱金属盐或上述酸与Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、乙醇胺缓冲液、硼砂缓冲液 或磷酸盐缓冲液配合后调节PH7. 5?9构成的缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，所述的过量 铁离子为来自硫酸铁、氯化铁、硫酸亚铁铵、硫酸铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁、甘氨酸亚铁、甘 氨酸铁、次氮基三乙酸铁、次氮基三乙酸亚铁中的一种含铁化合物。
4. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂1中的表 面活性剂为Tween系列、TritonX系列或Brij系列中的一种或几种；试剂1中水溶性碳酸 盐或水溶性碳酸氢盐的浓度范围为30?150mmol/L。
5. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂2中的酸 性缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐、磷酸盐-盐酸缓 冲液或邻苯二甲酸-盐酸缓冲液中的一种。
6. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂2中的 稳定剂为盐酸羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或具有巯基的化合物中的一种或几 种；稳定剂浓度为l-80mmol/L。
7. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂1、试剂 2中的防腐剂为山梨酸钾或苯甲酸钠或亚硝酸钠或proclin系列防腐剂中的一种或尼泊金 酯类中的一种或几种；试剂1或2中的防腐剂浓度范围为0. 01-0. 8%。
8. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，所述的色 原是3-(2-吡啶基）-5, 6-双苯磺酸）-1，2, 4-三嗪及其盐类，三吡啶基三啉、红菲绕啉、 ferene中的一种，选择加在试剂1中或试剂2中。
9. 根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂2中的表 面活性剂为Tween系列、TritonX系列、Brij系列、Span系列中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的血清不饱和铁结合力检测试剂盒，其特征在于，试剂1中 的去干扰剂为硫脲、氨基硫脲、N，N-二甲基硫脲、异硫脲中的一种，去干扰剂的浓度范围为 1 -BOmmol /T,〇
【文档编号】G01N33/90GK104483494SQ201410805037
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】邹继华, 古咏梅, 吴立山 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司