专利名称：登革热抗原诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种登革热抗原诊断试剂盒。
背景技术：
登革热(Dengue Fever，简称DF)是由登革热病毒引起的急性传染病。登革热病毒属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),按流行病学分类属虫媒病毒B组,血清学上分4个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊(俗称花斑蚊)传播。临床上以高热、出血、全身肌肉和关节痛等为主要症状，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白细胞减少等现象。登革热病毒感染除引起登革热外，严重的还可导致登革出血热(denguehemorrhagic fever, DHF)或登革休克综合症(dengue shocksyndrome, DSS)等症状。其传染源主要是处于病毒血症期的显性和隐性的感染者，在城市型疫源地区普遍易感。其中尤以青壮年发病率最高。在地方性流行区，发病者多为儿童，20岁以下的居民，100%在血清中能检出抗登革热病毒的中核抗体。登革热的发现已有200多年的历史，早期记载的报道是1779年埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城，并根据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。中国于1978年在广东流行，并分离出IV型登革热病毒。此后，1979、1980、1985年小流行中分离出I型、II型、III型病毒。目前各地区主要以爆发或散发为主，并且以输入型病例引发的流行居多。目前，该病毒广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和西太平洋区的100多个国家和地区，据WHO估计，全球约有25亿人口的健康受到威胁，每年有5000万人感染登革病毒。登革热病毒已经成为一种分布最广，发病最多，危害较大的虫媒病毒性疾病。并且这一疫情来势急，扩散快，不容易控制，对广大人民群众的生命健康产生了巨大威胁，对地方经济发展产生了极大影响。随着全球气候变暖日趋严重，登革热地理分布上有蔓延的趋势，发病率和疫情的严重程度也有所增加。登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。由此可见，尽早发现并尽早对登革热患者采取隔离措施并进行对症治疗，从源头上对登革热病毒的蔓延进行有效遏制，是防止登革热病毒传播的最佳途径和手段。目前，针对登革热病毒的检测方法主要有以下三种病毒分离培养；蛋白质检测(抗原/抗体)；核酸检测(DNA/RNA)。其中，特异性病毒分离培养是登革热病毒检测最原始、经典的方法，但由于操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题，该方法在实际工作中难以推广应用。其次，蛋白质检测主要包括了抗原和抗体检测，目前主要是采用ELISA的方法进行，这种方法耗时比较长，同时需要专业人员进行操作。另外一种是中国海康生命科技有限公司(HKLife)的实时荧光PCR法(Real time-PCR),该方法通过检测病毒核酸是否存在来判断病患是否感染了登革热病毒，可在病毒刚开始繁殖但没有刺激机体产生抗体前，检测到病毒的核酸，是登革热早期诊断的理想方法。然而，该法需要昂贵的仪器和专业人员进行操作，耗时也很长，适宜作为确证方法，但不能进行大范围初筛在基层地区推广。在蛋白质检测的现有技术中，如专利号为200510086853. 2公布的《一种登革热病毒抗体胶体金检测试纸条》，通过检测登革热病毒抗体的存在与否来判断被测者是否感染了登革热病毒。然而，据了解，人感染了登革热病毒后，一般要经过3-10天(通常4-5天)的潜伏期，受感染者才会出现以发热、疼痛为主的登革热症状，同时，机体的免疫系统才会产生一系列的免疫应答反应，产生相应抗体。而初次感染登革病毒，机体产生抗体的速度较慢，滴度也较低。因此，如采用对患者体内登革病毒抗体进行检测，则需要等4-5天，待机体的免疫应答产生的登革抗体达到一定量时，登革病毒才能被检测出来。这样一来，在登革病毒的潜伏期，即使患者已经有发热、疼痛等相应症状出现，利用现有技术，仍无法判断是否为登革热疾病。这样一来，由于登革热病毒来势急，确诊时间上的延缓将可能导致错过对患者进行隔离和治疗的最佳时机，极其容易导致登革热病毒的快速扩散，严重威胁到人民群众的生命财产安全，对社会和谐稳定造成不可估量的负面影响。由此可见，这种对于登革热病毒抗体的检测方法并不利于登革热疫情的早发现早治疗，不能及时遏制登革疫情的扩散传播。相反，若能在登革热病毒入侵之时从病毒源头入手，对登革热抗原进行有效检测，争取在第一时间发现该病毒，及早采取措施，充分利用时间，抢先在登革热病毒发作之前把疑似患者隔离开来，进行有效治疗，无疑将大大提高治疗效率，有效遏制病毒扩散，而无需等到患者出现相应症状，甚至等到病毒抗体产生到一定程度，过了病毒的潜伏期才能将病毒检测出来。

实用新型内容为了解决上述问题，本实用新型提供了一种登革热抗原诊断试剂盒，可对登革热病毒抗原进行有效检测，及时发现并测出登革热病毒，与时间赛跑，从源头上抢先对登革热疫情进行有效控制，进而及时遏制登革热病毒的传播蔓延。本实用新型解决其技术问题采用的技术方案是一种登革热抗原诊断试剂盒，包括登革热抗原诊断试纸条，所述试纸条包括样品垫、胶体金颗粒标记垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，胶体金颗粒标记垫上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体以及鼠IgG或兔IgG，检测线上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体，质控线上包被有抗鼠IgG或抗兔IgG。所述与抗登革热病毒抗原相对应的抗体为抗登革热病毒抗原多克隆抗体或抗登革热病毒抗原单克隆抗体；所述抗鼠IgG或抗兔IgG为抗鼠IgG多克隆抗体或抗兔IgG多克隆抗体。本实用新型的登革热抗原诊断试剂盒利用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测登革热抗原。在其中一个实施例中，当待测样本中含有登革热抗原且抗原浓度等于或高于最低检测限时，登革热抗原和金标抗体(Ab-Au)形成反应复合物Ag-Ab-Au，由于层析作用，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，当遇到检测区(T)包被抗登革热抗原多克隆抗体时，形成Ab-Ag-Ab-Au复合物，在检测区上最终形成一条红色反应线，此时结果为阳性；相反，当样本不含登革热抗原且抗原浓度低于最低检测限时，则检测区无红色反应线出现，此时结果为阴性。质控区(C)包被抗鼠IgG抗体(或抗兔IgG抗体)，与胶体金标记的鼠IgG (或兔IgG)反应形成红色反应线作为质控表示实验有效进行。实验时，受吸水纸的引力作用，检测样品液体将流经胶体金颗粒标记垫、NC膜上的检测线、质控线，并与相应位置上的包被物质发生反应。在其中一个实施例中，当检测样品中含有登革热抗原时，该抗原流经胶体金颗粒标记垫，与标记有胶体金的抗登革热抗原单克隆抗体结合，形成Ag-Ab-Au。接着,在流经试纸条的检测线T线时，该复合物与检测线上包被着的抗登革热抗原多克隆抗体结合，形成Ab-Ag-Ab-Au反应复合物,此时，由于该复合物被标记了胶体金，T线上显现红色,表示样品中含有登革热抗原。同时，由于胶体金垫上标记有鼠IgG (或兔IgG)，当液体受引力作用将金子垫上标记有胶体金的鼠IgG (或兔IgG)带到质控线时，与质控线上的抗鼠IgG多克隆抗体(或抗兔IgG多克隆抗体)结合并显色，表示实验的有效进行。相反，如果样品中没有登革热抗原，由于没有相应登革热抗原与金子垫上的抗登革热抗原单克隆抗体结合并被标上胶体金，缺少目标抗原的参与，检测线上无法形成双抗体夹心，也无法将胶体金顺利拦截在T线上，因此检测线不显色；而不管待检样品中是否存在登革热抗原，只要实验正常进行，质控线均正常显色，不显色则说明胶体金颗粒标记垫上包被的鼠IgG (或兔IgG)没有正常与质控线上的抗鼠IgG多克隆抗体(或抗兔IgG多克隆抗体)结合，即待检样品没有正常流经试纸条的所有关键位置，表示实验无效。与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果本实用新型对登革热病毒的检测是通过检测该病毒抗原，因此，可在登革热病毒侵入患者体内之后第一时间对病毒进行检测，相比于现有技术中对登革热病毒抗体的检测，该实用新型无需等到患者出现相应症状，甚至等到病毒抗体的量产生到一定程度，过了病毒的潜伏期才能对病毒的存在与否进行判断。该试剂盒有利于相关人员在第一时间发现登革疫情，及时采取有效措施，做到早发现早隔离早治疗，及时消除潜在隐患，将登革热病毒扼杀于摇篮中，阻止其扩散蔓延。同时，该方法简便快捷，不需要任何辅助仪器，操作人员只需要经过简单的培训或者参考说明书就可以进行检测。

图1为登革热抗原诊断试剂盒内的试纸条的结构示意图，箭头部分表示滴加样本液体的位置。图2是本实用新型登革热抗原诊断试剂盒的结果判读参照图。

标记5、胶体金免疫层析检测试纸条；51、试纸条底板；52、样品垫；53、胶体金颗粒标记垫；54、硝酸纤维素膜；55、吸水纸；T、检测线；C、质控线。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型的实施例进行详细说明实施例1 :请参阅图1、图2，本实用新型一种登革热抗原诊断试剂盒，包括登革热抗原诊断试纸条5，该试纸条包括，该试纸条5包括样品垫52、胶体金颗粒标记垫53、硝酸纤维素膜54、吸水纸5。其中，胶体金颗粒标记垫53上包被有鼠IgG和抗登革热NSl抗原单克隆抗体；硝酸纤维素膜54上设有质控线C和检测线T，其中，检测线T包被有登革热NSl抗原多克隆抗体，如待测样品中存在登革热NSl抗原四型中的一种，该抗原则与胶体金颗粒标记垫上的相应抗登革热NSl抗原单克隆抗体形成复合物Ag-Ab-Au后，再与T线上的抗登革热NSl多克隆抗体反应形成Ab-Ag-Ab-Au复合物。T线的显色与否表示阴性或阳性的测试结果。质控线包被有抗鼠IgG多克隆抗体，用于与胶体金颗粒标记垫上包被着的鼠IgG反应形成复合物，其显色表示实验的正常进行，不显色则说明实验无效。利用该实施例的试剂盒在室温下进行检测，检测步骤为(I)将包装试剂盒的铝箔袋沿切口部位撕开，取出试剂盒平放于台面上，并做好标记；(2)用吸管吸取血清、血浆样本，然后垂直加入3-4滴(约80μ1)于加样孔中；若为全血样本，则用吸管吸取全血,垂直加入2滴(约50μ1)于加样孔中，同时滴加1-2滴稀释液。(3) 15-20分钟观察显示结果；30分钟后显示的结果无意义。如果仅有质控线变为红色，检测线不显色，表明样本中不含登革热抗原且登革热抗原的浓度低于最低检测限，此时结果为阴性；如果检测线和质控线均变为红色，表明样本中含有登革热抗原且抗原浓度等于或高于最低检测限，此时结果为阳性。如果质控线不显色，则说明检测无效，检测结果作废，建议用新卡重新测试。(4)测试结果可参照图2进行判读。实施例2:本实施例的登革热抗原诊断试剂盒，除了硝酸纤维素膜54上的质控线C包被的是抗兔IgG多克隆抗体，胶体金颗粒标记垫53上包被的是兔IgG和抗登革热NSl抗原单克隆抗体，这一点与实施例1 不同之外，试剂盒结构等其他方面与实施例1相同。按照实施例1相同的操作方法进行操作，可知利用本实施例的试剂盒，同样可实现对登革热抗原的检测。实施例3 本实施例的登革热抗原诊断试剂盒，除了检测线T上包被的是抗登革热NSl抗原单克隆抗体，胶体金颗粒标记垫上标记的是抗登革热NSl抗原多克隆抗体和鼠IgG之外，其余均与实施例1 一致。按照实施例1相同的操作方法进行操作，根据双抗夹心法原理，可知利用本实施例的试剂盒，同样可实现对登革热抗原的检测。以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求1.一种登革热抗原诊断试剂盒，其特征在于，包括登革热抗原诊断试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在试纸条底板上构成； 所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；其中，胶体金颗粒标记垫上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体以及鼠IgG或兔IgG，检测线上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体，质控线上包被有抗鼠IgG或抗兔IgG。
2.如权利要求1所述的登革热抗原诊断试剂盒，其特征在于，所述与抗登革热病毒抗原相对应的抗体为抗登革热病毒抗原多克隆抗体或抗登革热病毒抗原单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的登革热抗原诊断试剂盒，其特征在于，所述抗鼠IgG或抗兔IgG 为抗鼠IgG多克隆抗体或抗兔IgG多克隆抗体。
专利摘要本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种登革热抗原诊断试剂盒。包括登革热抗原诊断试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在试纸条底板上构成；所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；其中，胶体金颗粒标记垫上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体以及鼠IgG或兔IgG，检测线上包被有与抗登革热病毒抗原相对应的抗体，质控线上包被有抗鼠IgG或抗兔IgG。本实用新型可对登革热病毒抗原进行有效检测，及时发现并测出登革热病毒，从源头上抢先对登革热疫情进行有效控制，进而及时遏制登革热病毒的传播蔓延。
文档编号G01N33/558GK202886382SQ20122043671
公开日2013年4月17日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者李高辉, 王继华 申请人:广州万孚生物技术股份有限公司