专利名称：A+生物标志物的试验的制作方法
技术领域：
本发明简言之是关于抗体加(A+)生物标志物(biomarker)的试验，该试验用于检测和诊断受试者的癌症。
背景技术：
肿瘤相关抗原(TAAs)的分子鉴定已经清楚地证实人类的免疫系统能够与内源性产生的癌症细胞反应。参见van der Bruggen等(1991) Science254 1643-7。人类免疫系统中的胞内和体液手臂(humoral arms)均识别癌症细胞衍生出的TAA。参见Rosenberg SA (2001) Nature 411 :380-4 ；以及 Old 等(1998) J Exp Med 187 :1163-7。出于对人类癌症的血清学分析的特别兴趣，就要鉴定被存在于癌症患者血清中的抗体(Ab)识别的TAA。参见Sahin等.(1997) Curr Opin Immunol 9:709-16。抗体定义的TAA提供了体液免疫对自体肿瘤应答的分子细节。为了研究覆盖广泛的患有任何特定癌症患者中的抗体应答，需要大量的TAA。目前，表征循环的抗体主要应用两个策略(1)利用编码特异性TAA的噬菌体裂解物的传统的血清学检测；和(2)用纯化的重组蛋白作为抗原靶标的，基于酶联免疫法(ELISA)的方法。参见 Stone 等(2003) Int J Cancerl04 :73-84 ；以及 Tan 等(2005) N Engl J Med 353 观15-7。前一种方法需要大量的单独预先吸附有大肠杆菌噬菌体裂解物的血清，来降低背景；后一种方法是强有力的方法，但却需要纯化的由单独的TAA编码的蛋白。参见^iang等 (2003) Cancer Epidemiol Biomarker Prev 12 136—43 ；以及 Lagarkova 等(2003) Immunol Lett 85 :71-4o

发明内容
本发明提供了一种试验方法，该方法针对样品中至少一种抗体和至少一种第二生物标志物，所述抗体特异性结合第一生物标志物或者其抗原表位，该方法包括单一反应步骤，通过该步骤，针对所述抗体的第一捕获试剂和针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与样品接触，检测所述抗体的存在与否或数量；以及检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。本发明的这项试验可以用于诊断或指示受试者为患有疾病(affliction)或者可能患有疾病，该试验包括，当所述抗体的存与否或数量和所述第二生物标志物的存在与否或数量的组合表明疾病，则诊断或指示该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。在一些实施方式中，所述抗体的存在与否或数量被设定为第一值，而所述第二生物标志物的存在与否或数量被设定为第二值，第一值和第二值相结合从而给出指标值 (index value)，然后，该指标值被用作诊断和指示该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。在一些实施方式中，所述第一值被设为0，表示不存在所述抗体，被设为1表示存在所述抗体；所述第二值被设为0，表示正常数量的所述第二生物标志物，被设为1，表示非正常的高数量的所述第二生物标志物，或被设为0与1之间的数字，表示正常数量和非正常的高数量之间的所述第二生物标志物。在一些实施方式中，当所述第一值和所述第二值的加权值之和等于或大于给定数值，则该受试者被指示为患有该疾病。在一些实施方式中，逻辑回归分析用于计算基于所述第一值和所述第二值的指标值。在这些实施方式中，当所述指标值等于或大于给定数值，该受试者被确定为患有该疾病。在一些实施方式中，所述疾病是癌症，例如前列腺癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，甲状腺癌，膀胱癌，尿路上皮细胞癌，以及包括本领域已知的其它上皮癌等等。在一些实施方式中，所述癌症为前列腺癌，所述第一生物标志物是前列腺癌相关抗原，例如NY-ES0-1，MAGE-I, XAGE-Ib, SSX2，4，P53, MUC-I, CEA, S0X2, AMACR, p90 自身抗原(autoantigen)，LEDGFp75, HIP-I, p62 自身抗原，GRP78, TMPRSS2-ERG 融合物，等等， 以及它们的抗原决定表位，所述第二生物标志物为前列腺特异性抗原(prostate specific antigen)。在一些实施方式中，所述抗原决定表位选自以下物质组成的组:AMACR 341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :310-342 ；HIP-I :150-180 ；HIP-I :338-378 ；SSX2，4 110-139 ；NY-ES0-1 :1_40 ；XAGE-Ib :1_25 ；以及 XAGE-Ib :57_81。在一些实施方式中，可以试验一种或多种类型的自身抗体(autoantibody)，例如一组六个不同的“第一”生物标志物与试验至少一种第二生物标志物相结合，用来检测和/或测量六种不同类型的自身抗体。在一些实施方式中，所述第一生物标志物是第一肿瘤抗原，所述第二生物标志物是第二肿瘤抗原。在一些实施方式中，所述第一肿瘤抗原和/或所述第二肿瘤抗原是肿瘤的标志物，该标志物可能是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，所述第一肿瘤抗原和/或所述第二肿瘤抗原是癌症特异性标志物或者组织特异性标志物。在一些实施方式中，所述第二肿瘤抗原选自由以下物质组成的组阿尔法胚胎蛋白(AFP)，癌抗原 125 (CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生长因子受体2 (Her2/neu)，肿瘤相关抗原CA 15-3, 肿瘤相关抗原CA 19. 9，人天门冬氨酸(aspartyl)(门冬酰)贝塔羟基化酶(HAAH)，甲状腺球蛋白，膀胱肿瘤抗原等等。在一些实施方式中，第一肿瘤抗原是NY-ES0-1，XAGE-Ib,或者SSX2，4，第二肿瘤抗原是前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，阿尔法胚胎蛋白(AFP)，肿瘤抗原125 (CA-125)，癌胚抗原(CEA)，人表皮生长因子受体2 (Her2/ neu)，肿瘤相关抗原CA 15-3，肿瘤相关抗原CA 19. 9，人天门冬氨酸(门冬酰)贝塔羟基化酶(HAAH)，甲状腺球蛋白，膀胱肿瘤抗原，等等。在一些实施方式中，可试验多于一个的数量的第二肿瘤抗原。在一些实施方式中，本发明提供了一种纯化的或分离的肽。这种肽选自由以下物质组成的组AMACR :341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :313-345 ；HIP-1 :150-180 ；SSX2, 4 :110-139 ；XAGE-Ib 1-25 ；NY-ES0-1 1-40 ；XAGE-lb :57-81 ；AMACR :251-282 ；HIP-I 338-378 以及 p62 :156_184。在一些实施方式中，本发明提供可以进行根据本发明的试验的试剂盒，其中包括共同包装而成的对于所述第一生物标志物的捕获试剂以及针对所述第二生物标志物的捕获试剂。例如用于进行自身抗体加前列腺特异性抗原(autoAb+PSA)试验的试剂盒，包括共同包装而成的至少一种特异性结合针对前列腺癌相关抗原(不是前列腺特异性抗原)的 autoAb的捕获试剂，以及至少一种特异性结合PSA的抗体。本发明的试验可以用作疾病的早期发现(例如在可观察的临床症状出现之前)， 例如受试者的癌症，确定受试者是否可能患有周期性复发的癌症，确定患有癌症的受试者的预后。(例如通过所述第一值和所述第二值的加和高于或者低于给定数值来指示受试者是否对一定的治疗具有较好的或较差的恢复或响应)。在一些实施方式中，本发明提供了一种诊断或指示受试者为患有或可能患有前列腺癌的方法，该方法包括试验来自受试者的样本，与前列腺癌相关抗原或其抗原决定表位特异性结合的自身抗体的存在与否或数量，以及前列腺特异性抗原的存在与否或数量，其中，所述前列腺癌相关抗原不是前列腺特异性抗原，当所述自身抗体的存在与否或数量与所述前列腺特异性抗原的存在与否或数量的结合表明前列腺癌，则诊断或指示该受试者为患有或可能患有前列腺癌。在一些实施方式中，样品的试验仅通过单一反应步骤进行，通过该步骤，针对所述自身抗体的第一捕获试剂和针对所述前列腺特异性抗原的第二捕获试剂共同与所述样品接触。前面的概述和接下来的细节描述仅为示例性和说明性的，意在对要求保护的发明提供进一步的解释。所包括的附图提供对本发明的进一步理解，在此引入并组成本说明书的一部分，阐述本发明的一些实施方式，并与说明书一起用于阐释本发明的原理。


通过参考附图进一步理解本发明，其中图IA示出了对36个患者(20人患有前列腺癌，16人患有前列腺良性增生(BPH)) 进行PSA和antoAb+PSA试验的受试者工作特性(ROC)曲线。PSA水平由商品化的ELISA试剂盒所测定。针对6种肽抗原决定表位的所述自身抗体用ELISA测定。图IB示出了比较对于特定的病人群的autoAb+PSA试验的组合指标和单独使用 PSA的区分能力的表格。图2是通过基于ELISA的试验和MAP的试验，比较随机抽取的受试者(包括健康受试者，患有BPH的受试者以及活体检查验证患有前列腺癌的受试者)血清中的PSA水平 (ng/ml)的图。用MAP试验与基于商品化的ELISA试验所得到的PSA水平是类似的，范围为 0.l-25ng/ml。图3是autoAb+PSA试验板的示意图。具体地，示例了用于基于MAP试验的96 孔板(密理博)。放大的孔显示了十种不同颜色的试验珠子，1个包被了作为对照的贝塔-半乳糖苷酶(β-gal)肽，8个包被了独立的PCAA肽用来检量自身抗体，1个包被了抗 PSA (anti-PSA)抗体用来测量PSA。PSA标准品(n = 8)，和健康捐赠者(n = 8)的血清的每个样品加两个平行孔，目的分别是确定PSA装置(PSA units)以及血清阳性。已知的针对给定的抗原决定表位或者蛋白的阳性血清，例如NY-ES0-1能被用作对照。所述珠子的底纹和尺寸仅为说明。图4A用图表显示了单独使用基于MAP的试验，而不检测自身抗体，确定总PSA水平的线性范围的比较。线性回归方程显示在图的上方。而图4B显示了，存在针对8种抗原决定表位的自身抗体检测，线性范围同样能够达到0-30ng/ml的总PSA。图4B用图表显示了用基于MAP的autoAb+PSA的多重试验确定总PSA水平的线性范围的比较(即，与针对8个肽抗原决定表位的自身抗体的相同反应步骤的相同样品中测定的PSA水平)。线性回归方程显示在图的上方。图5显示的是在最小稀释浓度下，从252个患者(131人患有前列腺癌，121人患有 BPH)的PSA和autoAb+PSA试验得到的ROC曲线。PSA水平以及自身抗体根据本文描述的 autoAb+PSA的多重试验测出。图6显示的是在最大稀释浓度下，从252个患者(131人患有前列腺癌，121人患有 BPH)的PSA和autoAb+PSA试验得到的ROC曲线。PSA水平以及自身抗体根据本文描述的 autoAb+PSA的多重试验测出。
具体实施例方式本发明提供了一种用于诊断受试者为存在癌症患病可能或患有癌症的试验，其中，至少一种特异性结合第一肿瘤抗原决定表位(TA)的自身抗体(autoAb)以及至少一种生物标志物，例如前列腺癌生物标志物，前列腺特异性抗原(PSA)，均能够在来自受试者的样本中被检测和/或测量到。在一些实施方式中，所述自身抗体和所述生物标志物在同一样品中被检测或测量到。在一些实施方式中，所述自身抗体和生物标志物在同一样品中同时被检测或测量到。如本文所用的，“抗原决定表位”是被给定的抗体所识别的分子的部分。如本文所用的，“自身抗体”指的是受试者产生的一种抗体，其直接针对一种或多种受试者自身的抗原(例如肿瘤抗原)。如本文所用的，“抗体”指的是免疫球蛋白分子及其中的免疫激活部分(即，含有抗原结合位点、特异性结合抗体直接针对的分子的分子)。 如此，抗体这个术语不仅仅包括全部的抗体分子，也包括抗体的多聚体、抗体的片段以及抗体的变体(包括衍生物)，抗体的多聚体和抗体的片段。本文中，被术语抗体所定义的分子的例子包括但不限于单链FVS(ScFVS)，Fab片段，Fab'片段，F(ab' )2，二硫键连接的 Fvs (sdFvs)，Fvs,以及含有VL或VH结构域，或可选择的由VL或VH结构域组成的片段。本文中所用术语“单链Fv”或“scFv”指的是含有抗体的VH结构域与抗体的VL结构域连接而成的多肽。本发明中的抗体也可包括抗体的多聚体形式。例如，本发明的抗体也可以为免疫球蛋白单体分子的二聚体、三聚体或更高级的聚合体。本发明的所述抗体可以为天然的或合成的，多克隆或者单克隆，或嵌合分子，并且可以为免疫球蛋白分子的任何形式(如， IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)，任何类(如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4, IgA1 和 IgA2)，或任何亚类。
如本文所用的，分子，例如抗体，“特异性结合”另一分子，意思是这种相互作用依赖于被结合的分子上特异性结构的存在，例如，抗原决定表位。例如，特异性结合蛋白的抗体，识别和结合蛋白上的特异性结构，而不是无差别地结合从而引起非特异性结合和/或背景结合。如本文所用的，“非特异性结合”以及“背景结合”指的是不依赖特异性结构(例如，具体的抗原决定表位)存在的相互作用。如本文所用的，“生物标志物”指的是用作过程，事件或者状态表征物的物质。生物标志物可以是生物分子，例如核酸分子(例如微小RNA，基因组DNA等等)，蛋白，多糖，等等。生物标志物包括肿瘤抗原以及肿瘤标志物。如本文所用的，“肿瘤抗原”指的是肿瘤特异性抗原(TSAs)，通常可分为只存在于肿瘤细胞上的抗原和肿瘤相关抗原(TAAs)，而肿瘤相关抗原又通常分为存在于一些肿瘤细胞上的抗原以及存在于一些正常细胞上的抗原。如本文所用的，“肿瘤标志物”是指在机体组织或体液中可以找到的，由肿瘤细胞或非肿瘤细胞应答癌细胞(cancerous cells)的存在而产生的物质。肿瘤标志物的实例包括AFP (在肝癌中)，CA 125(在卵巢癌中)，CA 15_3 (在乳腺癌中)，CEA (在卵巢癌，肺癌， 乳腺癌，胰腺癌，胃肠道癌症中)，以及PSA(在前列腺癌中)。肿瘤标志物可以被分为两类 癌症特异性标志物以及组织特异性标志物。肿瘤标志物包括肿瘤抗原。但肿瘤标志物可不引发免疫应答。如本文所用的，“可能患有癌症的受试者”指的是受试者显示出一种或多种表明癌症的症状(例如，可检测到的肿块或肿团(mass))。可能患有癌症的受试者通常没有被检测到患有癌症。然而，可能患有癌症的受试者可包括接受初期诊断(例如显示肿团的CT扫描或者X射线)的人，但它们对癌症的类型或阶段并不知情。可能患有癌症的受试者也可包括曾经患过癌症的人(例如，病情缓解的个体)。可能患有癌症的受试者也可为具有患癌症风险的受试者。如本文所用的，“具有患癌症风险的受试者”指的是受试者存在着一种或多种的发展为特定癌症的风险因子。风险因子包括基因易染病体质，环境暴露，先前存在的非癌症疾病，先前的癌症，以及生活方式。如本文所用的，“受试者”可以与“患者”相互替换，指的是例如人类的哺乳动物。如本文所用的，“癌症的阶段”指的是能够被本领域技术人员识别的给定癌症的发展水平。用于确定癌症的阶段的标准包括但不限于肿瘤的尺寸，肿瘤是否扩散到身体的其它部位，肿瘤扩散到哪些部位(例如，在身体相同的器官或区域还是扩散到其它器官)。如本文所用的，“检测受试者是否患有癌症”指的是检测表明癌症的肿瘤抗原或自身抗体存在与否。如本文所用的，“被诊断为患有癌症的受试者”指的是具有癌细胞的受试者。可以通过任何合适的方法对癌症进行诊断，包括但不限于本发明的诊断方法。当涉及到核酸分子或肽，多肽时，术语“分离的”指的是通常从自然界相关的组分或杂质中分离所得到的给定生物分子。如本文所用的，“纯化的”成分，指的是从该成分中去除了其它组分(例如，污染物)。如本文所用的，术语“样品”具有其广泛的含义。一方面，它表示包括从任何来源获得的样本或培养物，也包括生物和环境样本。生物样品可从动物(包括人类)中得到，包括液体，固体，组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆，血清等等。如本文所用的，“捕获试剂”指的是用来特异性结合感兴趣的分析物的分子。所述捕获试剂可被固定在基质上。例如，若所述感兴趣的分析物是抗原，所述捕获试剂可能是特异性结合该抗原的抗体；而若所述感兴趣的分析物是抗体，所述捕获试剂可能是该抗体特异性结合的抗原决定表位。如本文所用的，“A+生物标志物试验”或者“A+B试验”指的是本发明的试验其中， 至少一种抗体(A)加上至少一种生物标志物(B)在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“autoAb+生物标志物试验”或“autoAb+B试验”指的是本发明的试验其中，至少一种特异性结合到第一生物标志物的抗原决定表位上的自身抗体(autoAb)加上至少一种第二生物标志物⑶在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“autoAb+TA试验”指的是本发明的试验其中，至少一种特异性结合第一生物标志物的抗原决定表位上的自身抗体(autoAb)加上至少一种作为肿瘤抗原(TA)的第二生物标志物在样品中被检测和/或测量到。如本文所用的，“A+抗原试验”指的是本发明的试验其中，至少一种抗体(A)加上至少一种抗原在样品中被检测和/或测量到。A+生物标志物试验包括A+抗原试验，autoAb+ 生物标志物试验，以及autoAb+TA试验。根据本发明中的A+生物标志物试验，得到针对第一生物标志物的抗体指数 (indices)，然后用本领域已知的逻辑回归方法，将其与第二生物标志物的数值相结合，其中，二进制因变量为1表示存在给定癌症、疾病或感染，而为0表示不存在给定癌症、疾病或感染。而自变量为给定生物标志物以及总抗体指数。这种分析可以通过SAS统计学文库 (8. 2或9.1版本，SAS研究所，Cary，NC)完成。基于拟合模型，使用由受试者样本计算得到的指标值(index value)可以计算出给定受试者的预测可能性。大体上说，如果预测可能性超过截止值(cutoffvalue)，例如，0. 50，个体将被归类为阳性。优化的截止值可以由ROC 曲线确定，将在下面进行讨论。对于给定的癌症、疾病或者感染，A+生物标志物试验的指标的诊断能力可以通过研究它的ROC曲线来得到，ROC曲线是由灵敏度对1-特异性构成的图， 截止值在它的整个取值范围内变化。对于任意给定特异性的A+生物标志物试验而言，使用 ROC曲线可以评价指标的灵敏度。另外，可以通过ROC曲线与连接左上角和右下角的直线的交叉点来确定最优的截止值。对于给定的截止值，灵敏度和特异性的置信区间可以通过普通的理论方法或计算机辅助程序的方法得到。具有统计学意义的检测也可以通过使用ROC 曲线下的面积(AUC)或部分面积比较ROC曲线来进行。为了举例说明本发明中的autoAb+生物标志物试验，对前列腺癌相关抗原 (PCAAs)的不同B细胞抗原决定表位进行研究，使其具有补充传统的前列腺特异性抗原 (PSA)测试的能力。如本文所用的“传统的PSA测试”指的是那些被美国食品与药物管理局所许可的当时的发明。这种传统的PSA测试具有假阳性(10人中的7人被检出可疑的PSA 水平，但却没有患前列腺癌)和假阴性(10人中的2. 5人患有前列腺癌但PSA水平却没有升高)的倾向。参见Thompson等(2004)N Engl J Med 350(22) :2239_46，在此引入作为参考。如本文公开的，AMACR,p90 自身抗原，LEDGFp75，HIP-I, SSX2，4，NY-ESO-1,以及 XAGE-Ib潜在的B细胞抗原决定表位的候选肽可通过本领域的已知方法预测。参见蛋白鉴定Rost等(2004)蛋白预测服务器。核酸研究32 (网页发行)W321_W326 ；Zeng ^ (2005) Int J Cancer 114 :268_73，以及美国专利号7，420，032，在此引入作为参考。AMACR, p90 自身抗原，LEDGFp75, HIP-I, SSX2，4，NY-ESO-1,以及 XAGE-lb 的序列， 已被它们的基因库(GenBank)登记号和GI号码验证，在此将它们的全部引入作为参考，如下AMACR = AAD10205. 1，GI :4204097，序列截止于 2009 年 11 月 30 日。p90 自身抗原=NP_065941. 2，GI :190194355,序列截止于 2010 年 1 月 17 日。LEDGFp75 = AAC25167. 1，GI :3283352,序列截止于 2009 年 11 月 30 日。HIP-I = NP_005329. 3，GI :38045919,序列截止于 2010 年 2 月 7 日。SSX2，4 = CAD90570. 1，GI :30519359，序列截止于 2008 年 10 月 15 日。NY-ES0-1 = CAA05908. 1，GI :3255991，序列截止于 2008 年 10 月 11 日。XAGE-lb = CAC38108. 1，GI 13992558，序列截止于 2006 年 11 月 15 日。关于以上被登记号确认的序列，所提供的日期是最后更新的日期。需要注意的是当序列被修改时，就会被赋予一个新的GeneBank登记号以及一个新的GI号码。在网络的NCBI GenBank数据库中可以查找修订历史(例如万维网网址ncbi. nlm. nih. gov/ sviewer/girevhist. cgi ？)。因此，以上所指的日期并不说明在该所指的日期之前，序列与给定日期提交的不同。例如，对于GI 190194355，该序列从2008年6月12日至2010年 1月17日之间是相同的，但是，在2008年6月12日之前，这个序列是不同的，公布为GI 24308239。因此，阐明如下AMACR :341-371 = KRDPFIGEHTEEILEEFGFSREEIYQLNSDK(SEQ ID No 1)；p90 :796-827 = DREHKLANLHQKTKVQEEKIKTLQKEREDKEE(SEQ ID No :2)；LEDGFp75 :313-345 = DRKRKQEEQMETEQQNKDEGKKPEVKKVEKK RE(SEQ ID No :3)；HIP-I:150-180 = MEYHTKNPRFPGNLQMSDRQLDEAGE SDVNN(SEQ ID No :4)；SSX2，4 :110-139 = KIMPKKPAEEGNDSEEVPEASGPQNDGKEL(SEQ IDNo :5)；XAGE-lb :1-25 = MESPKKKNQQLKVGILHLGSRQKKI(SEQ ID No :6)；NY-ES0-1 :1-40 = MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPG EAGAT(SEQ ID No: 7)；XAGE-lb :57-81 = GVKVKIIPKEEHCKMPEAGEEQPQV(SEQ ID No :8)；AMACR :251-282 = KSDELPNQMSMDDffPEMKKKFADVFAKKTKAE(SEQ ID No :9)；HIP-I :338-378 = SQQNLFDNKFDDIFGSSFSSDPFNFNSQNGVNKDEKD HLIE(SEQ ID No 10)；和p62 :156-184 = DEEVSSPSPPQRAQRGDHSSREQGHAPGG(SEQ ID No :11)。然后，通过本领域已知的方法合成候选肽。具体地，候选肽在Genscript公司(New Brunswick, NJ)和GeneMed合成公司(San Antonio, TX)的多肽合成仪(吉尔森公司， fforthington, 0H)上，通过固相合成得到。每个候选肽的分子量均由质谱确定以确认其同一性。所述候选肽重悬于二甲基亚砜，浓度为20mg/ml，储存在-20°C待用。接下来，采用本领域已知的方法，将候选肽与患有组织学证实的前列腺癌的受试者和健康受试者所采集到的血清样本一起进行筛选。参见kng等J Cancer 114 :268-73以及kng等Q000)J Immunol 165 :1153_9，在此将其全部内容引入作为参考。所有血清样品的采集均在加州大学洛杉矶分校所批准的内部评级标准(IRB)操作条件下完成。所述患有组织学证实的前列腺癌的受试者分别处于不同的癌症临床阶段。血清样品储存在-20°C待用。在96孔MaxiSorp板(Nunc，Denmark)上，以50微升PBS缓冲液将多肽稀释至10纳克/孔，4°C过夜。作为对照的96孔板包被了来自贝塔-半乳糖苷酶的肽。除非另外特殊说明，所有的血清样品均以含有5%胎牛血清的PBST(PBS缓冲液中加入吐温-20)稀释为1 25、1 125以及1 625。这三个稀释浓度下的每个样品分别加入到预先包被的ELISA平板中。室温孵育2个小时后，洗涤平板，再加入以含有5%胎牛血清的PBST稀释的第二抗体(共价偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗人免疫球蛋白，Sigma公司， 圣路易斯)。平板显影后，利用酶标仪(ELISA reader)在450nm处读取吸收值。截止值被定义为健康捐赠者的平均光密度值(OD)加上三倍的标准偏差(SD)。每个血清样品的三个稀释浓度中，有两个的OD值超过截止值，则提供该血清的癌症患者被认定为阳性。预测以及合成的候选肽列于下表1中
权利要求
1.一种试验方法，其特征在于，该方法针对样品中的至少一种抗体以及至少一种第二生物标志物，所述抗体特异性结合第一生物标志物或其抗原决定表位，该方法包括通过单一反应步骤，使针对所述抗体的第一捕获试剂以及针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与所述样品接触；检测所述抗体的存在与否或数量；以及检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。
2.根据权利要求1所述的试验方法，其中，所述抗体是针对前列腺癌的自身抗体，以及所述第二生物标志物是前列腺特异性抗原；或其中，所述至少一种抗体是多个自身抗体，它们中的每个特异性地结合多个表明前列腺癌的第一生物标志物，而不结合前列腺特异性抗原，以及所述第二生物标志物为前列腺特异性抗原。
3.根据权利要求1或2所述的试验方法，其中，所述第一捕获试剂不同于所述第二生物标志物，且所述第二捕获试剂不同于所述抗体。
4.一种诊断或指定受试者为患有疾病或者可能患有疾病的方法，其特征在于，该方法包括使用根据权利要求1-3中任意一项所述的试验方法试验来自受试者的样本，和当所述抗体的存在与否或数量与所述第二生物标志物的存在与否或数量表明疾病，则诊断或指定该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述疾病为癌症，所述第一生物标志物为第一肿瘤标志物，所述第二生物标志物为第二肿瘤标志物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一肿瘤标志物为肿瘤抗原、所述第二肿瘤标志物为肿瘤抗原、或者二者均为肿瘤抗原。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其中，所述抗体的存在与否或数量被设定为第一值，所述第二生物标志物的存在与否或数量被设定为第二值，所述第一值和所述第二值相结合以得到指标值，以及所述方法还包括使用该指标值以诊断或指定该受试者为患有该疾病或可能患有该疾病。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一值可以为基于其在患有该疾病的受试者中的普遍性的加权值、所述第二值可以为基于试验的数量的加权值、或者二者均为加权值。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其中，所述癌症为前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、尿路上皮细胞癌、以及包括本领域已知的其它上皮癌寸寸。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的方法，其中，至少一种所述第一肿瘤抗原和至少一种所述第二肿瘤抗原为前列腺癌相关抗原，或者所述第一肿瘤抗原和所述第二肿瘤抗原均为前列腺癌相关抗原。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，所述抗原决定表位选自由以下物质组成的组AMACR :341-371 ；p90 :796-827 ；LEDGFp75 :313-345 ；HIP-I :150-180 ； HIP-I :338-375 ；SSX2，4 :110-139 ；NY-ES0-1 :1_40 ；XAGE-Ib :1_25 以及 XAGE-Ib :57_87。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中，所述第二标志物为前列腺特异性抗原(PSA)。
13.根据权利要求7-12中任意一项所述的方法，其中，所述第一值设定为0，表示不存在所述抗体，以及被设定为1，表示存在所述抗体；所述第二值被设定为0，表示正常数量的所述第二生物标志物，被设定为1，表示非正常的高数量的所述第二生物标志物，或者被设定为0-1之间的数值，表示正常数量和非正常的高数量之间的所述第二生物标志物。
14.根据权利要求7-13中任意一项所述的方法，其中，当所述指标值超过给定的截止值，则该受试者被诊断或指定为患有该疾病或可能患有该疾病。
15.一种诊断或指定受试者为患有或可能患有前列腺癌的方法，其特征在于，该方法包括测定来自所述受试者的样品中，自身抗体的存在与否或数量，所述自身抗体特异性结合前列腺癌相关抗原或其抗原决定表位，以及测定前列腺特异性抗原的存在与否或数量， 其中，所述前列腺癌相关抗原并非前列腺特异性抗原，以及当所述自身抗体的存在与否或数量与前列腺特异性抗原的存在与否或数量表明前列腺癌，则诊断或指定该受试者为患有或可能患有前列腺癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，试验该样品在单一反应步骤中进行，通过该步骤，针对所述自身抗体的第一捕获试剂和针对前列腺特异性抗原的第二捕获试剂共同与所述样品接触。
全文摘要
本发明公开了一种试验方法，该方法包括检测样品中至少一种抗体的存在与否或数量，该抗体特异性的结合第一生物标志物或其抗原决定表位，以及检测至少一种第二生物标志物的存在与否或数量，该方法包括单一反应步骤，通过该步骤，针对所述抗体的第一捕获试剂和针对所述第二生物标志物的第二捕获试剂共同与所述样品接触，检测所述抗体的存在与否或数量，并检测所述第二生物标志物的存在与否或数量。本发明还公开了用于前列腺癌的试验方法。
文档编号G01N33/574GK102326080SQ201080008503
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月20日
发明者曾钢 申请人:加利福尼亚大学董事会