专利名称：六味地黄膏的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及由中药材熟地黄、山茱萸(制)、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻制成的滋阴补肾药物六味地黄膏的质量控制方法，具体的涉及用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量和薄层色谱法鉴别中药材山茱萸的六味地黄膏的质量控制方法。
背景技术：
《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第三册(WS3-B-2489-97)中滋阴补肾的药物六味地黄膏，由中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g，山药160g，牡丹皮120g，茯苓120g，泽泻120g制成的膏滋剂，并颁布了六味地黄膏质量控制标准，但卫生部颁发的现有的六味地黄膏质量控制方法中，只有牡丹皮中丹皮酚的薄层色谱鉴别且无含量测定方法，局限性很大，难于控制六味地黄膏的质量；芍药苷是牡丹皮中的另一个活性成分，具有镇痛，解痉，抗菌，抗炎作用；现有药典及部颁标准中的其他六味地黄制剂(有含量测定的)均为测定牡丹皮中的丹皮酚及山茱萸中的熊果酸；另外，中医研究2000年13卷3期刘长河等发表的文章“六味地黄丸中梓醇的含量测定”中提出以梓醇为指标控制该类制剂的质量，并指出梓醇有遇热不稳定的性质；时珍国医国药1999年10卷12期张忠春等发表的“高效液相色谱法测定六味地黄胶囊中丹皮酚含量”一文中提出采用高效液相色谱法测定丹皮酚；中成药2001年23卷1期尤慧莲等发表的“六味地黄丸熊果酸含量测定方法的改进”一文中针对药典中薄层扫描法测定熊果酸含量操作时存在的问题进行了试验和探讨；中国药业1999年8卷11期陈贺新等发表的“RP-HPLC法测定六味地黄丸中马钱素的含量”为控制该制剂的内在质量提供了新的可靠的方法。本发明是根据本制剂采用的水提工艺，熊果酸微溶于水，水提的提取率低，而丹皮酚的熔点低，具挥发性，水提含量低，不利于质量的控制；芍药苷具水溶性，水煎提取率高，故以牡丹皮中的芍药苷作为制剂中含量测定指标并建立其检测方法，虽然熊善丽等在中国中药杂志2003年28卷8期上发表的“RP-HPLC测定六味地黄方中苷类成分的含量”一文中建立了六味地黄方水煎液中莫诺苷、马钱素、芍药苷含量测定的方法，但其流动相与检测波长均与本发明不同；本发明利用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量，并增加其中山茱萸药材的薄层色谱定性鉴别方法，确认方法简便、结果准确，重现性好，现有药典及文献中大多采用熊果酸为对照品，而本发明采用的是山茱萸对照药材，并经方法学试验确认方法专属、可行、阴性无干扰；因此本发明提高了六味地黄膏的质量控制标准，更好地保证了本复方制剂较高的质量标准水平。

发明内容
本发明的目的是对采用水提工艺的六味地黄膏质量，制定新的六味地黄膏质量控制方法，利用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量，并经方法学考察试验，确认方法简便、结果准确，重现性好；用薄层色谱法鉴别该药物中药材山茱萸，经方法学试验，确认方法专属、可行、阴性无干扰；保证了质量检测标准的准确性和先进性，能够有效地控制六味地黄膏的质量。
《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第三册(WS3-B-2489-97)中滋阴补肾的药物六味地黄膏，由中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g，山药160g，牡丹皮120g，茯苓120g，泽泻120g制成的膏滋剂。熟地是方中主要药味，为生地黄的炮制加工品，生地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，味厚甘温，具有滋肾填精之功效；主要含有梓醇、地黄甙等环烯醚萜甙类及多糖等化学成分；牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，具有清热凉血，活血化瘀之功效，主要含有丹皮酚、芍药苷等化学成分；山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，具有养肝涩精的功效；主要含有马钱素，熊果酸、齐墩果酸等化学成分，本发明所述的滋阴补肾药物六味地黄膏的制备方法，是按《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第三册(WS3-B-2489-97)中的制备方法采用的水提工艺制成的膏滋剂。方中的有效成份熊果酸微溶于水，水提的提取率低，丹皮酚的熔点低，具挥发性，水提含量低，不利于六味地黄膏质量的控制；而另一有效成份芍药苷具水溶性，水煎提取率高，故以牡丹皮中的芍药苷作为制剂中含量测定指标，利用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量，方法简便、结果准确、重现性好，并增加其中山茱萸药材的薄层色谱定性鉴别方法，采用山茱萸对照药材，并经方法学试验确认方法专属、可行、阴性无干扰；提高了六味地黄膏的质量控制标准，更好地保证了本复方制剂较高的质量标准水平。
完成本发明通过下述技术方案予以实现其一用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量；其二用薄层色谱法鉴别该药物中药材由茱萸。
具体的六味地黄膏新的质量控制检测方法，可通过以下步骤预以实现仪器、药品及材料仪器Waters 600E型高效液相色谱仪，Waters 486检测器美国Waters公司江申色谱工作站大连江申分离科学技术公司SK5200H超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司Mettler AE 240精密分析天平(0.00001)Mettler仪器公司HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司101-2型电热鼓风干燥箱上海市实验仪器总厂对照品及对照药材芍药苷对照品购于中国药品生物制品检定所。
泽泻对照药材购于中国药品生物制品检定所。
山茱萸对照药材 自制各单味药材均由安徽亳州市中信药业有限责任公司提供。经检测，均符合《中华人民共和国药典》2000版一部各项下规定。
供试品六味地黄膏硅胶G薄层板规格10×20cm 台州市路桥四甲生化塑料厂出品显色剂及试液硫酸-醋酐-无水乙醇溶液(1∶1∶1)，硫酸-醋酐-无水乙醇溶液(1∶1∶5)，所用试药均为分析纯，试液均按照《中华人民共和国药典》2000版一部附录XV B各项下有关方法配制。
1、用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量a.色谱条件 填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 乙腈--水检测波长230±2nm理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加有机溶剂或水中的任一种溶解制成溶液；c.供试品溶液的制备取本品，加水稀释后，用水饱和正丁醇提取，醇液蒸干后，残渣用有机溶剂或水中的任一种溶解，稀释并定容；d.芍药苷的含量测定方法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；2、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备取山茱萸对照药材，加乙醇回流提取，滤取提取液，蒸干，残渣加水溶解，用乙醚萃取，乙醚液蒸干，残渣溶于乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品，加乙醇振摇混匀，置水浴中回流提取，提取液蒸至无醇味，加水稀释，用乙醚萃取，乙醚液用5％NaHCO3溶液洗涤，再用水洗涤，乙醚液蒸干，残渣溶于醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇溶液，烘至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
上述的六味地黄膏新的质量控制检测方法，优选以下具体步骤1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈--水(10-20∶90-80)为流动相，检测波长为230±2nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇或乙醇或水中的任一种制成每1ml含5--50μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品0.5--3g，精密称定，加水10--25ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3--6次，每次10--25ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇或乙醇或水中的任一种适量溶解，移置10--25ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得；d.芍药苷的含量测定方法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5--20μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；
e.每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
2.该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备取山茱萸对照药材0.5-4g，加乙醇20-100ml回流0.5-2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30ml溶解，用乙醚30-90ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品10-50g，加95％乙醇20-100ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流0.5-2小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水10-50ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取2-5次，每次10-50ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液20-50ml分次洗涤，再用水约10-50ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5-20ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
本发明六味地黄膏新的质量控制检测方法，更优选的技术方案可以按下列测定步骤进行1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(12∶88)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，加水10ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次10ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得；d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
2、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材2g，加乙醇50ml回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品30g，加95％乙醇60ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约15ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
本发明所述的滋阴补肾药物六味地黄膏的制备方法，是按《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第三册(WS3-B-2489-97)中的制备方法制成的膏滋剂。
本发明提供了山茱萸的TCL鉴别，经方法学试验确认方法可行，阴性无干扰；选择了芍药苷为测定指标，并进行了以下方法学考察试验，建立了六味地黄膏的HPLC含量测定方法；经过多次重复试验，确认方法简便、结果准确，重现性好，可作为六味地黄膏质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
芍药苷含量测定的方法学考察1、线性曲线、回归方程、相关系数及线性范围①精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品6.02mg，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，稀释至刻度，摇匀，得芍药苷贮备液(0.2408mg/ml)，分别精密吸取0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各对照品溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定。如

图1所示以峰面积(A)为横坐标，芍药苷含量(M)为纵坐标，得回归方程M＝8.892×10-8A+3.208×10-3(式中A为峰面积，M为芍药苷含量μg)，r＝0.9994，表明芍药苷含量在0-0.2408μg之间，呈良好线性关系，结果见表1。
表1 芍药苷线性关系测定结果

图1 线性关系图2、重现性试验精密称取同一批号样品约1g，共5份，照本发明的方法操作，测定峰面积A，并计算各份样品中芍药苷的含量，结果见表2。
表2重现性试验样品编号 1 2 3 4 5含量(mg/g) 0.148 0.148 0.1520.149 0.147平均值(mg/g) 0.149RSD(％) 1.263、精密度试验取同一芍药苷对照品溶液，连续测6次，每次精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定峰面积A，试验表明其精密度RSD＝1.71％，符合规定，结果见表3。
表3 精密度试验编号1 2 3 4 5 6峰面积 1226384 1257754 1275782 1253258 1287385 1248002平均值 1258094.17RSD(％) 1.714、稳定性试验取精密度试验项下的芍药苷对照品溶液及供试品溶液，精密吸取5μl，在隔1.5小时，隔6小时后，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，结果表明芍药苷对照品溶液及供试品溶液均在6小时内稳定，结果见表4。
表4 稳定性试验时间(小时) 对照品峰面积 供试品峰面积012263848354690.5 12589408377736.0 1260187833106平均值 1248503.67 835449.3RSD(％) 1.53 0.285.加样回收率试验取已知含量的本品0.3-0.7g，精密称定，共6份，每份各加入精密称定的芍药苷对照品30-120μg，照本发明的方法操作，测定含量，计算回收率，结果见表5。
表5加样回收率测定结果编 样品含芍药苷加入芍药苷 测得芍药苷量回收率平均回收率号量(mg) 量(mg) (mg) (％)(％)10.1084 0.036120.143797.7320.1014 0.036120.136597.1830.07507 0.072240.147399.99 99.5640.09196 0.072240.1651101.25 RSD＝1.57％50.05561 0.1084 0.1645100.4560.06636 0.1084 0.1756100.77
注具体实施方式
实施例1取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏，每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(12∶88)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，加水10ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次10ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材2g，加乙醇50ml回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品30g，加95％乙醇60ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约15ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例2取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏。每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(10∶90)为流动相，检测波长为230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品0.5g，精密称定，加水10ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取6次，每次10ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材0.5g，加乙醇20ml回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品10g，加95％乙醇20ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流2小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水10ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取5次，每次10ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液20ml分次洗涤，再用水约10ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各20ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例3取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏。每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(15∶85)为流动相，检测波长为230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加乙醇制成每1ml含50μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品3.0g，精密称定，加水25ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次25ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用乙醇适量溶解，移置25ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。
每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材4g，加乙醇100ml回流0.5小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml溶解，用乙醚90ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品50g，加95％乙醇100ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流0.5小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水50ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取2次，每次50ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液50ml分次洗涤，再用水约50ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例4取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏。每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1.用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(20∶8O)为流动相，检测波长为230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加水制成每1ml含30μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品2g，精密称定，加水20ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取5次，每次20ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用水适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材2g，加乙醇50ml回流1.5小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品40g，加95％乙醇80ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1.5小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约25ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照药材溶液10ul，吸取供试品溶液15ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例5取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏。每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1.用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(15∶85)为流动相，检测波长为230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加水制成每1ml含40μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品1.5g，精密称定，加水20ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次20ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用水适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材3g，加乙醇50ml回流1.0小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙醚60ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品30g，加95％乙醇60ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1.0小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水20ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取4次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约20ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照药材溶液10ul，吸取供试品溶液15ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例6取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏。每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1.用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(12∶88)为流动相，检测波长为230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加乙醇制成每1ml含10μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品2.5g，精密称定，加水20ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用乙醇适量溶解，移置25ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材1g，加乙醇50ml回流2.0小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品20g，加95％乙醇40ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流2.0小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水20ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约15ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取对照药材溶液15ul，吸取供试品溶液20ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
实施例7取中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g，上述原料加水煎煮三次，第一、二次各加9倍量水，煎煮2小时，第三次加7倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液减压浓缩至相对密度为1.28～1.32(85℃)的清膏，每100g清膏加炼蜜300g，混匀，即得。
1、用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定芍药苷的含量测定及其标准a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈--水(12∶88)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，加水10ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次10ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
d.测定法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量。每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。
(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材2g，加乙醇50ml回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品30g，加95％乙醇60ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约15ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)、该药物中药材泽泻用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备取泽泻对照药材4g，加60％乙醇50ml回流提取1小时，滤过，滤液于水浴上蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1.0ml使溶解，作为泽泻对照药材溶液。
b.供试品溶液的制备取本品60g，加乙醇120ml，置水浴上加热回流1小时，放冷，离心20分钟(4000转/分)，取上清液，于水浴上蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，加乙醚振摇提取3次，每次30ml，合并乙醚液，用水洗，乙醚液蒸干，残渣加氯仿1.0ml使溶解，作为供试品溶液。
c.照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取供试品溶液15ul，对照品溶液10ul，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚-醋酸乙酯-甲酸(24∶6∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸-醋酐-无水乙醇溶液(1∶1∶1)，105℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。用上述方法作为该药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
权利要求
1.由中药材熟地黄320g、山茱萸(制)160g、山药160g、牡丹皮120g、茯苓120g、泽泻120g制成的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于该方法包括(1)、用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量；(2)、用薄层色谱法鉴别该药物中药材山茱萸。
2.根据权利要求1的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量a.色谱条件填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 乙腈--水检测波长230±2nmb.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加有机溶剂或水中的任一种溶解制成溶液；c.供试品溶液的制备取本品，加水稀释后，用水饱和正丁醇提取，醇液蒸干后，残渣用有机溶剂或水中的任一种溶解，稀释并定容；d.芍药苷的含量测定方法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备取山茱萸对照药材，加乙醇回流提取，滤取提取液，蒸干，残渣加水溶解，用乙醚萃取，乙醚液蒸干，残渣溶于乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品，加乙醇振摇混匀，置水浴中回流提取，提取液蒸至无醇味，加水稀释，用乙醚萃取，乙醚液用5％NaHCO3溶液洗涤，再用水洗涤，乙醚液蒸干，残渣溶于醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇溶液，烘至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求2的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量a.色谱条件填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 乙腈--水(10-20∶90-80)检测波长230±2nm；b对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇或乙醇或水中的任一种制成每1ml含5--50μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品0.5--3g，精密称定，加水10--25ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取3--6次，每次10--25ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇或乙醇或水中的任一种适量溶解，移置10--25ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀，即得；d.芍药苷的含量测定方法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5--20μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；e.每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备取山茱萸对照药材0.5-4g，加乙醇20-100ml回流0.5-2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30ml溶解，用乙醚30-90ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品10-50g，加95％乙醇20-100ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流0.5-2小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水10-50ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取2-5次，每次10-50ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液20-50ml分次洗涤，再用水约10-50ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中，即为供试品溶液；c.照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-20ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.根据权利要求3所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱法测定该药物中芍药苷的含量a.色谱条件填充剂 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 乙腈--水(12∶88)检测波长 230nm；b.对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液；c.供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，加水10ml，搅拌稀释，移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇提取4次，每次10ml，合并醇液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇适量溶解，移置10ml量瓶中，稀释并定容至刻度，摇匀；d.芍药苷的含量测定方法分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷的含量；e.每克含牡丹皮以芍药苷(C23H28O11)计，不得低于0.08mg。(2)、该药物中药材山茱萸用薄层色谱法鉴别a.对照药材溶液的制备称取山茱萸对照药材2g，加乙醇50ml回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，用乙醚30ml分次萃取，合并乙醚溶液，蒸干，残渣溶于0.5ml乙酸乙酯中，即为对照药材溶液；b.供试品溶液的制备取本品30g，加95％乙醇60ml，振摇10分钟使混匀，置水浴中回流1小时，趁热过滤，滤液蒸至无醇味，加水30ml搅拌稀释，移至分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次20ml，合并乙醚溶液，用5％NaHCO3溶液30ml分次洗涤，再用水约15ml洗涤，乙醚溶液蒸干，残渣溶于0.5ml醋酸乙酯中；c.照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-醋酸乙酯(20∶5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-浓硫酸-无水乙醇(1∶1∶5)溶液，在105℃烘至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.根据权利要求1-4任一所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于色谱条件选用乙腈--水为流动相。
6.根据权利要求5所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于色谱条件选用乙腈--水(10-20∶90-80)为流动相。
7.根据权利要求6所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于色谱条件选用乙腈--水(12∶88)为流动相。
8.根据权利要求1-4任一所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于选定波长230±2nm为测定波长。
9.根据权利要求8所述的六味地黄膏的质量控制方法，其特征在于选定波长230nm为测定波长。
全文摘要
本发明涉及《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂)第三册(WS3－B－2489－97)中滋阴补肾药物六味地黄膏新的质量控制方法，该药物由中药材熟地黄、山茱萸(制)、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻制成，具体的是利用高效液相色谱法测定六味地黄膏中芍药苷的含量，方法简便、重现性好、结果准确；用薄层色谱法鉴别六味地黄膏中中药材山茱萸，专属、可行，保证了质量检测标准的准确性和先进性，能够有效地控制六味地黄膏的质量。
文档编号G01N30/88GK1609609SQ200410078888
公开日2005年4月27日 申请日期2004年9月23日 优先权日2004年9月23日
发明者季巧遇, 李诒光, 徐昌瑞 申请人:江西江中药业股份有限公司