专利名称：：检测百菌清农药残留的方法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测果蔬中百菌清农药残留的方法，以及百菌清ELISA检测试剂盒，同时，本发明还涉及百菌清人工完全抗原的制备方法和百菌清多克隆抗体，属于酶联免疫分析
技术领域：
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背景技术：
：百菌清(chlorothakmil)是一种广谱性杀菌剂，在植物表面有良好的黏着性，不易受雨水冲刷，药效稳定。其纯品为白色结晶，无臭味,不溶于水，微溶于丙酮等有机溶剂，对高等动物低毒，但对鱼类及甲壳类动物毒性较大,主要用于防治蔬菜的霜霉病、炭疽病、疫病等(农业部农药检定所.新编农药手册[M].北京:农业出版社，1989,316-317.)。我国无公害蔬菜中规定百菌清残留量不得超过1mg/kg，欧盟则规定百菌清的残留不能高于0.01mg/kg(中国标准出版社第一编辑室.无公害食品标准汇编，蔬菜巻[M].北京中国标准出版社，2003,第1版，41.)。现有的检测方法主要了色谱法、光谱法、色谱-质谱联用技术、色谱-光谱联用法、多维气相色谱技术、毛细管电泳法等(康长安，何娟，杨柳，高会云，刘德仓，卢奎.色谱、光谱及联用技术在多农药残留检测中的应用.环境监测管理与技术.2007，19(4):9-13,31;李海燕，施银桃，曾庆福.毛细管电泳法直接测定化工废水中邻苯二甲酸二丁酯[J].环境监测管理与技术，2006,18(4):19-20.)在实验室进行。应用这些理化技术对粮油、果蔬样品中痕量的百菌清残留进行分析，其仪器化程度要求高，而且要经过繁琐的分离、提取、净化、衍生等前处理，分析速度慢且成本高。随着待检样品量的增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，研制开发一种快速、高效、廉价的百菌清检测方法就显得尤为重要。80年代以来，免疫学技术在农药残留中的检测应用越来越深入，ELISA法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。有关ELISA法检定农残的试剂盒层出不穷，但关于检测百菌清的ELISA试剂盒还未见报道。本发明百菌清ELISA检测试剂盒的研制填补了国内空白。
发明内容本发明的目的是研制开发一种检测果蔬中百菌清农药残留的ELISA试剂盒及用该试剂盒检测果蔬中百菌清农药残留的方法，该方法能够快速、高效地检测果蔬中百菌清的农药残留，而且成本廉价。同时，本发明还提供百菌清人工完全抗原的制备方法和百菌清多克隆抗体。本发明提供的技术方案是一种百菌清人工完全抗原的制备方法，包括如下步骤1)将百菌清和氟化钾溶解于乙二醇溶液中，油浴反应；2)将反应液冷却到室温后，倾入冰水中，沉淀完全后，经后处理得白色粉末，即为半抗原；3)将上述半抗原溶解于DMF中，再加入咪唑酮进行反应，加入牛血清白蛋白，搅拌；4)进行透析，离心，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。其中，半抗原的具体合成过程是一定量的百菌清(干燥)和氟化钾溶解于乙二醇溶液中，在搅拌下，90。C油浴，36小时停止反应，将反应液冷却到室温后，倾入适量冰水中，沉淀完全后，经后处理得白色粉末，将获得的白色粉末于硅胶柱(300-400目)层析得目标产物2,4,5-三氯-6-(2-羟基乙氧基)间苯二腈，即半抗原。人工完全抗原的具体合成过程是将获得的上述半抗原(白色粉末)适量溶解于适量DMF中，于室温搅拌，使其完全溶解，再加入适量咪唑酮，于室温缓慢搅拌3h;于上述反应液中加入适量牛血清白蛋白，再加入适量pH7.4PBS，于4。C搅拌14h左右；透析，离心，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。一种百菌清多克隆抗体，由上述方法制备的百菌清人工完全抗原免疫动物得到，其中，免疫动物优选家兔。一种ELISA检测百菌清农药残留的方法，采用上述的百菌清多克隆抗体作为一抗。所述的ELISA检测百菌清农药残留的方法，包括如下步骤(1)抗原包被对待测样品进行包被；(2)封闭用封闭液进行封闭；(3)加一抗加入权利要求2的多克隆抗体；(4)加入酶标羊抗兔二抗，进行孵育；(5)加底物液显色加入新鲜配制的TMB底(6)终止反应加入终止反应液终止反应；(7)结果判定将测定的OD值与阴性对照比较，或者在白色背景下，直接用肉眼观察来确定阳性或阴性结果。上述第(7)步的结果判定是用酶标仪于450nrn和655nrn处进行双波长扫描，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，或在白色背景下，直接用肉眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。上述第(1)步中待测样品为蔬菜汁。一种百菌清ELISA检测试剂盒，包括PBS的浓縮洗涤缓冲液、百菌清标准液、如权利要求2的抗百菌清的多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、包被缓冲液、封闭缓冲液、底物溶液、浓縮底物缓冲液、反应终止液、H202。所述百菌清标准液的浓度为10100ug'mL"。所述PBS的浓縮洗涤缓冲液的pH7.4，包被缓冲液的pH9.6，浓縮底物缓冲液的pH5.5。ELISA检测百菌清农药残留的方法，其具体操作过程是(1)抗原包被将某一列的第一孔加O.lmL百菌清标准样品和O.lmL包被缓冲液，以下各孔按行进行倍比稀释，作为阳性对照，其余各孔则包被待检样品，37'C包被0.5h。再洗涤，沥干。其中，洗涤是用稀释成1X洗涤缓冲液洗涤35次，每次3分钟。(2)封闭每孔用3%的明胶液进行封闭。每个包被孔中加入0.3mL的封闭液，温育0.5h。清洗并沥干。(3)加一抗每个反应孔加入O.lmL—抗于上述已包被之反应孔中，37。C包被0.5h，然后洗涤。(4)加酶标羊抗兔二抗各反应孔中加入二抗O.lmL，37'C孵育0.5h，洗涤。(5)加底物液显色于各孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液O.lmL，37'C孵育1030min。(6)终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0.05mL。在实验过程中设计空白对照孔，即空白孔只在最后一步加底物缓冲液和终止液。(7)结果判定用酶标仪于450nm和655nm处进行双波长扫描，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照0D值的2.1倍，即为阳性。也可在白色背景下，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，根据所呈颜色的深浅，以"+"、"一"号表示。其中，上述第(1)、(3)、(4)步中所述的洗涤是用稀释成1X洗涤缓冲液洗涤35次，每次3分钟。本发明具有以下有益效果本发明利用乙二醇取代百菌清分子6位碳原子上的氯原子合成半抗原，再采用咪唑酮法将半抗原连接到载体牛血清白蛋白分子上形成人工完全抗原，用该抗原免疫家兔制备多克隆抗体并和相关试剂组装ELISA试剂盒，以抗原-一抗-酶标二抗的ELISA间接法检测百菌清农药残留。本发明的方法具有成本低、效率高、检测限低的优点，一次检测96个样品可在4h内完成，检测的最低限为0.016mg'kg—1。图1百菌清半抗原、人工完全抗原的合成路线图图2百菌清半抗原的红外光谱图图3百菌清半抗原的质谱图图4百菌清半抗原的^-NMR图5百菌清半抗原的13C-NMR(CD3COCD3)图6百菌清半抗原(左)、BSA(中)、人工抗原(右)紫外光谱图图7百菌清半抗原、BSA、人工完全抗原的红外光谱图，其中，1半抗原；2人工抗原；3BSA。具体实施例方式下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。1.半抗原的分子设计及合成百菌清半抗原及人工完全抗原的合成路线见图1。精密称取干燥的百菌清500mg(1.9鹏ol)和氟化钾273mg(4.7mmol)，溶解于20mL乙二醇溶液中，在90°C油浴条件下搅拌，36小时后停止反应，将反应液冷却到室温后，倾入50g冰水中，沉淀完全后，经抽滤、冰水洗涤、真空干燥得262mg白色粉末。以石油醚丙酮=9:1(V/V)为洗脱液洗脱，硅胶柱(300-400目)柱层析分离，等体积(lOmL)收集馏分，TLC检测合并相同流分，得到目标产物97mg，具有如图2所示红外光谱图，如图3所示的质谱图，如图4所示的^-NMR，如图5所示的"C-NMR，故鉴定为2，4,5-三氯_6-(2-羟基乙氧基)-间苯二氰，为百菌清半抗原。2.人工完全抗原的合成称取16.3mg百菌清半抗原溶解于2mLDMF中，于室温搅拌，使其完全溶解，再加入9.1mg咪唑酮，于室温缓慢搅拌3h;于上述反应液中加入37.7mg牛血清白蛋白，再加入6mLpH7.4PBS，于4。C搅拌14h左右；用7000D的透析袋透析，沉淀，12000卬m离心10min，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末，百菌清人工完全抗原的结构表征参见图7和图8。3.特异性抗体的制备用免疫学的方法免疫家兔，人工抗原的用量0.1mg/kg兔子，第一次免疫与第二次之间隔12天，第二次与第三次之间隔13天，第三次免疫结束后第18天采集血清。4.ELISA法检测蔬菜中百菌清的残留(1)包被用包被缓冲液将百菌清农药稀释至10100ug'mL"作为百菌清标准液，于反应孔中加入O.lmL，再加入0.lmL包被缓冲液，同时在其它孔加入待检样品如蔬菜汁和包被缓冲液各0.lmL，混匀，37'C包被0.5h。再用洗涤缓冲液洗涤35次，每次3分钟，沥干。(2)封闭用3%的明胶液进行封闭。每个包被孔中加入0.3mL的封闭液，温育0.5h。沥干。(3)加上述方法制备得到的多克隆抗体作为一抗于上述已包被的反应孔中加入用洗涤缓冲液稀释的血清抗体(1:1000)0.lmL，37。C温育0.5h，然后用洗涤缓冲液洗涤35次，每次3分钟，沥干。(4)加酶标羊抗兔二抗于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标羊抗兔二抗(按l:1000稀释)0.1mL，37'C孵育0.5h，用洗涤缓冲液洗涤35次，每次3分钟，沥干。(5)加底物液显色于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液O.lmL，37'C孵育1030min。此时阳性反应孔呈蓝色。(6)终止反应于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。此时原来的蓝色孔变成棕黄色或黄色。在实验过程中设计空白对照孔，即空白孔只在最后一步加底物缓冲液和终止液。(7)结果判定用酶标仪于450nm和655nm处进行双波长扫描，以空白对照孔调零后测定各孔的光吸收值，若大于规定的阴性对照光吸收值的2.l倍，即为阳性。也可在白色背景下，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，根据所呈颜色的深浅，以"+"、"一"号表示。多次重复平均结果见下表l:表1用该ELISA试剂盒检测待检样品中百菌清残留的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l结果可知，该试剂盒可用于检测粮油和果蔬中的百菌清农药残留量，肉眼检测最低限为0.032mg/kg，酶标仪检测最低限0.016mg/kg。权利要求1.一种百菌清人工完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)将百菌清和氟化钾溶解于乙二醇溶液中，油浴反应；2)将反应液冷却到室温后，倾入冰水中，沉淀完全后，经后处理得白色粉末，即为半抗原；3)将上述半抗原溶解于DMF中，再加入咪唑酮进行反应，加入牛血清白蛋白，搅拌；4)进行透析，离心，干燥，获得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。2.—种百菌清多克隆抗体，其特征在于，根据权利要求1所述的方法制备的百菌清人工完全抗原免疫动物得到。3.—种ELISA检测百菌清农药残留的方法，其特征在于采用如权利要求2所述的多克隆抗体作为一抗。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步骤(1)对待测样品进行包被；(2)用封闭液进行封闭；(3)加入权利要求2的多克隆抗体作为一抗；(4)加入酶标羊抗兔二抗，进行孵育；(5)加入新鲜配制的TMB底物溶液；(6)加入终止反应液终止反应；(7)结果判定将测定的OD值与阴性对照比较，或者在白色背景下，直接用肉眼观察来确定阳性或阴性结果。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于第(7)步结果判定是用酶标仪于450nm和655nm处进行双波长扫描，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照0D值的2.1倍，即为阳性，或在白色背景下，直接用肉眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述待测样品为蔬菜汁。7.—种百菌清ELISA检测试剂盒，包括PBS的浓縮洗涤缓冲液、百菌清标准液、如权利要求2的抗百菌清的多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、包被缓冲液、封闭缓冲液、底物溶液、浓縮底物缓冲液、反应终止液、H202。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述百菌清标准液的浓度为10lOOug-mL"。9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述PBS的浓縮洗涤缓冲液的pH7.4，包被缓冲液的pH9.6，浓縮底物缓冲液的pH5.5。全文摘要本发明涉及一种百菌清农药残留ELISA检测方法及其试剂盒。利用乙二醇取代百菌清分子6位碳原子上的氯原子合成半抗原，再采用咪唑酮法将半抗原连接到载体牛血清白蛋白分子上形成人工完全抗原，用该抗原免疫家兔制备多克隆抗体并和相关试剂组装ELISA试剂盒，以抗原-一抗-酶标二抗的ELISA间接法检测百菌清农药残留。本发明具有成本低、效率高、检测限低的优点，一次检测96个样品可在4h内完成，检测的最低限为0.016mg·kg^-1。文档编号G01N33/543GK101412756SQ20081022723公开日2009年4月22日申请日期2008年11月25日优先权日2008年11月25日发明者万传星,波井,刘文杰,张利莉,王彦芹,白红进,赵小亮,伟陈申请人:塔里木大学