专利名称：一种三聚氰胺快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型是利用胶体金方法来检测畜产品、 于胶体金免疫检测领域。
背景技术：
饲料及奶制品类食品中三聚氰胺残留，属
三聚氰胺(英文名称Melamine)，简称三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，性 状为纯白色单斜棱晶体，无味，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工 原料。其主要可用于制作三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料，三聚氰胺还可以作阻燃剂、 减水剂、甲醛清洁剂等。目甜三聚氰胺被认为毒性轻微，在动物体内代谢很快且不会存留， 主要影响泌尿系统。
由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人掺杂进食品 中，以提升食品检测中蛋白含量指标。2007年深圳检验检疫局从台湾进口的3批观赏鱼 饲料中检出二聚氰胺；同年福建、天津、山东、珠海检验检疫局从马来西亚、泰国、秘 鲁的进口鱼粉中检出三聚氰胺超标；据美国食品药品管理局(FDA)官方消息，美国 FDA在关国国内生产的用于牛、绵羊、山羊、鱼、虾的颗粒饲料中发现含有三聚氰胺； 2007年北京检验检疫局从进口澳大利亚的宠物食品中检出三聚氰胺阳性，向年3月在 美闺发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调査是由于一些宠物饲料供应商为了增加饲 料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和人米蛋白粉中添加了三聚氰胺，从而导致猫、狗中 毒死亡。由此可见，三聚氰胺非法添加早就已经为我们敲响了警钟。
在2008年9月，中国爆发三鹿牌婴幼儿配方奶粉受污染事件，导致食用了受污染 奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，进而查出市面上销售的大部分奶制品中均含三聚氰胺。 三聚氰胺被人食用后会在胃的强酸性环境中水解，先生成三聚氰酸二酰胺，进一歩水解生成 三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸，三聚氰酸随后在肠道内被吸收，从而进入血液，在血 液中三聚氰酸能够和钙离子结合形成不溶解的三聚氰酸钙，肾脏在过滤血液杂质的时候三聚 氰酸钙就会在肾脏聚集最终形成结石。据报道，在该次事件中全国共发现万余名因食用受 污染奶粉致肾结石的婴幼儿，而在奶制品中三聚氰胺残留量超标会严重影响人类健康水平， 已成为不容忽视的食品污染源。
目前，检测三聚氰胺残留的分析方法主要是依靠气相色谱(GC)与质谱(MS)联用法 (GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)等方法。这些 方法可实现精度的定量分析但速度较慢，检测成本较高，受检测范围和精度的限制。总之， 这些方法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓縮等步骤的影响很大， 耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。
随着免疫诊断技术的发展，快速诊断三聚氰胺诊断技术不断创新，包括酶联免疫吸附法、 聚合酶链式反应法等，上述方法各有所长，但都需专用仪器、专业人员操作，仍不适于三聚 氰胺高发地区的大规模现场调查。故现今急需要一种快速、准确、简单、安全的检测手段。
本实用新型在传统免疫检测法的基础上引入了胶体金快速检测技术，研制出三聚氰胺颜 色颗粒免疫层析法检测试纸。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检 测，真.IH达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。将颜 色颗粒免疫层析法jI入三聚氰胺检测，为三聚氰胺的快速诊断提供了一个新的分析检测途径。

发明内容
木实用新型针对上述存在的一些问题，提供了一种适用于检测三聚氰胺是否超标的颜色 颗粒免疫层析法检测三聚氰胺的试纸条。
为解决上述技术问题，本实用新型是通过以下技术方案实现的
本实用新型是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、多抗颜色颗粒固定垫、样品吸液层组成， 试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控 制线，在底板端端头为吸水板，另 -端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水 板和多抗颜色颗粒固定垫相互交叠连接，在颜色颗粒固定垫上压有样品吸液层。
其中的颜色颗粒可以是一种金属溶胶颗粒，可包括胶体金颗粒、胶体银颗粒、铁颗粒、 磁性颗粒； 一种标记颗粒可包括染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒。
其中的样品吸液层是山三层材料叠加组成，第一层为无纺布层，规格为10 25g/m2;第 二层为玻璃纤维层；第三层为10 25g/r^规格的无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓 冲液浸泡处理，干燥后备用，上述装覽除有毛细管作用原理外，还有虹吸作用原理，大大加 快吸水移动速度。
用三聚氰胺免疫原免疫实验动物，得到抗三聚氰胺的多克隆抗体，用于制成抗三聚氰胺 多抗颜色颗粒固定垫。其中实验动物可以是兔、羊、马、鸡。
硝酸纤维素膜上固定有两条线， 一条试验线是由三聚氰胺合成免疫原包被，另一条控制 线是羊抗鼠多克隆抗体制成。按公知技术将底板、硝酸纤维素膜及颜色颗粒固定垫、吸水板 进行组装。检测时，把检测三聚氰胺残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入饲料浸汁或奶制 品溶液中，i于毛细管虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至三聚氰胺多克隆 抗体颜色颗粒固定垫时，样品中的三聚氰胺与三聚氰胺多抗标记探针发生特异结合，当移动 至固定有三聚氰胺合成免疫原试验线时，由于三聚氰胺多克隆抗体颜色颗粒固定垫中的抗体 与样品中三聚氰胺优先结合成复合物而失去其与三聚氰胺合成免疫原结合，因此其胶体金不 能滞留于试验线上，试验线处没有红色线显示，即只有-条红色控制线为阳性；相反如果样 品中没有三聚氰胺，三聚氰胺多克隆抗体颜色颗粒固定垫中的抗体移动到试验线上，三聚氰 胺多克隆抗体就会与三聚氰胺合成免疫原发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条 红色线为阴性。
制成试纸其检测三聚氰胺设定检出量以上，观察窗处出现一条红线为阳性；设定检出量 以下出现双红线为阴性；设定检出量时在试验线处为一条模糊阴影线为界限值，从而得出判 断。
当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无三聚氰胺，标记的金标探针都会 与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代 表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
由于采用上述技术方案，本发明所提供的一种三聚氰胺快速检测试纸具有这样的有益效 果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，且结果易读。

图1为本实用新型的主视结构图。
图2为本实用新型的侧视结构图。
图3为本实用新型的检测显示阳性结果图。
图4为本实用新型的检测显示阴性结果图。
图屮1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、颜 色颗粒固定垫，6、样品吸液层，7、底板，8、 MAX线。具体实施例
1. 三聚氰胺抗原合成
1) 将PH=7.4的PBS溶液与二氧六环(按照体积比2:1)混合液100毫升，放入水浴锅中加热 升温至50。C，开始分5批搅拌下加入三聚氰胺共0,2g (1.58mmol)，持续搅拌5小吋。
2) 在上述混合液中，加入0.5g的戊二醛溶液，反应4小时。
3) 将800mgBSA溶于80mlPBS和二氧六环的混合液中，成淡黄色半透明溶液。
4) 在4。C冰浴下，将歩骤2中制得的反应液滴加到溶于BSA的混合液中，溶液成土黄色透 明溶液，其中含有少量的杂质，反应7小时后，将反应液装入透析袋中，用PH二7.4的 溶液透析4大，透析后15分钟3000转/min离心后冻十，紫外检测270nm处三聚氰胺-BSA 相对BSA的峰，有明显偏移，充分证明二聚氰胺-BSA连接抗原成功。
2. 三聚氰胺多克隆抗体的制备
采用快速免疫法进行免疫，免疫动物可以为兔、羊、马、鸡，基础免疫起记为第1天， 第3天进行一次加强，第30大左右进行第2次加强，第2次加强后IO天左右采血检测，检 测后达到采血标准进行采血。抗血清经饱和硫酸氨沉淀上柱DE52，纯化备用。
3. 胶体金的制备及与三聚氰胺多克隆抗体的结合
(1) 取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到85 95'C，加入适量柠檬酸三纳继续加热 搅拌至沸腾3 10分钟，冷却后避光保存备用。
(2) 把三聚氰胺多克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。
4. 制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。
5. 试纸条组合按公知技术组合。
6. 使用方法把试纸的样品吸液层端放入饲料浸汁或奶制品溶液中(液面不得超过MAX线图 中8)， 1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5
分钟时观察结果。
7. 结果判断根据国家规定检测限设定cutoff值，检测三聚氰胺浓度检测限以上，观察窗 处出现一条红线为阳性；检测限以下出现双红线为阴性；检测浓度在检测限时在试验线处为 一条模糊阴影线为界限值。
权利要求1.一种三聚氰胺残留快速检测试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、颜色颗粒固定垫(5)、样品吸液层(6)、MAX线(8)组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条包被三聚氰胺免疫原的试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和颜色颗粒固定垫相互交叠连接，在颜色颗粒固定垫上压有样品吸液层。
2. 根据权利要求1所述的一种三聚氰胺残留快速检测试纸，其特征在于样品吸液层由三层材 料叠加组成，第一层为10 25g/rr^无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层为10 25g/m2 无纺布层。
专利摘要一种三聚氰胺快速检测试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、颜色颗粒固定垫、样品吸液层组成。底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有三聚氰胺合成免疫原试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和多抗颜色颗粒固定垫相互交叠连接，在颜色颗粒固定垫上压有样品吸液层，通过颜色颗粒免疫层析免疫竞争方法制成试纸，利用免疫颜色颗粒免疫层析法来检测畜产品、饲料及奶制品中的三聚氰胺残留量。该方法具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员检测，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时具有保存方便，有效期长的特点。
文档编号G01N33/543GK201344932SQ20082012393
公开日2009年11月11日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者万积成 申请人:万积成