专利名称：用于妊娠性高血压和先兆子痫的预后和风险评估的标志物的制作方法
技术领域：
本发明属于临床诊断学领域。具体而言，本发明涉及通过测定标志物的水平而对孕妇中发展出妊娠性高血压和/或先兆子痫进行预测和风险评估。
背景技术：
高血压是妊娠期间遇到的最常见的医疗问题，使2-3%的妊娠复杂化。正如国家高血压教育项目之妊娠高血压工作组(National High Blood Pressure Education ProgramWorking Group on High Blood Pressure in Pregnancy)所推荐的，妊娠期间的高血压疾病被分为4类:1)慢性高血压，2)先兆子痫-子痫，3)先兆子痫加慢性高血压，以及4)妊娠期或妊娠性高血压(在妊娠后半期鉴定的妊娠短暂性高血压或慢性高血压)。慢性高血压被定义为在妊娠前或怀胎20周之前，血压超过140/90mmHg。在妇女妊娠期间首次鉴定到高血压而且她怀胎不足20周的时候，血压升高通常表示慢性高血压。相反，在怀胎20周后新发的血压读数升高要求考虑并排除先兆子痫。先兆子痫以高达所有妊娠的5%、首次妊娠的10%以及有慢性高血压史的妇女的20-25%的比率发生。妊娠时的高血压疾病可能造成母体和胎儿的发病率，并且它们仍然是母体死亡率的主要来源。妊娠期高血压所指的高血压出现在妊娠后半部分(怀胎>20周)，没有任何其它先兆子痫的特征，并且随后是产后血压正常化。在起初表现出明显的妊娠期高血压的妇女中，约三分之一发展出先兆子痫综合征。正因为如此，应该密切观察这些患者这方面的进展。妊娠期高血压的病理生理学是未知的，但在没有先兆子痫的特征的情况下，母体和胎儿的结果一般是正常的。但是，妊娠期高血压可能是以后生命中慢性高血压的先兆。先兆子痫是妊娠中的多系统疾病，其特征在于先前血压正常的妇女在怀胎20周后发展出的新发高血压(收缩压和舒张压分别> 140和90mmHg)以及蛋白尿(在24小时的尿液收集中蛋白排泄> 300mg,或者浸量尺> 2+) (Magee等2008.J Obstet Gynecol Canada30(3) Suppl J.S1-S48)。取决于全身的参与情况，几种其它症状例如水肿、止血障碍、肾功能或肝功能衰竭、和HELLP综合征(溶血、肝酶升高和低血小板计数)也使临床现象复杂化。先兆子痫可以具有早发型(在怀胎34周前开始)或晚发型(在怀胎34周后开始)。而且，先兆子痫可以表现出轻度或重度症状(收缩压> 160mmHg或舒张压> IlOmmHg,蛋白尿>5g/24小时，少尿，神经系统症状，其它临床症状如肝功能紊乱、血小板减少〈100000mm3、HELLP综合征)，并且在最严重的情况下可以发展成为子痫。此外，它可以仅表现为母体疾病而具有合适的胎儿生长，或者可以将其自身表现为生长受限的胎儿(子宫内生长受限(RJGR))或者突然的胎儿窘迫。先兆子痫在极端的孕产妇年龄(〈18岁或>35岁)中更常见。在大于35岁的妇女中慢性高血压和其它共病性医学疾病的患病率增加可以解释大龄孕妇中先兆子痫的频率增高。尽管尚未清楚了解先兆子痫确切的病理生理机制，但先兆子痫主要是一种胎盘功能障碍疾病，导致伴随有血管痉挛的内皮功能障碍综合征。在大部分情况下，病理学证据显示出胎盘功能不全和相关异常例如弥漫性胎盘血栓形成、炎性胎盘蜕膜血管病变和/或异常滋养层细胞入侵子宫内膜。这支持异常的胎盘发育或来自弥漫性微血栓形成的胎盘损害是该疾病发展的关键。证据也表明，母体对胎儿/胎盘组织的免疫反应改变可能促成了先兆子痫的发展。普遍的内皮功能 障碍可表现为母体综合征、胎儿综合征、或两者。妊娠妇女可能表现出多器官系统，包括中枢神经系统、肝、肺、肾和血液系统的功能障碍。内皮损伤导致病理性毛细血管渗漏，在母体中表现为重量迅速增加、非依赖性水肿(脸或手)、肺水肿、血浓缩、或其组合。病变胎盘也可以经由子宫-胎盘血流量减少而影响胎儿。这种灌注减少在临床上可以表现为不可靠的胎儿心率测试、对生物物理情况的评分低、羊水过少、或者胎儿生长受限。迄今为止，尽管有大量的临床试验，但还没有可用于治疗或预防先兆子痫的任何治疗手段。抗高血压药、用于肺成熟的皮质激素或用于防止子痫的硫酸镁被用来应付(或防止恶化)所述症状，因此可以在短期内拖延，从而让更成熟的胎儿安全分娩。结果，治疗先兆子痫的唯一但极端的方法是取出胎盘，在早产的情况下，还有分娩出早产儿的不利后果。因此，有或没有IUGR的先兆子痫依然是世界范围内母体和新生儿的发病率和死亡率的主要原因。虽然缺乏现有的针对先兆子痫的预防和治疗方法，但是寻找可以预测该危及生命的妊娠疾病的发展或者有助于该疾病的检测的非侵入性生物标志物仍然是最重要的。多年以来，基于在先兆子痫的情况中所注意到的病理生理学观察结果，例如胎盘功能障碍、全身性炎症反应、内皮功能障碍和凝血系统的活化(综述参见Grill等2009，生殖生物学和内分泌学(Reproductive Biology and Endocrinology) 7:70),已研究了不同的生物物理和生物化学标志物。这些潜在的标志物包括血管生成因子(例如^^^、？16 、8行卜1)、可溶性内皮因子(sEng)、P-选择素、无细胞胎儿DNA、ADAM12、胎盘蛋白13 (PP-13)、正五聚素蛋白3 (PTX3)和妊娠相关血浆蛋白A (PAPP-A)(综述参见Grill等2009，生殖生物学和内分泌学，7:70 )。而且，用于预测先兆子痫的最广泛使用的成像技术是子宫胎盘多普勒超声。可以通过测定流量波形比率或通过检测子宫弓形血管的舒张期切迹来评估受损的胎盘灌注。然而，据显示，在低风险和高风险两种患者组中，预测值都没有高到足以推荐为常规筛查(Conde-Agudelo 等 2004.0bstet Gynecol104:1367-1391)。肾上腺髓质素(ADM)和内皮素-1 (ET-1)是已知存在于循环系统中的具有血管活性的肽类激素。所述两种肽都被合成为较大的激素原，并通过肽转化酶的蛋白水解切割而从它们的前体肽中释放出来。ADM和ET-1被指参与高血压的病理生理(综述参见=Murakami等 2006.Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 6 (2):125-132 ;Dhaun 等 2008.Hypertension 52:452-459)。已经探讨了 ADM用于诊断先兆子痫的作用，结果是相互矛盾的。Senna等2008证明了在不同胎龄下，先兆子痫患者中的母体循环ADM值不同于血压正常孕妇中的那些值(Senna等2008.Medscape J Med 10(2):29)。然而,来自于患有先兆子痫的孕妇的血液样品是在已表现出疾病症状后抽取的。类似地，Minegishi等1999测定了非孕妇女、正常孕妇和患有先兆子痫的孕妇血浆中的ADM浓度。随着孕期进展，观察到血浆ADM逐渐增加。在第三个三个月中，有和没有先兆子痫的妇女之间的血浆ADM浓度没有显著差异(Minegishi等1999.Mol Hum Reprod 5 (8): 767-70)。Di 1rio等1998能够显示出孕妇比非孕对象的肾上腺髓质素水平高，但正常孕妇和先兆子痫妇女之间的母体血浆肾上腺髓质素浓度没有差异(Di 1rio等1998.Hypertension 32 (4): 758-63)。相反,有些研究不能证明ADM的增力口，反而是减少(Dikensoy 等 200928 (4):383-9 ;Hata 等 1997.Lancet 350 (9091): 1600)。然而，这些研究都没有探讨ADM作为用于对孕妇发展出妊娠性高血压或先兆子痫的预后或风险评估的标志物的应用。在很多研究中也已经探讨了 ET-1用于诊断先兆子痫的作用，并且与ADM类似，结果是相互矛盾的。Baksu等2005和Nishikawa等2000显示,先兆子痫组中的血衆ET-1水平显著高于健康非孕妇女和血压正常孕妇中的水平(Baksu等2005.1nt J Gynaecol Obstet90(2):112-7 ;Nishikawa 等 2000.Life Sci 67 (12): 1447-54)。相反，Zunker 等 1998 显示，在先兆子痫患者和血压正常且无并发症的妊娠患者之间的ET-1水平没有统计学差异(Zunker 等 1998.Fetal Diagn Ther.13(5):309_14)。然而，这些研究都没有探讨 ET-1 作为用于对孕妇发展出先兆子痫的预后或风险评估的标志物的应用。Gao等1996能够检测出，与相匹配的正常孕妇相比，妊娠性高血压患者中的血浆ET-1水平显著升高。在血浆ET-1水平与平均动脉压或PIH严重度评分指数之间存在显著的正相关性(Gao 等 1996.Chin Med J (Engl).109 (11): 823-6) Zhang 等 1994 揭不了高血压妊娠中的ET-1水平高于正常妊娠中的那些水平(Zhang等1994.Zhonghua Fu Chan KeZa Zh.29 (11 ):645-7)ο然而，在Gao等和Zhang等两者所描述的患者中，ET-1水平是在已表现出高血压的时候测得的。因此，本发明的发明人已经探讨了来自于孕妇的体液样品中的pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平、特别是MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET-Ι水平的测定结果是否可用于在这些对象中对妊娠性高血压和/或先兆子痫的预后和风险评估。

发明内容
本发明涉及用于妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展的预后或者用于对孕妇中发展出妊娠性高血压和/或先兆子痫进行风险评估的方法，所述方法包括步骤:(i)提供对象的体液样品，(ii)测定所述样品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平，(iii)将pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平与对孕妇的预后或风险评估相关联，其中所述片段的长度为至少6个氨基酸残基。


图1:MR-pro_ADM的箱线图分析图2:CT-pro-ET-l的箱线图分析图3:用于在对照和将会发展出晚发型先兆子痫的患者之间进行区分的MR-pro-ADM的ROC曲线分析图4:用于在对照和将会发展出晚发型先兆子痫的患者之间进行区分的CT-pro-ET-1的ROC曲线分析
图5:用于在对照和将会发展出妊娠性高血压(PIH)的患者之间进行区分的CT-pro-ET-Ι的ROC曲线分析
具体实施例方式本发明涉及用于妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展的预后或者用于对孕妇发展出妊娠性高血压和/或先兆子痫进行风险评估的方法，所述方法包括步骤:(i)提供对象的体液样品，(ii)测定所述样品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平，(iii)将pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平与对孕妇的预后或风险评估相关联，其中所述片段的长度为至少6个氨基酸残基。所述片段的优选长度为至少6个氨基酸，更优选的长度为至少12个氨基酸残基。优选可用本文描述的免疫分析法检测这样的片段。根据本发明，当与来自于不具有妊娠性高血压和/或先兆子痫风险的对象的样品中的pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平相比时，pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平降低预示妊娠性高血压和/或先兆子痫的风险增加。在本发明的一种实施方式中，在第一个三个月至第二个三个月(妊娠第8至26周)内，更优选在第一个三个月至第二个三个月早期(妊娠第8至20周)内，甚至更优选在第一个三个月(妊娠第8至14周)内，最优选在第一个三个月早期(妊娠第8至10周)内，进行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的测定。在本发明的一种实施方式中，在妊娠第25周前，优选在第8和第24周之间进行pro-ADM或其片段和/或pro_ET_l或其片段的测定。在本发明的又一种实施方式中，所述预后与先兆子痫的早发型(在怀胎20至34周之间)或晚发型(在怀胎34周之后)相关。在本发明的另一种实施方式中，可以另外测定选自下列的其它标志物:sflt_l、sEng、PIGF, VEGF, PP-13、ADAMl2, P-选择素、无细胞胎儿 DNA、PTX3、PAPP-A、内脂素、抑制素A、激活素A、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、β-hCG、α-甲胎蛋白(AFP)、金属蛋白酶-9(MMP-9)、超声标志物(子宫动脉搏动指数和/或舒张期切迹)以及心房利钠肽原(pro-ANP)或其片段、脑利钠肽原(pro-BNP)或其片段和加压素原或其片段。在本发明的优选实施方式中，所述其它标志物选自:sflt_l、sEng、PIGF, VEGF,PP-13、ADAMl2, P-选择素、无细胞胎儿DNA、PTX3、PAPP-A、内脂素、抑制素A、激活素A、hCG、β -hCG、AFP、MMP-9、超声标志物(子宫动脉搏动指数和/或舒张期切迹)、MR-proANP、NT-proBNP 以及和肽素(Copeptin)。本发明也涉及所描述的方法和试剂盒用于孕妇中妊娠性高血压和/或先兆子痫的预后和风险评估的应用。术语“妊娠性高血压”或者妊娠期高血压被定义为在怀胎20周后的孕妇中新发展出的动脉高血压(收缩压和舒张压分别> 140和90mmHg)。术语“先兆子痫”包括孕妇的高血压的多系统疾病，其特征在于高血压和蛋白尿。先兆子痫最常见的症状是高血压、尿液中蛋白质增加、以及手和脸的肿胀或水肿。在本发明的某些实施方式中，先兆子痫被定义为高血压(收缩压和舒张压分别> 140和90mmHg)和蛋白尿(在24小时的尿液收集中蛋白排泄彡300mg，或者浸量尺彡2+)。在本发明的具体实施方式
中，在测定时，妊娠性高血压和/或先兆子痫是无症状的和/或未表现出来。因此，无症状的和/或未表现出来的指的是收缩压和舒张压低于140和90mmHg，和/或在24小时的尿液收集中蛋白排泄低于300mg或者浸量尺小于2+。“预后”是指对对象患有特定疾病或临床病症的结果或具体风险进行预测。这可以包括对所述对象恢复的可能性或不利结果的可能性进行估计。在本文中使用时，术语“样品”指的是出于诊断、预后或评估目标对象例如患者的目而获得的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰和胸腔积液。此外，本领域技术人员会意识到，在分级或纯化步骤例如将全血分离成血清或血浆组分之后，某些测试样品更易于分析。因此，在本发明的优选实施方式中，所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品、或者任何前述样品的提取物。优选情况下，所述样品是血液样品，最优选为血清样品或血浆样品。在本文中使用时，术语“对象”指的是活的人或非人类生物体。在本文中优选情况下，所述对象是妊娠的且在第一个三个月至第二个三个月(妊娠第8至26周)内、更优选在第一个三个月至第二个三个月(妊娠第8至24周)内、甚至更优选在第一个三个月至第二个三个月早期(妊娠第8至20周)内、甚至更优选在第一个三个月(妊娠第8至14周)内、最优选在第一个三个月早期(妊娠第8至10周)内的人类对象。在另一种优选实施方式中，所述对象是妊娠的且处于妊娠第25周之前、优选在第8和第24周之间的人类对象。
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当在本文中针对诊断和预后标志物的应用而使用时，术语“相关联”指的是将标志物在患者中的存在或量与它在已知患有特定病症或者已知具有患特定病症的风险的人中的存在或量进行比较。患者样品中的标志物水平可以与已知与具体诊断相关的水平进行比较。据称，样品的标志物水平与诊断相关联；这指的是，技术人员可以使用所述标志物水平来确定患者是否患有特定类型的诊断，并作出相应的响应。或者，样品的标志物水平可以与已知与良好结果(例如没有疾病等)相关的标志物水平进行比较。在优选的实施方式中，一组标志物水平与总概率或特定结果相关联。正如本文中在蛋白质或肽的语境中提到的，术语“片段”指的是可从较大的蛋白质或肽得到的较小的蛋白质或肽，因而所述片段包含所述较大的蛋白质或肽的部分序列。通过将一个或多个肽键皂化，可从所述较大的蛋白质或肽得到所述片段。在本发明的上下文中，术语“水平”指的是从患者的样品获得的标志物肽的浓度(优选表示为重量/体积；w/v)。在本文中，使用检测方法和/或诊断分析法来进行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平的测定。优选的pro-ADM片段是MR-pro-ADM。优选的pro-ET-l片段是 CT-pro-ET-l。MR-pro-ADM具有下面的序列:SEQ ID N0.1:1ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSSCT-pro-ET-l具有下面的序列:
SEQ ID N0.2:I RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW在本文中提到时，“分析法”或“诊断分析法”可以是诊断学领域中所应用的任何类型。这样的分析法可以是基于待检测的分析物与一种或多种捕捉探针以一定的亲和性进行的结合。关于捕捉分子和靶分子或目标分子之间的相互作用，优选亲和常数大于IO8M'在本发明的上下文中，“捕捉分子”是可被用于与来自于样品的靶分子或目标分子即分析物(即，在本发明的上下文中为心血管肽)结合的分子。因此，必须在空间上以及从表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在的角度这两方面使捕捉分子充分成形，以便与靶分子或目标分子特异性结合。因此，例如可以通过在所述捕捉分子和靶分子或目标分子之间的离子、范德华力、η-η、σ-π、疏水性或氢键相互作用或者两种或更多种前述相互作用的组合来介导所述结合。在本发明的上下文中，捕捉分子例如可以选自核酸分子、糖类分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，所述捕捉分子是抗体，包括所述抗体的与靶分子或目标分子具有足够的亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体的化学和/或生物化学修饰的衍生物或者从变体链衍生的且其长度为至少12个氨基酸的片段。优选的检测方法包括各种形式的免疫分析法，例如放射性免疫分析法(RIA)、化学发光和荧光免疫分析法、酶联免疫分析法(ELISA)、基于Luminex的磁珠阵列、蛋白质微阵列分析法、以及快速测试形式例如免疫层析试纸测试。所述分析法可以是均相或异相分析法、竞争性或非竞争性分析法。在特别优选的实施方式中，所述分析法是夹心分析法的形式，所述夹心分析法是非竞争性免疫分析法，其中将待检测和/或定量的分子与第一抗体以及与第二抗体结合。可将第一抗体结合在固相例如珠子、孔壁或其它容器壁、芯片或条带上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素、或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过合适的方法测定与分析物结合的标记抗体的量。“夹心分析法”所涉及的一般组成和步骤已被良好建立并且是技术人员已知的(免疫分析法手册(The Immunoassay Handbook), David Wild 编辑，Elsevier LTD, Oxford ;第 3版(2005 年 5 月)，ISBN-13:978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1):4-10.PMID: 16376134，通过参考结合于此)。在特别优选的实施方式中，所述分析法包含两种均作为液体反应混合物中的分散体存在的捕捉分子，优选为抗体，其中第一标记组分与第一捕捉分子连接，其中所述第一标记组分是基于荧光-或化学发光-淬灭或放大的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕捉分子连接，以便当两种捕捉分子都与分析物结合后，产生可测定的信号，使得能够在包含样品的溶液中检测所形成的夹心复合物。
甚至更优选的是，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花菁类染料的组合。在本发明的上下文中，基于荧光的分析法包含染料的使用，所述染料例如可以选自FAM (5-或6-羧基荧光素)，￥1(:，肥0，荧光素，异硫氰酸荧光素^11'0，11 -700/800，花菁染料例如 CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7，占吨(Xanthen)，6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)，TET，6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基-荧光素(J0E)，N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，5-羧基罗丹明_6G (R6G5)，6_羧基罗丹明_6G(RG6)，罗丹明，罗丹明绿，罗丹明红，罗丹明110，BODIPY染料例如BODIPY TMR,俄勒网绿，香豆素如伞形酮，苯甲亚胺例如Hoechst 33258 ;菲啶类，例如德克萨斯红，亚基马黄，Alexa Fluor, PET，溴化乙锭，吖啶染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，叶啉染料，聚甲炔染料等。在本发明的上下文中，基于化学发光的分析法包含根据所描述的化学发光材料的物理原理(Kirk-Othmer,化工技术百科全书(Encyclopedia of chemical technology),第 4版，执行主编 J.1.Kroschwitz ;编辑 M.Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993,第 15 卷，第518-562页，通过参考结合于此，包括第551-562页的引用)使用染料。优选的化学发光染料是B丫唳酯。诊断和/或预后试验的灵敏度和特异性不仅仅依赖于试验的分析“质量”，它们还依赖于对什么构成异常结果的定义。在实践中，通常通过将变量的值对它在“正常”(即明显健康的)和“疾病”人群(即患有糖尿病、胰岛素抗性和/或代谢综合征的患者)中的相对频率作图，来计算受试者工作特征曲线(ROC曲线)。对于任何具体标志物，有和没有疾病的对象的标志物水平分布都可能会重叠。在这种情况下，测试不能以100%的准确度完全区分正常与疾病，重叠的区域表示测试不能区分正常与疾病的情形。选择阈值，使得在所述阈值之上(或在所述阈值之下，取决于标志物如何随疾病变化)，测试被认为是异常的，而在所述阈值之下，测试被认为是正常的。ROC曲线下面积是对所认知的测定允许正确鉴定病症的概率的度量。甚至当测试结果不一定给出准确数字的时候，也可以使用ROC曲线。一个人只要能够对结果进行排序，就能创建ROC曲线。例如，可以按照程度(例如，1=低，2=正常，以及3=高)对“疾病”样品的测试结果进行排序。可以将该排序与“正常”人群中的结果相关联，并创建ROC曲线。这些方法是本领域公知的(参见，例如，Hanley等1982.Radiology 143:29-36)。优选情况下，阈值被选择成提供大于约0.5、更优选大于约0.7、还更优选大于约0.8、甚至更优选大于约0.85、最优选大于约0.9的ROC曲线面积。在本文中，术语“约”指的是给定测定结果的+/_5%。ROC曲线的横轴表示(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。所述曲线的纵轴表示灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所选定的具体截止点，可以确定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下面积是对所测定的标志物水平允许正确鉴定疾病或病症的概率的度量。因此，可以使用ROC曲线下面积来确定测试的有效性。在某些实施方式中，标志物和/或标志物组被选择成表现出至少约70%的灵敏度，更优选至少约80%的灵敏度，甚至更优选至少约85%的灵敏度，还更优选至少约90%的灵敏度，最优选至少约95%的灵敏度，并且同时还表现出至少约70%的特异性，更优选至少约80%的特异性，甚至更优选至少约85%的特异性，还更优选至少约90%的特异性，最优选至少约95%的特异性。在特别优选的实施方式中，灵敏度和特异性两者均为至少约75%，更优选至少约80%，甚至更优选至少约85%，还更优选至少约90%，最优选至少约95%。在本文中，术语“约”指的是给定测定结果的+/_5%。根据方法，当所述测定的MR-pro-ADM水平低于预定阈值水平时，在孕妇中预示了妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展。优选情况下，MR-pro-ADM的预定阈值水平在0.2和0.6nmol/L之间，更优选在0.2nmol/L和0.5nmol/L之间，甚至更优选在0.2nmol/L和0.4nmol/L之间,最优选在0.2nmol/L和0.3nmol/L之间。在优选实施方式中，当所述测定的MR-pro-ADM或其片段的水平低于0.6nmol/L、优选低于0.5nmol/L、更优选低于0.4nmol/L、最优选低于0.3nmol/L时，在孕妇中预示了妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展。根据方法，当所述测定的CT-pro-ET-l或其片段的水平低于预定阈值水平时，在孕妇中预示了妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展。优选情况下，CT-pro-ET-l或其片段的预定阈值水平在20和60pmol/L之间，更优选在20pmol/L和50pmol/L之间，甚至更优选在20pmol/L和40pmol/L之间，最优选的在20pmol/L和30pmol/L之间。在优选实施方式中，当所述测定的CT-pro-ET-l或其片段的水平低于60pmol/L、优选低于50pmol/L、更优选低于40pmol/L、最优选低于30pmol/L时,在孕妇中预示了妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展。实施例
_7] 研究人群共323名患者被纳入到回顾性研究中。这些患者被诊断为患有早发型先兆子痫(n=25)，晚发型先兆子痫(n=25)以及妊娠性高血压(PIH) (n=25)。225名没有这些疾病的孕妇作为对照。在每次产前检查时采集EDTA-样品，所述产前检查在怀胎11至14周时进行。当时，所有被纳入到研究中的患者均无症状，并且没有显示出先兆子痫或PIH的任何迹象或症状。所有孕妇都签署了由国王学院医院伦理委员会(King’s College Hospital EthicsCommittee)批准的知情同意书。如果在怀胎20周后检测出高血压(收缩压或舒张压分别> 140和90mmHg)和蛋白尿(在24小时的尿液收集中蛋白排泄彡300mg,或者浸量尺彡2+),则患者被诊断为患有先兆子痫。根据先兆子痫的发病时间，将诊断出先兆子痫的患者进一步分类为早发型先兆子痫(在怀胎20周和34周之间出现症状)和晚发型先兆子痫(在怀胎34周之后出现症状)。在没有显著蛋白尿的情况下，`如果在先前血压正常的妇女中，在怀胎20周后相隔4小时的彡2次的场合下检测到舒张压彡90mmHg，则患者被诊断为患有PIH。测定在8.1 .八.！1.]\15KRYPT0R (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf/Berlin, Germany)上使用新型全自动化夹心免疫分析系统来检测MR-pro-ADM和CT-pro-ET-l (Caruhel等2009.Clin Biochem42:725-8)ο该随机存取分析仪采用了灵敏的时间分辨扩增穴状化合物释放(Time Resolved Amplified Cryptate Emission) (TRACE)技术，该技术是基于铕穴状化合物和XL665这2种荧光团之间的非放射性转移。用于检测MR-pro-ADM的自动化分析法本质上是基于使用其它地方详细描述的相同抗体对(Morgenthaler等2005 Clin Chem51:1823-9)进行的夹心荧光分析法。对于MR-pro-ADM检测，将26 μ L血浆孵育29分钟。测定范围为0-100nmol/L，检测限和定量限分别为0.05和0.23nmol/L。在1.17nmol/L时，批内CV为1.9%，实验室间CV为9.8%。用于检测CT-pioET-1的自动化夹心荧光分析法使用鼠单克隆抗体，其针对包含人pro-ET-l序列第167至183位氨基酸的肽(SEQ.1D N0.3);以及羊多克隆抗体，其针对包含人pro-ET-l序列第183至195位氨基酸的肽(SEQ.1D N0.4)。对于CT-proET_l检测，将50 μ L血浆孵育24分钟。该分析法的测定范围为0-500pmol/L，检测限和定量限分别为
2.8和9.78pmol/L。在44_324pmol/L的范围内测定的批内和批间CV分别为1.3-4.6%和
6.3-9.6% (Caruhel 等 2008AACC 54:6，增刊 A119/C-63，摘要)。
结果患者特征显示在表I中。发展出晚发型先兆子痫的妇女中的MR-pro-ADM水平的中值显著低于妊娠对照(P〈0.007)或者发展出早发型先兆子痫的妇女(p〈0.02)中的该值。在PIH组中，存在MR-pro-ADM浓度降低的倾向性，但无统计学显著性。对于MR-pro-ADM，用于区分妊娠对照和将会发展出晚发型先兆子痫的妇女的ROC曲线下面积(AUC)为0.66(p<0.007)(参见图3)。表2给出了示例性MR-pro-ADM截止值的灵敏度和特异性。发展出晚发 型先兆子痫的妇女中的CT-pro-ET-l水平的中值显著低于妊娠对照(p<0.03)中的该值。而且，与妊娠的非高血压对照相比，发展出妊娠性高血压的妇女中的CT-pro-ET-l浓度显著较低(p〈0.03)。对于CT-pro-ET-l，用于区分妊娠对照和将会发展出晚发型先兆子痫的妇女的ROC曲线下面积(AUC)为0.63 (p<0.05)(参见图4)。表3给出了用于在妊娠的非高血压对照和将会发展出晚发型先兆子痫的妇女之间进行区分的示例性CT-PiO-ET-1截止值的灵敏度和特异性。对于CT-PiO-ET-1，用于区分妊娠的非高血压对照和将会发展出PIH的妇女的AUC为0.64 (p<0.03)(参见图5)。表4给出了用于在妊娠的非高血压对照和将会发展出PIH的妇女之间进行区分的示例性CT-pro-ET-l截止值的灵敏度和特异性。序列SEQ ID N0.1:I ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSSSEQ ID N0.2:I RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTHNRAHWSEQ ID N0.3:I NSVKSSFHDPKLKGKPSSEQ ID N0.4:I SRERYVTHNRAHW表1:患者特征
权利要求
1.用于妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展的预后或者用于对孕妇发展出妊娠性高血压和/或先兆子痫进行风险评估的方法，所述方法包括以下步骤: (i)提供对象的体液样品， (ii)测定所述样品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平， (iii)将pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平与对孕妇的预后或风险评估相关联， 其中所述片段的长度为至少6个氨基酸残基。
2.权利要求1的方法，其中在第一个三个月至第二个三个月(妊娠第8至第26周)内，更优选在第一个三个月至第二个三个月早期(妊娠第8至第20周)内，甚至更优选在第一个三个月(妊娠第8至第14周)内，最优选在第一个三个月早期(妊娠第8至10周)内，进行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平的测定。
3.权利要求1和2的方法，其中预后或风险评估与先兆子痫的早发型(在怀胎20至34周之间)或晚发型(在怀胎34周之后)相关。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中测定至少一种选自以下的其他标志物:sflt-l、sEng、PIGF, VEGF, PP-13、ADAMl2, P-选择素、无细胞胎儿 DNA、PTX3、PAPP-A、内脂素、抑制素A、激活素A、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-甲胎蛋白(AFP)、金属蛋白酶-9 (MMP-9)、超声标志物(子宫动脉搏动指数和/或舒张期切迹)、心房利钠肽原(ProANP)或其片段、脑利钠肽原(proBNP)或其片段、以及加压素原或其片段。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中测定MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET_l的水平。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中将MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET_l水平的测定与PAPP-A、PLGF和/或超声标志物(子宫动脉搏动指数和/或舒张期切迹)相组合。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中在测定时，妊娠性高血压和/或先兆子痫在所述孕妇中为无症状的和/或未表现出来。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中所述样品是体液，特别是血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液或者胸腔积液。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中MR-pro-ADM的预定阈值水平在0.2和0.6nmol/L之间，更优选在0.2nmol/L和0.5nmol/L之间，甚至更优选在0.2nmol/L和0.4nmol/L之间，最优选在0.2nmol/L和0.3nmol/L之间。
10.权利要求1至8任一项的方法，其中CT-pro-ET-Ι的预定阈值水平在20和60pmol/L之间，更优选在20pmol/L和50pmol/L之间，甚至更优选在20pmol/L和40pmol/L之间,最优选在20pmol/L和30pmol/L之间。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中当所述测定的MR-pro-ADM或CT-pro-ET-Ι的水平低于预定阈值水平时，在孕妇中预示了妊娠性高血压和/或先兆子痫的发展。
全文摘要
本发明涉及通过测定标志物水平而对孕妇中发展出妊娠性高血压和/或先兆子痫进行预后和风险评估。
文档编号G01N33/74GK103109192SQ201180030104
公开日2013年5月15日 申请日期2011年6月17日 优先权日2010年6月18日
发明者布鲁诺·达博莱特, 盖亚尼·德米尔吉安 申请人:塞尚公司