专利名称：量子点纳米荧光探针联合生物芯片寻找中药靶点的方法
技术领域：
本发明属于材料、化工、药学和生物的交叉领域，涉及一种通过纳米技术和生物芯片技术相结合寻找中药作用靶点的方法，尤其是通过量子点纳米粒子的荧光在生物芯片上寻找中药有效成分作用的靶蛋白的方法。
背景技术：
中药在我国有着悠久的历史，她凝聚了几千年中华民族的传统文化，为中华民族乃至全世界人民的健康和文明作出了巨大贡献。千百年流传下来的《黄帝内经》、《千方经》、《本草纲目》等医药文献所记载的各种中草药及其配方在医药科技高度发达的今天仍然具有十分珍贵的参考价值。
然而，我国的中药正面临国际社会的严峻挑战，中药在国际市场竞争力比较弱，国际市场占有率仅约4％，这与我国中医药几千年的悠久历史很不相称。限制中药走向国际市场的重要因素之一便是中药治疗疾病的机理不清楚，很多中药有效成分的作用靶点至今仍一无所知。中药提取物往往是一个复杂的混合物，而且受产地和季节的影响，这些都导致其成为一种不够精确的科学。要明确中药治疗疾病的分子机理，就必需须将先进的科学技术和手段引入我国传统中药，使中药现代化。
多年来人们研究表明，大多数药物是通过干涉细胞中的酶或受体的功能来实现其药效的。酶或受体都是蛋白质，在它们的表面有很多可被小分子占住的空位，当小分子如同锁的钥匙一样结合在酶或受体上的空位时，这些小分子即称配体。当一种药物与配体具有相同或相似的形状，则这种药物便可以结合到酶或受体上，结合药物的酶或受体将向细胞发送一个信号，使细胞发生一系列的生理反应。结合药物的酶或受体即为该药物作用的直接靶点(靶蛋白)。当药物能结合的靶点是多个时，这种药物可能就有副作用。上述药物发生作用的过程同样适用于中药有效成分。研究中药有效成分作用靶点，可阐明药物作用的机理以及生物信号转导机制，进而可为中药新药筛选提供依据。
中药提取物中具有药效的有效成分的复杂性使中药药理研究比只有单一成分的合成药物要复杂得多。要研究中药复杂的混合物成分中每一种有效成分作用于细胞的靶点，其工作量是庞大的，甚至是不可能实现的。有幸的是，生物芯片技术和纳米技术使该领域的难题出现了可以解决的曙光。
生物芯片具有高通量分析的特点，在揭示药物作用的分子机理方面可显示巨大的优越性。如蛋白质芯片，它是将蛋白质探针高密度地固定在芯片上，这些蛋白质可高度特异性地与靶分子结合。当药物直接与芯片上的蛋白质发生作用，即可达到高通量而且快速地分析药物作用的靶点，这是分析药物作用靶点最直接的方法。对于中药复杂的体系，可以在芯片上固定大量与中药成分作用相关的蛋白质(包括受体、抗体，等)，然后与中药成分进行孵育，从而初步确定中药成分作用靶点。但利用生物芯片研究药物作用机制时，当前使用较多的是基因芯片，如国内有人采用小鼠8192点基因芯片研究了中药复方对MRL/lpr狼疮小鼠肾脏基因表达及Th1/TH2细胞因子比例的调节作用，实验采用有机荧光染料Cy3和Cy5来检测杂交结果。实验表明，这种中药复方能调节肾组织多个系统的基因表达，可纠正Th1/Th2细胞因子的比例失衡。(李非，等.利用基因芯片探讨中药复方对MRL/lpr狼疮小鼠肾脏基因表达及Th1/TH2细胞因子比例的调节作用.中国中西医结合杂志.2003，23(3)198-206)这种采用基因芯片研究药物作用机制的方法在国内外均有较多的文献报道，但这种方法不能明确药物直接作用的受体。
此外，目前芯片上杂交信号的检测大多是通过分析标记在探针上的Cy3和Cy5的荧光来实现的，尤其是基因芯片广泛采用这种荧光信号检测。然而，这种荧光染料有较大缺陷，如荧光量子产率低；光学稳定性差；对检测系统的光学部分要求严格；激发光谱与发射光谱有较大重叠，给检测带来困难；难以对不同荧光探针用同一激发光激发，等。
虽然蛋白质芯片技术已比较成功地用于高通量的药物筛选(我国蛋白质芯片技术成功应用于高通量药物筛选.http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-4/2005421100624.htm)，但未见有将量子点纳米技术结合蛋白质芯片技术来寻找中药靶点的实验报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种寻找中药有效成分作用靶点的简便方法。本发明公开了上述寻找中药有效成分作用靶点的方法，尤其是公开了量子点与中药有效成分连接以形成一种“量子点-中药有效成分”纳米荧光探针，并将这种探针用于生物芯片以寻找药物作用靶点的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明将量子点纳米粒子与中药有效成分进行连接，形成一种“量子点-中药有效成分”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与生物芯片共孵育，经过洗涤后，根据生物芯片上的量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知生物之间特异性的结合位点(即靶点)，进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。
以下对本发明的制备方法和应用进一步说明，具体如下本发明通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组合作用将量子点与中药有效成分进行连接。获得的产物通过分离纯化以除去游离的中药有效成分，然后将获得的探针与生物芯片进行孵育。
或者采用硅烷偶连剂分子将量子点与中药有效成分进行连接，然后将获得的探针与生物芯片进行孵育。所述的硅烷偶连剂包括CH2＝CHSi(OC2H5)3，CH2＝CHSi(OCH3)2，CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3，CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3，HSC3H6Si(OCH3)3，H2NC3H6Si(OC2H5)3，H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3，H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3，CH3Si(OC2H5)3，(CH3)3SiNHSi(CH3)3，H2NC2H5Si(OC2H5)3中的任意一种；本发明所采用的量子点，其表面被含巯基、羧基、氨基、胫基、羟基、磺酸基中的一种或任意几种组合基团的化合物所修饰。当量子点修饰的化合物含羧基，同时中药有效成分含氨基时，或者当量子点修饰的化合物含氨基，同时中药有效成分含羧基时，先采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide，EDC)活化羧基，然后通过羧基与氨基的反应将量子点与中药有效成分进行连接。将获得的探针与生物芯片进行孵育。
上述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。
所述的蛋白质芯片，其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异性蛋白质，尤其是指与待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异性蛋白质。
所述的量子点是指半导体纳米材料，尤其是指ZnS，CdS，HgS，ZnSe，CdSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，CaAs，InP，InAs，InCaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，CdTe/HgTe，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe，MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SeTe，BaS，BaSe，BaTe，CdS∶Mn，ZnS∶Mn，CdS∶Cu，ZnS∶Cu，CdS∶Tb，ZnS∶Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合；以及由上述任意一种量子点为核、二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。
所述的中药有效成分，是指从动物、植物或矿物中提取的任意单一化合物或任意两种或多种化合物的混合物。这些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心脑血管药理作用、抗爱滋病、抗衰老、治疗糖尿病、治疗前列腺疾病、抗老年痴呆、抗菌、治疗消化道疾病、抗风湿或类风湿疾病、治疗骨质疏松或更年期综合症作用中的任意一种或任意几种作用。
为克服现有技术的不足，本发明以量子点纳米粒子替代传统的荧光染料(如Cy3和Cy5)来标记中药有效成分，进而与生物芯片共孵育，以获得药物作用的直接靶点。量子点是指半导体纳米微晶，尺度为十几纳米、几纳米或更小。与Cy3和Cy5等传统的荧光染料相比，量子点具有很高的量子产率和光稳定性，发射光谱狭窄，激发波长宽，可以使用同一波长的激发光同时进行多通道检测。理论上，可将成千上万种具有不同荧光颜色和荧光信号强度的量子点分别标记成千上万个不同的中药有效成分，并在同一张生物芯片上同时进行孵育。将量子点代替传统荧光分子与生物芯片技术相结合，则不仅能显著提高杂交信号的稳定性，增强杂交信号的强度，而且还可以达到双高通量检测的效果。本发明对于阐明中药有效成分作用靶点和对中药新药进行筛选具有重要的实际意义。
本发明具有实质性特点和显著进步，量子点纳米粒子优越的光学性质克服了传统有机荧光染料的不足，将量子点与中药有效成分进行连接，并与蛋白质芯片共孵育，可直接获得中药有效成分作用的靶点，在研究中药药理和筛选中药新药方面具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
实施例1向50ml浓度约为10nM的CdSe(590)(自制)(590是指CdSe的发射光谱的峰位位于590nm)纳米粒子水溶液中加入300μl含27％(v/v)无水乙醇(购于上海东懿化学试剂公司)的正硅酸乙酯(购于中国医药集团化学试剂公司)的混合液以及20μl氨水，反应2-3天后，获得仍然澄清透明的溶液，取部分样品冷冻干燥后经过X-射线衍射(XRD)和X-射线能谱(XPS)分析，结果表明CdSe表面已包被二氧化硅，即形成了CdSe/SiO2。(在制备CdSe/SiO2时应控制正硅酸乙酯、无水乙醇以及氨水的用量，否则会引起粒子聚集。)将CdSe/SiO2加入到无水乙醇与硅烷偶连剂H2NC2H5Si(OC2H5)3(购于中国医药集团化学试剂公司)溶液中(反应体系中，CdSe/KH550＝10∶1.5，无水乙醇/水＝10)，于60□反应2h，得到表面连接硅烷偶连剂的CdSe/SiO2纳米粒子。然后加入适量戊二醛，并于室温下搅拌反应3-4h，然后加入天花粉蛋白(CdSe与天花粉蛋白的摩尔比约为1∶10)，于4℃反应过夜。分离游离的蛋白，即获得由共价结合的方法得到的“CdSe/SiO2-蛋白”的纳米复合粒子。红外光谱和紫外吸收光谱检测表明，反应获得的样品的红外光谱和紫外吸收光谱均有蛋白的特征峰，但峰均比较弱，表明CdSe/SiO2表面已连接了一定量的蛋白药物。该反应条件控制较苛刻，否则会引起粒子明显聚集。
实施例2将丹酚酸B(江西本草天工科技有限公司)溶于pH7的PBS缓冲液中，加入1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(购于中国医药集团化学试剂公司)，室温反应1h，然后加入表面修饰巯基乙胺的量子点CdSe/ZnS(590)(自制)纳米粒子水溶液，室温反应过夜，通过氨基与羧基的共价反应将量子点与药物连接。反应液中，CdSe/ZnS约为50nM，CdSe/ZnS、丹酚酸B和EDC的摩尔比约为1∶100∶120。通过凝胶柱分离除去游离的丹酚酸B和EDC，即获得“CdSe/ZnS-丹酚酸B”的连接产物。该产物在488nm波长的光激发下发射与CdSe/ZnS相同的荧光，即红色荧光。毛细管电泳实验表明，“CdSe/ZnS-丹酚酸B”的电泳速度比CdSe/ZnS的电泳速度约慢1min，表明丹酚酸B已经连接在CdSe/ZnS上。
实施例3“量子点-丹酚酸B”纳米探针与蛋白质芯片共孵育本工作选用试剂盒中的蛋白质芯片(数康生物技术有限公司)，这种芯片虽然不是针对本实验特别设计的，但其表面固定多种特异性抗原，它们在正常细胞和肿瘤细胞表面尤其是肿瘤细胞表面表达水平较高。实验按试剂盒方法操作，“量子点-丹参酸乙”纳米探针溶液与芯片在37℃下孵育30-40min后，洗涤，激光共聚焦扫描分析。结果发现，芯片上有少量荧光点，说明丹酚酸B有可能作用于多种肿瘤细胞表面抗原。
权利要求
1.一种量子点纳米荧光探针联合生物芯片寻找中药靶点的方法，其特征在于采用以下步骤将量子点与中药有效成分进行连接，形成一种“量子点-中药有效成分”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与生物芯片共孵育，经过洗涤后，根据生物芯片上的量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知生物之间特异性的结合位点，进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组合作用将量子点与中药有效成分进行连接；获得的产物通过分离纯化以除去游离的中药有效成分，即得到“量子点-中药有效成分”纳米荧光探针，然后将这种探针与生物芯片进行孵育。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用硅烷偶连剂分子将量子点与中药有效成分进行连接，然后将获得的探针与生物芯片进行孵育；所述的硅烷偶连剂包括CH2＝CHSi(OC2H5)3，CH2＝CHSi(OCH3)2，CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3，CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3，HSC3H6Si(OCH3)3，H2NC3H6Si(OC2H5)3，H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3，H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3，CH3Si(OC2H5)3，(CH3)3SiNHSi(CH3)3，H2NC2H5Si(OC2H5)3中的任意一种。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，“量子点-中药有效成分”纳米荧光探针的制备，其特征在于所述的量子点，其表面被含巯基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合基团的化合物所修饰；当量子点修饰的化合物含羧基，同时中药有效成分含氨基时，或者当量子点修饰的化合物含氨基，同时中药有效成分含羧基时，先采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基，然后通过羧基与氨基的反应将量子点与中药有效成分进行连接；将获得的探针与生物芯片进行孵育。
5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。
6.根据权利要求4中任一所述的方法，其特征在于所述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物芯片是蛋白质芯片，其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异性蛋白质，尤其是指与待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异性蛋白质。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述的量子点是半导体纳米材料，包括ZnS，CdS，HgS，ZnSe，CdSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，CaAs，InP，InAs，InCaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，CdTe/HgTe，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe，MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SeTe，BaS，BaSe，BaTe，CdS:Mn，ZnS:Mn，CdS:Cu，ZnS:Cu，CdS:Tb，ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合；以及由上述任意一种量子点为核，二氧化硅为壳的核-壳型纳米复合粒子。
9.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述的中药有效成分，是指从动物、植物或矿物中提取的任意单一化合物或任意两种或多种化合物的混合物，这些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心脑血管药理作用、抗爱滋病、抗衰老、治疗糖尿病、治疗前列腺疾病、抗老年痴呆、抗菌、治疗消化道疾病、抗风湿或类风湿疾病、治疗骨质疏松或更年期综合症作用中的任意一种或任意几种作用。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的中药有效成分，是指从动物、植物或矿物中提取的任意单一化合物或任意两种或多种化合物的混合物，这些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心脑血管药理作用、抗爱滋病、抗衰老、治疗糖尿病、治疗前列腺疾病、抗老年痴呆、抗菌、治疗消化道疾病、抗风湿或类风湿疾病、治疗骨质疏松或更年期综合症作用中的任意一种或任意几种作用。
全文摘要
本发明提供了一种量子点纳米技术结合生物芯片技术寻找中药有效成分作用靶点的方法，属于材料、化工、药学和生物的交叉领域。本发明将量子点与中药有效成分进行连接，形成一种“量子点－中药有效成分”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与生物芯片共孵育，经过洗涤后，根据生物芯片上量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知蛋白质之间特异性的结合位点(即靶点)，进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。本发明可简便、快速地寻找中药有效成分对细胞产生药效的靶蛋白，可为研究中药药理和高通量地筛选中药新药提供高效的技术手段。
文档编号G01N33/50GK101034060SQ20061002456
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者储茂泉 申请人:同济大学