专利名称：传染性法氏囊病病毒vp2蛋白及传染性法氏囊病亚单位疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制备方法，特别是指一种利用该传染性法氏囊病病毒VP2蛋白制备获得传染性法氏囊病亚单位疫苗及其方法，属于生物技术领域。
背景技术：
传染性法氏囊病(IBD)是目前危害世界养禽业的三大主要传染病之一。我国是世界上禽蛋禽肉生产的大国，生产规模位居世界第一。该病在我国流行情况复杂，被农业部列为重点防御的二类烈性传染病。传染性法氏囊病病毒(IBDV)主要侵袭3 10周龄的雏鸡，尤其是4周龄内的小 鸡。病鸡群的死亡率达5% 30%。本病毒损害的器官主要是法氏囊，引起法氏囊充血、出血和坏死，并引起腿部肌肉出血及肾脏尿酸盐沉积等病变。鸡感染法氏囊病毒后，常继发其他传染病而死亡。防治该病的经典疫苗是弱毒苗和灭活苗，弱毒疫苗有其潜在的传染性和致病性，而灭活苗的免疫效果不确实。国内外科研工作者利用多种表达系统表达了 IBDV VP2蛋白以制备IBDV VP2蛋白亚单位疫苗，如荣俊等利用大肠杆菌表达系统、Macreadie等利用酵母表达系统表达、Bayliss等利用重组禽痘病毒表达系统、Darteil等利用重组火鸡疱疹病毒表达系统、Sh印pard等利用重组禽腺病毒表达系统进行了 IBDV VP2蛋白的表达，但是这些方法大部分都需要大量培养细胞，成本昂贵，不利于养殖场接受。Dybbing等虽然成功利用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV在昆虫细胞中表达IBDV VP2蛋白，但是，昆虫细胞培养基仍然价格昂贵。卢觅佳等虽然利用重组家蚕杆状病毒/家蚕幼虫表达系统进行了 IBDV VP2蛋白的表达，但构建重组家蚕杆状病毒程序复杂、病毒重组复杂且成功率低，而且需要在难养的家蚕细胞中培养繁殖重组病毒，也限制重组病毒在生产IBDV VP2蛋白及IBD亚单位疫苗方面的应用。

发明内容
传统上认为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV不能感染家蚕幼虫或蚕蛹，但本发明者在研究过程中发现重组IBDV VP2基因的AcNPV通过皮下注射方式能够感染品种为‘大造’的家蚕幼虫及其蚕蛹，这就为利用家蚕生物反应器生产IBDV VP2蛋白提供了一种简单高效的方式。发明人还发现以家蚕幼虫或蛹表达重组IBDV VP2蛋白与天然IBDV VP2蛋白的天然结构非常接近，保持了 VP2蛋白的天然活性和抗原性，同时避免了大肠杆菌表达的重组蛋白内毒素残留的缺点。家蚕幼虫或蚕蛹感染重组病毒后，也能够刺激机体产生一些能够刺激机体免疫系统的物质，增强重组VP2蛋白制备成IBD亚单位疫苗的免疫效力。因此，本发明的主要目的在于提供一种传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在家蚕幼虫或蚕蛹中大量生产的方法，以实现较为廉价地、大规模生产传染性法氏囊病亚单位疫苗。
技术方案本发明首先提供了一种传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，为使用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，经皮下注射家蚕幼虫或蛹，首次成功在家蚕幼虫或蛹体内表达的IBDVVP2蛋白。而在现有技术中，一直以来人们未能成功地将含有IBDV VP2蛋白编码基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，在家蚕幼虫或蛹体内中表达。优选地，生产本发明IBDV VP2蛋白的家蚕幼虫或蛹的品种为大造；本发明的IBDV毒株为洛阳地区送检的临床诊断为鸡传染性法氏囊(IBD)病的法氏囊病料中提取筛选获得的毒株，该毒株获得的IBDVVP2蛋白免疫原性更好，对国内变异的IBDV病毒具有更高的免疫原性，而该IBDV VP2蛋白的编码基因为SEQ ID N0.1。因此，本发明优选IBDV VP2蛋白的编码基因序列为SEQ ID N0.1 ;而其他的IBDVVP2蛋白也可以使用本发明的方法制备获得。优选地，本发明所述IBDV VP2蛋白为可溶性蛋白，具有抗原活性。即发明人发现以家蚕幼虫或蛹表达重组IBDV VP2蛋白可以形成与天然结构类似的活性结构，表现为非融合蛋白并适合表达，并保持了天然VP2蛋白的活性和抗原性。因此，本发明的IBDV VP2蛋白特别适合于制备传染性法氏囊病亚单位疫苗；并且也特别适合于制备传染性法氏囊病的诊断试剂或试剂盒等，可以方便、快速地提供关于传染性法氏囊病病毒的感染情况。本发明的另一目的在于提供了一种利用家蚕生物反应器生产传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，包括以下步骤:I)克隆IBDV VP2蛋白的编码基因序列，至昆虫核型多角体病毒(AcNPV)的表达转移载体PFastBacI上，获得重组表达转移载体；2)将重组表达转移载体转化入含有杆状病毒载体的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac中，获得含有IBDV VP2基因的重组杆状病毒基因组穿梭载体；

3)将上述重组杆状病毒基因组穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得带该IBDV VP2基因的重组昆虫核型多角体病毒；4)将上述重组昆虫核型多角体病毒经皮下注射家蚕幼虫或蛹，在体内表达VP2蛋白。优选地，本发明上述方法中所述克隆IBDV VP2蛋白的编码基因序列为SEQ IDN0.1。优选地，本发明上述方法中所述家蚕幼虫或蛹的品种为大造。优选地,本发明上述方法中所述昆虫细胞为sf9、sf21、High Five等昆虫细胞。本发明还提供了一种利用家蚕生物反应器生产传染性法氏囊病亚单位疫苗的方法，即在获得了 IBDV VP2蛋白之后，还包括将获得的IBDV VP2蛋白，加入疫苗佐剂，制备为传染性法氏囊病亚单位疫苗的步骤。本发明还获得了一种使用家蚕生物反应器生产的IBDV VP2蛋白而制备的传染性法氏囊病亚单位疫苗。因此，如本发明后续实施例所证明，本发明的IBDV VP2蛋白可以在制备治疗或预防传染性法氏囊病疫苗中的应用。因此，本发明的IBDV VP2蛋白也可以提供在制备传染性法氏囊病诊断试剂中的应用。
由上可以看出，与现有的IBDV VP2蛋白的生产相比，本发明至少有以下优点:(1)中国在家蚕养殖方面还有几千年的历史，家蚕人工饲养技术成熟，无菌条件下常年进行大规模家蚕的人工饲养已经可以实现；(2)家蚕幼虫和蚕蛹的表达成本远远低于昆虫细胞表达系统，每条蚕的蛋白表达量相当于lOOml-lOOOml昆虫细胞培养基中蛋白的表达量；(3)生产设备简单，易于操作；(4)昆虫核型多角体病毒对人和畜禽无感染性，是非常安全的表达系统。(5)本发明中提供的重组AcNPV病毒构建更简便、筛选更直观方便，注射家蚕或蛹可以直接表达可溶性的重组IBDV VP2蛋白，简化了构建重组家蚕杆状病毒的繁琐的步骤和多轮噬斑筛选纯化重组病毒和提纯分离VP2蛋白的复杂工艺和技术。(6)本发明的IBDV VP2蛋白的编码基因，来自洛阳地区送检的临床诊断为鸡传染性法氏囊(IBD)病的法氏囊病料进行匀浆后分离筛选获得的IBDV LYZS株病毒，该病毒编码的IBDV VP2蛋白免疫力更好，更适合国内大面积出现的IBDV感染的预防与治疗或诊断。


图1为本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因PCR扩增结果图；图2为家蚕血淋巴中IBDV VP2蛋白琼扩抗原含量测定结果图。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者生产商建议的方法及条件进行或配置。实施例1本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的获得方法，克隆方法为巢式RT-PCR，包括以下步骤:(一 )传染性法氏囊病病毒(IBDV) LYZS株基因组RNA的提取:IBDV LYZS株病毒为从洛阳地区送检的临床诊断为鸡传染性法氏囊(IBD)病的法氏囊病料进行匀浆后，按照天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp病毒RNA提取试剂盒说明书进行IBDV基因组RNA的提取。( 二 ) IBDV LYZS 株 VP2 基因的克隆:1.根据GenBank登记的IBDV毒株的序列选择保守区设计一对位于VP2基因序列的外围区的引物，用于扩增包含VP2基因的大片段，目的是通过测序确定VP2基因的完全准确的序列信息。然后根据测序结果设计合适的引物扩增出VP2基因。外围引物对的上游引物命名为WVP2F，其序列信息为5' -GGTTAGTAGAGATCAGACAAAC-3'，下游引物命名为WVP2R，其序列信息为5' -GCATGGGCTAGGGGAGCGGCAGG-3'。步骤(一)中提取的RNA用于反转录，利用宝生物工程(大连)有限公司的Reverse Transcriptase XL(AMV)(货号:D2620)进行第一链的合成，在0.2ml的PCR管中加入含I微克上述RNA，加入I微升(IOpm/微升)下游引物WVP2R作为反转录引物,加入4微升5 X Reverse Transcriptase XL Buffer和I微升Reverse Transcriptase XL(5U/ μ I)，然后补加双蒸水至20微升，42°C水浴作用60分钟，即获得IBDV VP2基因的cDNA链。2.以WVP2F和WVP2R为上下游引物，以上述cDNA为模板，利用宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRa Ex Taq (货号:DRR001A)进行PCR扩增VP2基因及其外围序列，反应程序如下:95°C预变性3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸1.5min，进行35个循环，72°C保温延伸lOmin。PCR产物进行测序测定VP2基因的序列信息。3.根据上述VP2基因测序结果设计一对引物用于扩增VP2基因的表达序列，上游引物命名为 VP2F，其序列信息为 5'-CGCGGATCCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAA-3',下游引物命名为VP2R，其序列信息为5' -CCCAAGCTTTCAAAATTCTGCGAAGTAATCTG-3'，并在引物中引物了合适的酶切位点识别序列(下划线)，上游引物的5'端引入BamHI限制性内切酶识别位点序列“G丨GATCC”，下游引物的5'端引入HindIII限制性内切酶识别位点序列“A丨AGCTT”，以步骤2中的PCR产物为模板，通过引物VP2F和VP2R进行PCR，反应程序如下:95°C预变性2min，94°C变性30s，62。。退火30s，72。。延伸1.5min，共进行30个循环，72°C保温延伸IOmin。4.利用核酸限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤3中所述的PCR产物，并克隆入供体质粒PFastBacI的BamHI和HindIII的位点中，获得重组载体pFastBac_VP2,并对重组载体中的VP2基因进行序列分析。序列表中SEQ ID N0.1为本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因序列，序列表中SEQ ID N0.2为本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白序列，参照图1为本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因PCR扩增结果。实施例2本实施例描述了生产传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白的方法，它以家蚕或蛹表达上述基因蛋白，并包 括如下步骤:(一)将以上所述获得的重组载体pFastBac-VP2转化入含有杆状病毒全长基因组穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac (Invitrogen, Catalog:10361012)中，在大肠杆菌细胞内重组，通过蓝白斑进行筛选重组穿梭载体，重组穿梭载体命名为Bacmid-VP2。 (二)将步骤(一)所述的重组穿梭载体Bacmid_VP2转染昆虫sf9细胞(Invtrogen公司，Catalog: 11496015)，在细胞内产生重组杆状病毒，命名为vBac_VP2:准备5 X 105cells/ml的sf9细胞悬液，在6孔细胞培养板中接入sf9细胞2ml/孔，27°C静置Ih以上使细胞贴壁。取一个无菌的1.5ml的离心管，加入I μ g重组穿梭质粒Bacmid-VP2，用100 μ L的SF900II SFM培养基进行稀释混匀，室温静置30min，取另一个无菌的1.5ml离心管加入 8 μ L 转染试剂 Cellfectin ⑧ II Reagent (Invitrogen,货号:10362100)，用 100 μ L的SF900II SFM培养基进行稀释混匀，室温静置30min，混合上述两个离心管中的转染试剂稀释液和重组穿梭质粒稀释液，用移液器轻轻混匀，室温静置lOmin。弃去准备好的6孔板中的sf9细胞的培养上清，加入上述混合转染液，并补加SF900II SFM至1ml，27°C培养箱培养6h，然后弃去转染液，加入新鲜的SF900II SFM培养基，继续培养5天后收集细胞培养上清，然后再通过感染昆虫sf9细胞来扩增重组病毒。重组病毒通过病毒空斑实验测定重组病毒滴度。(三)用步骤(二)所述的重组昆虫核型多角体病毒感染家蚕幼虫(或蛹)，大规模生产鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白。参照图2，准备病毒滴度为5X107pfu/ml的重组昆虫核型多角体病毒，用25 μ L微量注射器于家蚕(购自中国农业科学院蚕业研究所，品种:大造)5日龄幼虫皮下节间膜接种上述重组病毒，每条蚕接种5 μ L，于接种后第3、4、5、6、7、8天收集蚕体血淋巴，再利用高压均质机进行处理，4°C，SOObar压力处理2遍。通过琼脂扩散试验测定VP2蛋白在家蚕幼虫中的表达，结果表明，在接种后第6天蚕体血淋巴表达VP2蛋白的AGP (琼脂扩散试验)抗原量达到最大值1: 3200(标准血清购自中国兽用药品监察所，浓度为1: 8，每瓶2毫升装)。实施例3本实施例描述了本发明提供的IBDV基因工程亚单位疫苗。它为注射疫苗:包括以上所述感染重组病毒的家蚕幼虫的血淋巴的稀释液、免疫佐剂、防腐剂和稳定剂等，上述家蚕血淋巴淋巴利用PBS (0.01M, pH = 7.4)进行稀释至VP2蛋白的琼扩抗原浓度达到1: 16，得到的稀释液与免疫佐剂以1:1 1: 3(V: V)混匀，免疫佐剂包括矿物油、司本-80、吐温-80、硬脂酸铝及ISCOM等。血淋巴稀释液和免疫佐剂的比例可为1: 2。其生产方法为，收集上述家蚕血淋巴，高压均质机处理，4°C,800bar压力处理2遍，12000rpm离心30min,收集上清，利用PBS (0.01M, pH = 7.4)进行200倍稀释上述上清液。油相制备:取注射用矿物油94份，硬脂酸铝1.5份，置于油相制备罐中加热至80°C，再加入司本-806份，至温度达到121°C维持30分钟，冷却后备用；水相制备:取吐温-804份，121°C灭菌30分钟，冷却，再加入上述血淋巴稀释 液，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解；使用实验室小型乳化设备进行乳化，按水相:油相=1: 2，以17500r/min搅拌5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01 %。制备的疫苗外观为白色均匀乳剂，疫苗中抗原部分AGP抗原浓度为 1: 16。用上述IBDV基因工程亚单位疫苗皮下注射接种4周龄非免疫雏鸡，每只0.25ml,免疫组10只，同时设立10只作为对照组，其中5只作为攻毒对照(1-5号)，另5只不攻毒作为正常对照(6-10号)，对照组不免疫接种，同条件饲养观察。另，为了研究与同类疫苗的免疫效果比较，选用某公司商品化的IBD亚单位疫苗A做为平行试验组，该疫苗含有大肠杆菌表达的IBDV VP2抗原，其AGP抗原浓度彡I: 16。疫苗接种后第14、21天分别采血，分离血清，用琼脂扩散试验(AGP)检测IBD抗体滴度。疫苗接种后21日，免疫组、平行试验组及攻毒对照组鸡，经点眼途径分别攻击IBDV BC6/85强毒株病毒液，攻毒剂量为100BID/只。攻毒后，逐日观察鸡只临床表现，记录发病和死亡情况，剖检观察死亡鸡法氏囊病变，至96小时扑杀全部试验鸡，逐只剖检，观察记录试验鸡注射部位、皮下、胸肌、内脏各器官及法氏囊病变，计算保护率，同时剖检前对各组试验鸡进行称重，比较各组试验鸡体重差异。免疫攻毒结果判定:胸肌或腿肌条状出血；法氏囊出血、水肿、发黄；法氏囊内有胶冻样或干酪样分泌物等一种以上病变判为感染阳性。当血清中抗体效价大于等于3Log2，判定为合格。当剖检结果为阴性，同时免疫后21天8/10以上免疫鸡血清中抗体效价大于等于3Log2，则判定疫苗免疫保护合格。结果见表1，2。表1.免疫后试验鸡血清抗体(AGP)效价结果
权利要求
1.一种传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，所述IBDVVP2蛋白为使用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，经皮下注射家蚕幼虫或蛹，在体内表达的VP2蛋白。
2.根据权利要求1所述的IBDVVP2蛋白，其特征在于，所述家蚕幼虫或蛹的品种为大造。
3.根据权利要求1所述的IBDVVP2蛋白，其特征在于，所述IBDV VP2蛋白的编码基因序列为 SEQ ID N0.1。
4.根据权利要求1所述的IBDVVP2蛋白，其特征在于，所述IBDV VP2蛋白为可溶性蛋白，具有抗原活性。
5.一种利用家蚕生物反应器生产传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)克隆IBDVVP2蛋白 的编码基因序列，至昆虫核型多角体病毒(AcNPV)的表达转移载体PFastBacI上，获得重组表达转移载体； 2)将重组表达转移载体转化入含有杆状病毒载体的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac中，获得含有IBDV VP2基因的重组杆状病毒基因组穿梭载体； 3)将上述重组杆状病毒基因组穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得带该IBDVVP2基因的重组昆虫核型多角体病毒； 4)将上述重组昆虫核型多角体病毒经皮下注射家蚕幼虫或蛹,在体内表达VP2蛋白。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述克隆IBDVVP2蛋白的编码基因序列为 SEQ ID N0.1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述家蚕幼虫或蛹的品种为大造。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述昆虫细胞为sf9、sf21、HighFive等昆虫细胞。
9.一种利用家蚕生物反应器生产传染性法氏囊病亚单位疫苗的方法，其特征在于，还包括将权利要求1-4任意一项所述的IBDV VP2蛋白，加入疫苗佐剂，制备为传染性法氏囊病亚单位疫苗的步骤。
10.一种由权利要求1-4任意一项所述的IBDV VP2蛋白制备的传染性法氏囊病亚单位疫苗。
11.一种权利要求1-4任意一项所述的IBDV VP2蛋白在治疗或预防传染性法氏囊病疫苗中的应用。
12.—种权利要求1-4任意一项所述的IBDV VP2蛋白在制备传染性法氏囊病诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明获得了一种传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，为使用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，经皮下注射家蚕幼虫或蛹，首次成功在家蚕幼虫或蛹体内大量生产表达的IBDV VP2蛋白。而在现有技术中，一直以来人们未能成功地将含有IBDV VP2蛋白编码基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，在家蚕幼虫或蛹体内中表达。本发明还提供了一种利用家蚕生物反应器生产传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及传染性法氏囊病亚单位疫苗的方法，本发明的IBDV VP2蛋白可以在制备治疗或预防传染性法氏囊病疫苗中的应用，也可以提供在制备传染性法氏囊病诊断试剂中的应用。
文档编号G01N33/68GK103172709SQ20111044278
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司