专利名称：一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，获取的食品天然防腐剂一乳酸链球菌素酶联免疫检测方法，尤其适用于乳制品及饮料与肉制品中的乳酸链球菌素含量的测定。
背景技术：
乳酸链球菌素(Nisin)是从乳酸乳球菌或乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质，是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。我国于1990年开始批准使用Nisin，到目前为止，全世界约有50多个国家和地区广泛使用Nisin。Nisin是由34个氨基酸组成的多肽，其分子量为3510，属于羊毛硫抗生素 (Lantibiotics),活性部位含有大量的稀有氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β _甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、甲基脱氢丙氨酸等一些非编码的氨基酸。Nisin的活性分子常以二聚体和四聚体的形式存在，其分子量为7000和14000。乳酸链球菌素能有效杀死或抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，特别是细菌孢子如葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、小球菌、明串珠菌、芽孢杆菌等，对乳酸链球菌素很敏感。乳酸链球菌素定量分析的最初测定的方法为1934年Cox GA等人建议采用的甲基蓝还原法，后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析方法，包括试管稀释法、 浊度分析法、琼脂扩散法、ATP生物发光测定法、绿光荧光蛋白测定法和微量滴定法等。 1990年!^alahee发展了多克隆抗血清分析乳酸链球菌素的酶联免疫分析法。1996年 Suacrez, Rodriguez设计了多克隆抗体酶联免疫吸附法。Bouksaim报道多克隆抗体的酶联免疫分析法。目前，我国关于乳酸链球菌素的测定有两种方法，其一是琼脂扩散法，该方法是依据企业标准QB 2394-2007((食品添加剂乳酸链球菌素》，采用琼脂扩散法的原理在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果，由抑菌圈直径及标准效价换算出效价，确定其含量，由于该方法具有灵敏度低、无法精确定量、易受干扰因素的影响、易于污染环境等缺点，不易于各检测机构推广使用。其二是液相色谱法，经查2010年建立了液相色谱检测方法并申请了专利，该方法由于所需仪器及耗材均较昂贵，检出限低，且耗时长，不易大范围推广。本次文献检索披露的内容有《天然防腐剂一乳酸链球菌素》)(中国食品与营养，2008年第4期) 和《乳酸链球菌素检测技术的研究进展》(中国食品添加剂，2008年第5期)。本发明所建立的食品中乳酸链球菌素酶联免疫快速检测方法，既定性也能够定量，是目前国际公认的用于测定食品中添加剂含量的方法，具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、快速简便、无污染、重现性好等特点，适宜普遍推广和应用。

发明内容
本发明的目的在于提供乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法及试剂盒为食品安全保驾护航，所建立的简单、敏感、直接的免疫学方法有重要的实践意义。
本发明目的是这样实现的一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ο V A的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒；
1)检测方法的构建
包被抗原的制备用PH值为9. 6的0. 01-0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原 1000倍，加入酶标板，每孔100μ1，37 孵育池，倾去包被液，用含有0. 05°/%叠氮化钠、0. 1% 明胶和0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0. 02Μ、PH 7. 4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封闭液，即0. 1%0叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37°C 温育池，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
多克隆抗体的制备将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均勻， 对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0. 2ml ；第二次免疫，将1. Omg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点 0. 2ml ；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1 :3000为止；
竞争反应用0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；将制备的多克隆抗体以2. 5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1 :1000比例稀释后加入，每孔加入50μ1， 37°C温育30min，然后用PBST洗涤3_5次；
加酶标二抗将0. 5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以1 :5000稀释后加入，每孔加入100Pl，37°C，30min后，用PBST洗涤3-5次;
显色每孔加入显色液100μ1，37 显色15min ；最后每孔加入终止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶标仪450nm测吸光值A45tl，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；
上述乳酸链球菌素标准品购置于sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC ；
2)对检测样品的处置
乳饮料将0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；
肉制品将样品制成粉末状，取Ig样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混勻，后静置lOmin，提取上清Ι-aiil，用于分析。所述的酶联免疫检测方法，该方法的检测试剂盒包括
1)包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；
2)酶标二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的酶标二抗获取，7ml/瓶；
3)抗体工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液稀释1000倍的抗体获取， 8ml/ 瓶；
4)乳酸链球菌素标准品溶液，共6瓶，浓度分别为Omg/L，0. Img/L,0. 5mg/L, 2. 5mg/L, 12. 5mg/L，62. 5mg/L ；
5)底物显色液2瓶，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶；
6)终止液1瓶，含l-2mol/L硫酸，7ml/瓶；
7)浓缩洗涤液1瓶，含0.05%吐温、0. 1%明胶、0. 05%叠氮钠的磷酸盐缓冲液0. 02M、 pH 7. 4，40ml/瓶；
8)复溶工作液1瓶，50ml/瓶。本发明方法的检测原理在酶标板微孔条上预包被乳酸链菌素与载体蛋白的偶联物，加入样品溶液或标准品溶液后，再加入乳酸链球菌素抗体溶液，样品中的乳酸链球菌素或标准品与酶标板上包被的乳酸链球菌素偶联抗原竞争乳酸链球菌素抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样品吸光值与样品中乳酸链球菌素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中乳酸链球菌素的含量，同时也可根据酶标板上颜色的深浅， 与系列浓度乳酸链球菌素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中乳酸链球菌素含量的浓度范围。本发明构建并实现的定量检测食品中乳酸链球菌素的快速检测方法一酶联免疫法及市场销售的试剂盒，填补了国内的空白，为行业的食品检测提供了快速精准的检测新产品，彰显技术进步。


本发明对照说明书附图作进一步说明。附图1为乳酸链球菌素的标准曲线如图所示X轴为浓度的半对数值，Y轴为百分吸光度值。附图2为技术路线实施示意如图所示本技术路线以乳酸链球菌素为免疫原制得了高效价的抗乳酸链球菌素的多克隆抗体，以乳酸链球菌素与卵清蛋白的偶联物作为包被原建立了间接竞争酶联免疫方法，用此方法检测乳制品及肉制品中的乳酸链球菌素。
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。本发明方法的实施步骤 1)检测方法的构建
包被抗原的制备用PH值为9. 6的0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍， 加入酶标板，每孔100μ1，37 孵育池，倾去包被液，用含有0. 05%0叠氮化钠、0. 1%明胶和 0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0. 02Μ、pH 7. 4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封闭液，即0. 1%。叠氮化钠和10% (质量百分含量)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37°C温育池，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；
乳酸链球菌素多克隆抗体的制备取1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂(自配，液体石蜡与羊毛脂混合液，组分比为2 :1，加10mg/ml卡介苗)混勻，首次免疫时每只兔子2. 0ml，颈背部皮下多点注射，每点0. anl，第二次免疫时取乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂(自配，液体石蜡与羊毛脂混合液，组分比为2 10)混勻，每只兔子 2. 0ml，颈背部皮下多点注射，每点0. anl。每次注射间隔2周，免疫期间采血，检测抗血清效价，连续加强免，直到获得满意的抗体效价(大于1 :3000)为止。最后一次无佐剂用1. Omg 抗原直接腹腔注射。竞争反应用0. 1%牛血清白蛋白的0. 04mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；将制备的多克隆抗体以2. 5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1 :1000比例稀释后加入，每孔加入50μ1， 37°C温育30min，然后用PBST洗涤4次；
加酶标二抗将0. 5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以1 :5000稀释后加入，每孔加入100μ1，37 ，30π η后，用PBST洗涤5次；
显色每孔加入显色液100μ1，37 显色15min ；最后每孔加入终止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶标仪450nm测吸光值A45tl，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；
其中选用的乳酸链球菌素标准品购置于sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC。2)检测样品的处理
乳饮料用复溶工作液将样品稀释10倍，其中含0. 1%牛血清白蛋白的0. 06mol/L的磷酸盐缓冲液即为复溶工作液；
肉制品将样品剁碎成粉末状，取Ig样品至50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混勻后静置lOmin，小心的提取上清2ml用于分析，注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀。3)酶联免疫试剂盒的制备；以乳酸链球菌素与卵清蛋白的偶联物为包被原的酶联免疫试剂盒包括
<1>包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物； <2>乳酸链球菌素标准品溶液共6瓶，浓度分别为0 mg /L (mg/kg),0. 1 mg /L (mg/ kg), 0.5 mg /L (mg/kg), 2. 5 mg /L (mg/kg), 12. 5 mg /L (mg/kg),62. 5 mg /L (mg/kg);
<3>底物显色液共2瓶底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，1 瓶，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，1瓶，7ml/瓶；
<4>乳酸链球菌素抗体工作液1瓶抗体稀释液为含有2. 5% (质量百分含量)酪蛋白的磷酸盐缓冲液，抗体工作液稀释浓度为1 1000，8ml/瓶；
<5>辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体工作液1瓶酶标二抗稀释液为含有0. 5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，羊抗兔抗抗体稀释浓度为1:5000 (质量百分含量)，7ml/瓶； <6>浓缩洗涤液1瓶含0. 05%吐温、0. 1%明胶、0. 05% (质量百分含量)叠氮钠的磷酸盐缓冲液(0. 02M、pH 7.4);40ml/瓶;
<7>终止液1瓶含有2mol/L硫酸，7ml/瓶；
<8>复溶工作液1瓶含0. 1% (质量百分含量)牛血清白蛋白的0. 06mol/L磷酸盐缓冲液，50ml/瓶。4)采用试剂盒对样品中乳酸链球菌素含量的检测
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测乳酸链球菌素的含量；向包被有乳酸链球菌素与卵清蛋白偶联物的酶标板微孔中加入乳酸链球菌素标准品溶液或样品溶液50μ1，再加入乳酸链球菌素抗体工作液50μ1，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min ；倒出孔中液体，每孔加入250μ1洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体工作液100ml， 37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，各50μ1，轻轻振荡混勻，37°C恒温箱避光显色 15min,每孔加入2mol/L终止液硫酸50ml，轻轻振荡混勻，用酶标仪，测定每孔吸光度值。所获得的每个浓度标准品溶液或样品吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0 标准)的吸光度值(Btl)再乘以100 %，即为百分吸光度值。公式百分吸光度值(％) = B/B0X100%
公式中B为标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值，B0为Omg/L标准品溶液的平均吸光度值。以乳酸链球菌素标准品浓度(mg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示；相对应每一个样品中乳酸链球菌素的浓度可以从标准曲线上读出，用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样品中乳酸链球菌素的含量。
将附图1中各个标准品浓度对应的吸光度的平均值列表，见表1。
权利要求
1.一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，其特征在于用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白O V A的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒；1)检测方法的构建包被抗原的制备用PH值为9. 6的0. 01-0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原 1000倍，加入酶标板，每孔100μ1，37 孵育池，倾去包被液，用含有0. 05%0叠氮化钠、0. 1% 明胶和0. 05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0. 02Μ、PH 7. 4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μ 1封闭液，即0. 1%0叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37°C 温育池，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；多克隆抗体的制备将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均勻， 对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0. 2ml ；第二次免疫，将1. Omg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点 0. 2ml ；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1 :3000为止；竞争反应用0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5Pg/ml，每孔加50μ1 ；将制备的多克隆抗体以2. 5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1 :1000比例稀释后加入，每孔加入50μ1， 37°C温育30min，然后用PBST洗涤3_5次；加酶标二抗将0. 5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以1 :5000稀释后加入，每孔加入100μ1，37 ，30π η后，用PBST洗涤3-5次；显色每孔加入显色液100μ1，37 显色15min ；最后每孔加入终止液2 M硫酸溶液 50 μ L ；用酶标仪450nm测吸光值A45tl，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；上述乳酸链球菌素标准品购置于sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES, INC ；2)对检测样品的处置乳饮料将0. 1%牛血清白蛋白的0. 03-0. 06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；肉制品将样品制成粉末状，取Ig样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混勻，后静置lOmin，提取上清Ι-aiil，用于分析。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于该方法的检测试剂盒包括1)包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；2)酶标二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的酶标二抗获取，7ml/瓶；3)抗体工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液稀释1000倍的抗体获取， 8ml/ 瓶；4)乳酸链球菌素标准品溶液，共6瓶，浓度分别为Omg/L，0. Img/L,0. 5mg/L, 2. 5mg/L, 12. 5mg/L，62. 5mg/L ；5)底物显色液2瓶，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶；6)终止液1瓶，含l-2mol/L硫酸，7ml/瓶；7)浓缩洗涤液1瓶，含0.05%吐温、0. 1%明胶、0. 05%叠氮钠的磷酸盐缓冲液0. 02M、 pH 7. 4，40ml/瓶;8)复溶工作液1瓶，50ml/瓶。
全文摘要
本发明提供的一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，建立免疫检测及对食品样品的处理方法，提供其方法的载体试剂盒。该检测方法的构建包括对检测样品的处置；包被抗原的制备；多克隆抗体的制备及竞争反应；加酶标二抗、显色等。获得的检测试剂盒包括包被原的酶标板1块；酶标二抗工作液1瓶；抗体工作液1瓶；乳酸链球菌素标准品溶液6瓶；底物显色液2瓶；终止液1瓶；浓缩洗涤液1瓶；复溶工作液1瓶。
文档编号G01N33/569GK102401830SQ20111020784
公开日2012年4月4日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者孟茹, 王振宝 申请人:伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心