专利名称：一种定量检测土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留的方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留检测方法，特别涉及一种定量检测土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留的方法。背景技术：
随着农业技术的现代化以及生产力的解放，化学除草剂已成为控制农田杂草危害的主要手段。自上世纪80年代杜邦公司推出第一个超高效磺酰脲类除草剂(绿磺隆)以来，磺酰脲类除草剂已成为当今世界农田杂草防治的重要除草剂，在我国亦被广泛应用，如在江苏无锡有31%的稻田使用苯磺隆+甲磺隆混剂防治杂草。这类除草剂用量特别低，每公顷的施用量只需2 75g活性成分；而且选择性强，对不同作物的敏感性差异很大，其微量残留即可对后茬敏感作物产生药害。如绿磺隆在土壤中的残留期较长，已危及非靶标植物，在我国旱作地区后茬为玉米、大豆、棉花的麦田已被禁用。在麦稻连作区，因使用不当亦会发生对水稻的药害，1995年沈阳曾发生绿磺隆危害水稻的重大事故，造成533. 4hm2稻田受害，其中267hm2绝收；1992年河北省使用甲磺隆后的麦田，给后茬玉米造成大面积药害； 1994年在江苏省油菜田施用胺苯磺隆，使后茬水稻发生大面积药害。在我国有不少磺酰脲类除草剂对后茬敏感作物产生药害事件的报道，国外也有类似报道。鉴于此，美国、欧盟、日本等发达国家或地区，相继对进口农产品中除草剂残留制定了最大残留限量标准(MRLs)。 美国规定，自2007年2月起，稻米产品中的磺酰脲类除草剂残留限量为0. 05mg/kg。
日本的肯定列表规定青花菜的氟啶嘧磺隆、啶嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆的 MRL均为0. 02mg/kg。欧盟规定荔枝中甲酰胺磺隆和啶嘧磺隆为0. 01mg/kgo因此，探讨磺酰脲类除草剂残留的分析测定方法对控制磺酰脲类除草剂残留药害具有重要意义。
目前，测定磺酰脲类除草剂在水及土壤中的残留主要有高效液相色谱法(HPLC)、 气相色谱法(GC)、色质联谱法(LC/MQ、酶联免疫法和生物测定法等，目前这些检测方法， 其检测限一般在mg/kg μ g/kg间。
然而，由于磺酰脲类除草剂用量低，其相应的残留浓度低而这种低残留浓度特性给土壤、水体、作物中这类化合物的分析测定就造成一定的困难。因此，寻找磺酰脲类化合物高灵敏度检测方法的研究已成为相关研究领域的热点之一。
毛细管电泳技术诞生以来，研究工作异常活跃，特别是进十来年，有大量有关毛细管电泳技术应用的报道。毛细管电泳技术已广泛应用于单分子检测、DNA、蛋白质、药物分析等方面，且灵敏度较高。但有关毛细管电泳技术应用于磺酰脲类除草剂残留检测报道很少。
本发明根据毛细管电泳技术灵敏度高的优点，与提取浓缩和定量补偿待测磺酰脲类除草剂相结合，建立了一种同时定量检测土壤中多种磺酰脲类除草剂痕量(10_3μ g/kg 级)残留检测的毛细管电泳分析方法，获得了满意的结果。
发明内容
本发明目的是提供一种同时定量检测土壤中多种磺酰脲类除草剂痕量(10_3μ g/kg级)残留检测的毛细管电泳分析方法。
本发明采用的技术方案是
一种定量检测土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留的方法，所述方法为将待测土样加入pH7. 8的0. lmol/L碳酸氢钠水溶液中，振荡lh，12000r/min离心5min，得沉淀和一次上清液，取一次上清液用0. IM盐酸水溶液调pH至2. 5后，装入预处理后的C18柱，再用二氯甲烷淋洗，收集淋出液，淋出液浓缩至干，浓缩物用体积浓度60%甲醇水溶液溶解，获得溶解液，将溶解液中补加混合标准储备液，再加入体积浓度60%甲醇水溶液定容制成混合液， 使混合液中补加的标准甲磺隆、标准绿磺隆及标准氯嘧磺隆终浓度均为5mg/L，获得待测样品，待测样品用毛细管电泳仪进行测试；根据甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆标准曲线，获得待测样品中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量，再根据公式(1)计算等测土样中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量；所述混合标准储备液为标准甲磺隆、标准绿磺隆和标准氯嘧磺隆终浓度均为100mg/L的混合溶液。
土壤中甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度的含量根据公式(1)计算土壤甲嘧磺隆、玉嘧磺隆或氯磺隆的量(mg/kg)= (P-S)X&公式(ι)m
公式(1)中P -根据标准曲线计算获得待测液中甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆的浓度(mg/L)；
V1——定容体积(mL)；
m——烘干土的质量(g)；
所述毛细管电泳仪测试条件为毛细管电泳仪采用UV检测器，内径75 μ m、有效柱长50cm的石英毛细管，毛细管电泳仪每次开机时，先用0. lmol/L盐酸冲洗柱子，然后依次用0. lmol/L氢氧化钠、去离子水、缓冲液分别冲洗毛细管柱10min、5min和20min。每次进样前用缓冲液冲洗毛细管柱anin ；结束分析时用0. lmol/L氢氧化钠冲洗毛细管柱lOmin，再用去离子水冲洗5min，检测波长214nm、分离电压25kV、温度35°C、进样38001^X10秒， 进样量IOyL0
所述缓冲溶液为pH5. 0冰醋酸-醋酸铵缓冲溶液，所述缓冲溶液由终浓度如下的原料组成50mmol/L冰醋酸、50mmol/L醋酸铵、80mmol/L SDS,体积浓度14%甲醇，体积浓度20%异丙醇。
进一步，所述方法为将等测土样加入pH7. 8的0. lmol/L碳酸氢钠水溶液中，振荡 lh, 12000r/min离心5min，得沉淀和一次上清液，所述沉淀再用pH7. 8的0. lmol/L碳酸氢钠水溶液重复振荡提取lh，离心，重复2次，将2次重复提取的上清液并入所述的一次上清液，取合并的总上清液用0. IM盐酸水溶液调pH至2. 5后装入预处理后的C18柱，再用二氯甲烷淋洗，收集淋出液，淋出液浓缩至干，浓缩物用体积浓度60%甲醇水溶液溶解，获得溶解液，将溶解液中补加混合标准储备液，再加入体积浓度60%甲醇水溶液定容制成混合液， 使混合液中补加的标准甲磺隆、标准绿磺隆及标准氯嘧磺隆终浓度均为5mg/L，获得待测样品，待测样品用毛细管电泳仪进行测试；根据甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆标准曲线，获得待测样品中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量，再根据公式(1)计算等测土样中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量；所述混合标准储备液为标准甲磺隆、标准绿磺隆和标准氯嘧磺隆终浓度均为100mg/L的混合溶液；所述C18柱预处理为依次用甲醇和重蒸水淋洗C18柱，弃去
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明方法检测灵敏度高，检测限达到10_3 μ g/kg级，高于高效液相色谱等其他现有方法的检测限值(不超过μ g/kg)。

图1标准曲线A为峰面积与甲磺隆浓度线性标准曲线、B为峰面积与氯嘧磺隆线性标准曲线、C为峰面积与绿磺隆浓度线性标准曲线
图2不同样品中甲磺隆、氯嘧磺隆和绿磺隆的毛细血管电泳分离图谱，其中a是未加磺酰脲除草剂土壤样品(组a) ；b是加10 X 10_3 μ g/kg磺酰脲除草剂土壤样品(组b)； c是加IOX 10_3μ g/kg磺酰脲除草剂土壤样品中补加5mg/L磺酰脲除草剂的试样(组c)， b和c中1为甲磺隆吸收峰，2为氯嘧磺隆吸收峰，3为绿磺隆吸收峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
1、药剂及材料
甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆标准品(美国Chemical Service公司)。
甲醇，异丙醇(色谱纯级)；醋酸铵，冰醋酸，盐酸，碳酸氢钠，氢氧化钠十二烷基磺酸钠(SDS)(分析纯级)；C18柱。
2、主要仪器
毛细管电泳仪(BeckmanP/ACE System 5000)，pH 计。
3、溶液配制及检测条件
(1)溶液配制
①磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆混合标准储备液精确称量甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆各IOmg混溶于IOOmL甲醇-水(60 40 ；ν/ν)混合溶剂中，得甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度分别为100mg/L混合标准储备液，于冰箱中4°C避光保存。
②缓冲液称取3g冰醋酸和3. 65g醋酸铵溶解到一定量水中，移入IL的容量瓶中， 同时在该容量瓶中加入27. 6g SDS、140mL甲醇和200mL异丙醇，用蒸馏水定容，调节pH至 5. 0，获得冰醋酸-醋酸铵缓冲液，即冰醋酸50_01/1、醋酸铵50_01/1、30380_01/1，14% 甲醇(ν/ν)，20%异丙醇(ν/ν) 0
③0. lmol/L盐酸和0. lmol/L氢氧化钠溶液移取9mL分析纯浓盐酸至L的容量瓶中，用蒸馏水定容，获得0. lmol/L盐酸；称取4g氢氧化钠溶解到一定量水中，移入IL的容量瓶中，用蒸馏水定容，获得0. lmol/L氢氧化钠溶液。
④0. lmol/L碳酸氢钠(pH7. 8)溶液称取8. 4g碳酸氢钠溶解到一定量水中，移入 IL的容量瓶中，用蒸馏水定容，调节pH至7.8，获得0. lmol/L碳酸氢钠(pH7. 8)溶液。
⑤体积浓度60%的甲醇水溶液即甲醇-水(60 40 ；ν/ν)溶液于IL的容量瓶中，加入600mL甲醇和400mL水，即获得甲醇-水(60 40 ；ν/ν)溶液。
(2)检测条件
毛细管电泳仪采用配件为UV检测器，内径75 μ m、有效柱长50cm的石英毛细管。毛5细管电泳仪每次开机时，先用0. lmol/L盐酸冲洗柱子，然后依次用0. lmol/L氢氧化钠、去离子水、缓冲液分别冲洗毛细管柱10min、5min和20min。每次进样前用缓冲液冲洗毛细管柱aiiin ；结束分析时用0. lmol/L氢氧化钠冲洗毛细管柱lOmin，再用去离子水冲洗5min。 检测波长214nm、分离电压25kV、温度35°C、进样3800PaX 10秒，进样量IOyL0
实施例1标准曲线绘制
分别移取25，50，100，200，300，400和500 μ L的100mg/L混合标准储备液至7个 5mL容量瓶中，用甲醇-水(60 40 ;v/v)混合溶剂定容，获得甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度均分别为0. 5，1. 0，2. 0，4. 0，6. 0，8. 0和10mg/L的混合标准溶液，采用上述检测条件进行毛细管电泳检测。采用峰面积与甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆各自的浓度绘制工作标准曲线，工作标准曲线用于甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆残留定量计算，结果见图1。
实施例2待测土壤样测定
称取IOOg烘干土重的土样于500mL三角瓶中，加入200mL 0. lmol/L碳酸氢钠 (pH7. 8)水溶液，用橡皮塞盖好振荡lh，于12000r/min离心5min。获取上清液，提取残渣再用相同碳酸氢钠溶液提取两遍，将所得上清液合并。合并后的上清液用0. IM盐酸溶液调pH 至2. 5，并装入C18柱(C18柱先通过用IOmL甲醇活化及IOmL重蒸水钝化，弃去淋出液)，再用IOmL 二氯甲烷淋洗C18柱，收集淋出液，用旋转蒸发器浓缩至干，浓缩物用ImL甲醇-水 (60 40 ；ν/ν)混合溶剂溶解，转入5mL容量瓶中，并于容量瓶中补加25 μ L的100mg/L混合标准储备液，用甲醇-水(60 40 ;v/v)混合溶剂定容使容量瓶中补加的甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆终浓度均为5mg/L，定容后用毛细管电泳测试，测试方法同上，根据标准曲线，计算甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度，根据公式(1)计算土壤中甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆残留浓度。
土壤中甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度的含量根据公式(1)计算土壤甲嘧磺隆、玉嘧磺隆或氯磺隆的量(mg/kg)= {ρ-5)χ&公式(1)m
公式(1)中P-标准曲线计算获得待测液中甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆的浓度 (mg/L)；
V1——定容体积(mL)；
m——烘干土的质量(g)；
实施例3稻田土壤样品中痕量甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆的测定
(1) 土壤用于检测的土壤样品采自浙江省杭州市郊区的稻田。该土样未被施用过磺酰脲类除草剂，土壤质地是沙壤土，粘粒含量18.0%，粉粒含量55.2%，沙粒含量 26. 8%, pH4. 74，有机质含量 1. 82%。
(2) lmg/L的混合标准储备液
分别精确称量甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆各Img混溶于IL重蒸水中，获得含甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆浓度分别为lmg/L的混合标准储备液。
(3)检测灵敏度
实验分成3组，组a、组b和组c，其中组a为对照组，不添加lmg/L的混合标准储备液，组b和组c为实验组，分别添加lmg/L的混合标准储备液制成含甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆浓度均分别为10X 10_3 μ g/kg的土样，同时组c的提取液经C18柱洗脱后的淋出液中补加lmg/L混合标准储备液，使补加的甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆终浓度均为5 μ g/L。
分别称取3份500g(烘干土计)土样于3个烧杯中，分别为组a、组b和组c，于组a、组b和组c中分别加入0、5、5mL的lmg/L混合标准储备液，充分混勻，组a获得含甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆均为0 μ g/kg，组b和组c获得含甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆均为 10 X 10_3 μ g/kg。将3组土样过Imm筛，于_20°C冷冻储存。分别称取IOOg冷冻土样(组a)、 200g冷冻土样(组b和组c)，于3个500mL三角瓶中，组a 组c分别加入200mL 0. Imo 1/ L碳酸氢钠溶液，用橡皮塞盖好振荡lh，于12000r/min离心5min，获取上清液，提取残渣再用0. lmol/L碳酸氢钠溶液提取两遍，将各组所得上清液分别合并，分别合并后的上清液用 0. lmol/L盐酸溶液调pH至2. 5，分别装入C18柱(C18柱通过用IOmL甲醇活化及IOmL重蒸水钝化，弃去淋出液)，再分别用IOmL 二氯甲烷淋洗C18柱，分别收集淋出液(组a 组 c)，分别用旋转蒸发器浓缩至干，残留物用ImL甲醇-水(60 40 ；ν/ν)混合溶剂溶解(其中组a中甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆的样品浓缩系数均为100，组b和组c中甲磺隆、绿磺隆、 氯嘧磺隆均为10 X 10_3 μ g/kg的样品浓缩系数均为200)，分别转入3个5mL容量瓶中(组 a 组c)，并于组c的容量瓶中补加25 μ L的100mg/L混合标准储备液，组a 组c分别用甲醇-水(60 40 ;v/v)混合溶剂定容，定容后用毛细管电泳测试，测试方法同上所述，根据标准曲线计算甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆浓度，再根据公式(1)计算土壤样品中甲磺隆、 绿磺隆及氯嘧磺隆浓度，结果见图2。
测定分离效果见图2，图2是不同样品中甲磺隆(1)、绿磺隆(3)和氯嘧磺隆(2)的毛细管电泳分离分离谱图，从图2的a可看出在没有添加除草剂的土壤测试样品中没有甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆的保留时间及吸收峰出现，表明没有被甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆污染。从图2的b可知土壤添加10Χ10_3μ g/kg甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆后，经提取浓缩 100倍后经毛细管电泳分离在甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆相应保留时间位置出现甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆的吸收峰，但吸收强度较弱，基线不稳，受土壤组分干扰较大。为了强化甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆分离效果，增强吸收峰吸收强度，测试中在土壤提取浓缩100倍后的待测样中补加5mg/L甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆，其毛细管电泳分离谱图见图2的c，从中可看出甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆分离效果较好，吸收峰吸收强度较大，基线平稳，受土壤组分干扰较小，甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆吸收峰峰面积增加到整个毛细管电泳分离谱图吸收峰峰面积的35%，据此待测土壤中甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆含量可通过工作曲线计算获得，可见相应干扰可通过补加定量浓度的待测化合物来排除。由此可见采用此方法具有较高的灵敏度，可检测土壤中10_3μ g/kg的甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆痕量残留。
(4)回收率
分别称取30份500g(烘干土计)土样于30个烧杯中，分为3组，分别为组d、 组e和组f，于组d、组e和组f中分别加入5、10、25mL的lmg/L混合标准储备液，充分混勻，获得含甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆均为IOX 10_3 μ g/kg (组d)，20Χ 10_3μ g/kg (组e)及 50 X 10_3 μ g/kg (组f)的土样，将3组土样过Imm筛，于_20°C冷冻储存。分别称取IOOg冷冻土样(组e和组f)和200g冷冻土样(组d)，于30个500mL三角瓶中，分别加入200mL 0. lmol/L碳酸氢钠溶液，用橡皮塞盖好振荡lh，于12000r/min离心5min，获取上清液，提取残渣再用0. lmol/L碳酸氢钠溶液提取两遍，将各组所得上清液分别合并，分别合并后的上清液用0. lmol/L盐酸溶液调pH至2. 5，分别装入C18柱(C18柱通过用IOmL甲醇活化及IOmL重蒸水钝化，弃去淋出液)，再分别用IOmL 二氯甲烷淋洗C18柱，分别收集淋出液 (组d 组f)，用旋转蒸发器浓缩至干，残留物分别用ImL甲醇-水(60 40;v/v)混合溶剂溶解(其中甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆均为20X 10-3 μ g/kg或50X 10_3μ g/kg的样品浓缩系数为100，甲磺隆、绿磺隆、氯嘧磺隆均为10 X 10_3 μ g/kg的样品浓缩系数为200)，分别转入30个5mL容量瓶中，并于容量瓶中补加25 μ L的100mg/L混合标准储备液，再分别用甲醇-水(60 40 ;v/v)混合溶剂定容，定容后用毛细管电泳测试，测定方法同实施例2。
30份样品中甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆提取后测定的回收率见表1。从表1中可看出甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆三者的平均回收率分别为97. 7士 1.6%、96.0士 1.4%和 98. 6士2. 3% ；且在10 50X 10_3 μ g/kg围内回收率不受甲磺隆、绿磺隆和氯嘧磺隆浓度的影响，表明毛细管电泳方法是对痕量及多种磺酰脲除草剂混合残留有效分离和测定的方法。
表1.不同浓度样品中甲磺隆、氯嘧磺隆和绿磺隆的回收率
权利要求
1.一种定量检测土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留的方法，其特征在于所述方法为将等测土样加入PH7. 8的0. lmol/L碳酸氢钠水溶液中，振荡lh，12000r/min离心5min，得沉淀与一次上清液，取一次上清液用0. IM盐酸水溶液调pH至2. 5，装入预处理后的C18柱，再用二氯甲烷淋洗，收集淋出液，淋出液浓缩至干，浓缩物用体积浓度60%甲醇水溶液溶解， 获得溶解液，将溶解液中补加混合标准储备液，再加入体积浓度60%甲醇水溶液制成混合液，使混合液中补加的标准甲磺隆、标准绿磺隆及标准氯嘧磺隆终浓度均为5mg/L，获得待测样品，待测样品用毛细管电泳仪进行测试；根据甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆标准曲线，获得待测样品中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量；所述混合标准储备液为标准甲磺隆、标准绿磺隆和标准氯嘧磺隆终浓度均为100mg/L的混合溶液。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述毛细管电泳仪测试条件为毛细管电泳仪采用UV检测器，内径75 μ m、有效柱长50cm的石英毛细管，毛细管电泳仪每次开机时，先用0. lmol/L盐酸冲洗柱子，然后依次用0. lmol/L氢氧化钠、去离子水、缓冲液分别冲洗毛细管柱10min、5min和20min。每次进样前用缓冲液冲洗毛细管柱^iiin ；结束分析时用 0. lmol/L氢氧化钠冲洗毛细管柱lOmin，再用去离子水冲洗5min，检测波长214nm、分离电压25kV、温度;35°C、进样 38001^X10 秒，进样量 10 μ L。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述缓冲溶液为ρΗ5.0冰醋酸-醋酸铵缓冲溶液，所述缓冲溶液由终浓度如下的原料组成50mmol/L冰醋酸、50mmol/L醋酸铵、 80mmol/L SDS，体积浓度14%甲醇，体积浓度20%异丙醇。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述沉淀再用pH7.8的0. lmol/L碳酸氢钠水溶液重复振荡提取lh，离心，重复2次，将2次重复提取的上清液并入所述的一次上清液，取合并的总上清液用0. IM盐酸水溶液调pH至2. 5后装入预处理后的C18柱。
5.如权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于所述C18柱预处理为依次用甲醇和重蒸水淋洗C18柱，弃去淋洗液。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测土壤中磺酰脲类除草剂痕量残留的方法将待测土样加入pH7.8的0.1mol/L碳酸氢钠水溶液中，振荡1h，12000r/min离心5min，得沉淀和一次上清液，取一次上清液用0.1M盐酸水溶液调pH至2.5后，制备待测样品，待测样品用毛细管电泳仪进行测试；根据甲磺隆、绿磺隆及氯嘧磺隆标准曲线，获得待测样品中甲磺隆、绿磺隆或氯嘧磺隆的含量；本发明方法检测灵敏度高，检测限达到10-3μg/kg级，高于高效液相色谱等其他现有方法的检测限值(不超过μg/kg)。
文档编号G01N30/02GK102539559SQ20111043846
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月24日 优先权日2011年12月24日
发明者廖敏, 谢晓梅 申请人:浙江大学