专利名称：单细胞藻流式分析微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用流式细胞仪原理设计制作的适用于海洋单细胞藻检测的微流控芯片。
背景技术：
微全分析系统(Micro-total analysis system，μ-TAS)概念的提出在分析科学领域产生了重大影响，引导化学分析设备向着微型化、集成化与便携化的趋势发展。它利用微加工工艺在芯片上制作微阀、微管道、微反应器、微流量传感器、微检测器等功能单元构成微型化学系统。微流控芯片系统具有高效、低耗、微型化和集成化的特点，适于各类现场分析和实时测定。1995年Mathies和Woolley首次采用微电泳芯片进行了DNA测序研究，在有效分离长度3.5cm的通道上，10min内测序约150个碱基，准确率97％。1998年Ramsey等在微流控芯片上集成了细胞消解、PCR扩增和电泳分离等功能的微芯片基因分析系统。
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
使用流式细胞仪检测微型浮游植物正为越来越多的研究者所采用，Paau等和Yentsch等都作了相关研究，促进了流式细胞计在海洋微型浮游植物检测中的运用。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，细胞体内色素及其他物质在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。前向角散射光的强度与细胞的大小有关。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。特定波长荧光信号的强度代表了所测单细胞藻中色素的组成和含量。但目前，流式细胞仪价格昂贵，结构复杂，不适用于现场分析，微流控芯片的出现为流式细胞技术的现场应用提供了可能。

发明内容
本发明的目的是提供一种微型、便携且适于现场分析的微流控芯片，它可以对海洋单细胞藻进行计数和种群组成分析。
本发明是以标准光刻技术为基础，以玻璃为微流控芯片材料，在芯片上构建微通道和微储液池，使样品的进样、检测集成在芯片上来完成。微流控芯片包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有液流系统和用于检测的光纤通道。液流系统采用ψ型结构，中间通道为样品通道，两侧支通道称为鞘流通道，鞘流通道的作用是样品中的藻细胞以单行排列，样品通道与鞘流通道尺寸一致，鞘流通道为1/4圆弧状，样品通道与鞘流通道端点切线方向相一致，这样鞘流与样品流同向汇合，避免液流汇合产生涡流扰动，保证了液流系统的稳定性；样品通道与鞘流通道的末端分别构建有储液池，样品通道的另一端还有一废液池；在芯片上构建与进样通道垂直的光纤通道，使激光器耦合光纤水平插入该通道，将激发光引入到分离通道的检测区域附近。在进样通道的另一侧与入射光光纤通道平行的位置构建光纤通道，用于将前向散射光引入相应检测器。在芯片进样通道监测区域上方安置光学检测系统，检测荧光和侧向散射光，当藻细胞经过检测口时，受到激光照射，产生荧光(黄荧光、红荧光、绿荧光)和散射光(前向散射和侧向散射)，通过对几种光信号的综合分析，对藻进行计数和分类。该芯片省去了由多个光学元件才能完成的三维准直、反射和会聚复杂光路系统，将光传输过程中的强度损失降到最低，实现了微流控芯片系统的微型化、便携化和集成化的特点。
本发明将流式细胞仪液流系统和光学检测系统集成，体现了微流控芯片系统的微型化和集成化的特点，适于各类现场分析和实时测定。广泛应用于单细胞藻、培养细胞、血球等领域。
本发明的微流控芯片的设计和制作方法如下所述A.将根据微流控芯片结构设计的芯片图形制成掩膜，图形区为透明区，可透射光，非图形区为黑色区，吸光而不能透射光。
B.将掩膜覆盖在63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板(铬型LRC；铬厚T145nm胶类正性感光胶；胶厚570nm)上，在紫外线照射下曝光，感光胶发生光化学反应。
C.曝光后的铬板在显影液中显影，以除去被曝光的正性感光胶，掩膜上的图形被复制到光胶层上。
D.室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀裸露的铬膜，高纯水冲洗干净后，烘干。光胶层上的图形被转移到了基片上，同时保证非图形区的光胶层和铬膜不被破坏。
E.湿法刻蚀微通道。以0.5M HF/0.5M NH4F为刻蚀剂刻蚀微通道，速率约为10μm/h，得横截面为梯形的凹微通道。再依次用丙酮和铬膜刻蚀液除去残存的光胶层和铬膜，用高纯水冲洗干净即得干净透明的基片。
F.在基片的储液池位置用微型台钻处打孔，作为芯片出入口。
G.截取与基片同样尺寸的匀胶铬板，依次用丙酮、铬膜刻蚀液浸泡2分钟，以除去光胶层和铬膜，高纯水冲洗干净即得盖片。
H.将基片与盖片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高纯水中超声清洗5-10分钟，氮气吹干，然后在超净环境中将两者对齐密封。高温下键合，升温程序为以40℃/min从室温升至550℃，时间30分钟；以20℃/min从550℃升至610℃，时间30分钟；以20℃/min从610℃升至635℃，时间30分钟；以10℃/min从635℃升至650℃，时间6小时；然后自然冷却到室温。
本发明在利用流式细胞仪基本原理设计制作的微流控芯片上构建了实现流式细胞技术所需的液流系统和检测通道，实现了单细胞藻流式分析系统的微型化、集成化和简单化；制造成本低，易于实现标准化和规模化生产。


图1是本发明的微流控芯片的结构示意图。
其中，1-样品入口；2，3-鞘流入口；4-废液池；5-样品通道；6，7-鞘流通道；8-通道交汇点；9-入射光纤通道，10-出射光纤通道。
图2是单细胞藻流式分析芯片系统的结构示意图。
其中，11，12，13-微型泵；14，16-鞘流；15-样品；17，18，19-荧光检测器；20-侧向散射光检测器；21-带通滤波器；22-二向色滤光片；23-激光器，24-检测器。
具体实施例方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1微流控芯片的结构如图1所示，微流控芯片结构分两部分液流系统和检测系统。液流系统采用ψ型结构，中间通道为样品通道5，两侧支通道为鞘流通道6和7，鞘流通道的作用是使样品中的藻细胞呈单行排列，样品通道5与鞘流通道6和7尺寸一致，鞘流通道为1/4圆弧状，鞘流通道6和7在交汇点8的切线方向与样品通道5方向相一致，这样，鞘流与样品流同向汇合，避免液流汇合产生涡流扰动，保证了液流系统的稳定性；在芯片上构建与样品通道垂直的光纤通道9，10，使激光器23耦合光纤水平插入该通道，将激发光引入到分离通道的检测区域附近。在进样通道的另一侧与入射光光纤通道平行的位置构建光纤通道，用于将前向散射光引入检测器24。在芯片进样通道检测区域上方安置光学检测系统，荧光检测器17，18，19和侧向散射光检测器20分别接收相应光信号，当藻细胞经过检测口时，受到激光照射，产生荧光(红荧光、黄荧光、绿荧光)和散射光(前向散射和侧向散射)，荧光和散射光通过二向色滤光片22和带通滤波器21的选择性透射和反射，到达相应检测器。通过对几种光信号的综合分析，对藻进行计数和分类。该芯片省去了由多个光学元件才能完成的三维准直、反射和会聚复杂光路系统，将光传输过程中的强度损失降到最低，实现了微流控芯片系统的微型化、便携化和集成化的特点。
实施例2微流控芯片的制作1.玻璃基片的制作掩膜胶片上微通道的尺寸设计流体通道，30μm；光纤通道，60μm；光纤通道与分离通道间的距离d400μm。将掩膜胶片置于63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板上，紫外线曝光180秒(波长365nm)，显影液中显影100秒后，100℃下烘干半小时。在室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀铬膜，然后用高纯水冲洗干净，烘干。通过数码显微镜摄像，测得铬板上的通道尺寸为流体通道，40μm；光纤通道，70μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蚀剂腐蚀裸露的硼硅玻璃，速率约为10μm/h，刻蚀6小时后，再依次用丙酮、铬膜刻蚀液除去残余光胶层和铬膜，即得基片。用微型台钻打孔，钻头为1mm的金刚钻头，孔的直径即为液池直径1mm。显微镜下测定微通道尺寸微流体通道，上底宽160μm，下底宽50μm，深度60μm；光纤通道，上底宽190μm，下底宽80μm，深度60μm；光纤通道与分离通道间的距离d340μm；将除光纤通道外的其他区域用胶带保护好，继续刻蚀光纤通道，直到通道尺寸达到上底宽600μm，下底宽80μm，深度270μm；光纤通道与分离通道间的距离d120μm2.盖片的制作与基片制作方法相同，构造相同，但不打孔。
3.将基片与盖片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高纯水中超声清洗5-10分钟，用氮气吹干，然后在超净环境中将两者对齐密封，高温下键合。升温程序为以40℃/min从室温升至550℃，时间30分钟；以20℃/min从550℃升至610℃，时间30分钟；以20℃/min从610℃升至635℃，时间30分钟；以10℃/min从635℃升至650℃，时间6小时。然后自然冷却到室温。经显微镜下观测，键合后通道无变形，且达到完全密封。键合后的芯片微通道呈椭圆形，样品通道长轴长约190μm，短轴长约120μm；光线通道长轴约600μm，短轴约540μm。
实施例3微流控芯片分析检测系统如图2所示，在样品通道5的进口1接进样泵12，两侧鞘流通道6和7在其入口2和3处接鞘流14，16。样品和鞘流液通过泵11、12和13输送，鞘流与样品同向流动，鞘流液与样品在汇合点8汇合后以层流的形式向前流动，通过调节鞘流和样品流速，使样品中细胞呈单行排列，并向前移动通过检测区，在检测区域细胞被来自光纤的激光激发，通道另一侧的光纤接受前向散射光，并将其传输到光学检测器24，侧向的光经二向色滤光片22和带通滤波器21的分光、滤光，分别被侧向散射光检测器20、红色荧光检测器17、黄色荧光检测器18和绿色荧光检测器19接收记录，综合各类光信号得到微型浮游植物数量和群落结构的信息。
权利要求
1.一种单细胞藻流式分析微流控芯片，其特征在于它包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有包括中间样品通道和两侧鞘流通道的ψ型结构的液流系统和用于检测的光纤通道。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的鞘流通道为1/4圆弧状，样品通道与鞘流通道通端点切线方向相一致。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的光纤通道与进样通道互相垂直。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于它是以玻璃为材料制作的。
全文摘要
本发明公开了一种单细胞藻流式分析微流控芯片，它包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有包括中间样品通道和两侧鞘流通道的ψ型液流系统和用于检测的光纤通道；样品通道与鞘流通道尺寸一致，鞘流通道为1/4圆弧状，样品通道与鞘流通道端点切线方向相一致；在芯片上构建与进样通道垂直的光纤通道，使激光器耦合光纤水平插入该通道，将激发光引入到分离通道的检测区域附近；在芯片进样通道监测区域上方安置光学检测系统，检测荧光和侧向散射光，通过对光信号的综合分析，对藻进行计数和分类。该芯片省去了由多个光学元件才能完成的三维准直、反射和会聚复杂光路系统，将光传输过程中的强度损失降到最低，实现了微流控芯片系统的微型化、便携化和集成化的特点。
文档编号G01N15/00GK1712926SQ20051004385
公开日2005年12月28日 申请日期2005年6月19日 优先权日2005年6月19日
发明者王修林, 苏荣国, 韩秀荣 申请人:中国海洋大学