专利名称：一种检测抗生素培氟沙星的分子印迹传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于抗生素快速检测技术领域，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测抗生素培氟沙星的分子印迹传感器及其制备方法。
背景技术：
培氟沙星是氟喹诺酮类抗生素的一种，氟喹诺酮类抗生素是喹诺酮类的衍生物。在过去的十几年中作为抗菌药物广泛地被用于预防和治疗人体及动物的传染性疾病。过量的使用会导致培氟沙星在动物组织中残留，使之产生耐药性和一些不良反应。而培氟沙星 在食品中的残留也引起了人们的关注。由于此类药物可以通过乳汁分泌出来，因此牛乳中此类抗生素的残留也成为了人们较为关注的问题，同时培氟沙星也可以引起人体的一些不良反应，如头晕、恶心、以及一些过敏症状如皮疹、皮肤瘙痒等。由于它能够引起一些病原菌的抗性和人体可能的过敏反应，会对人体健康造成一定的危害，因此氟喹诺酮类抗生素在食品中的残留，尤其是一些日常动物源类食用产品如牛奶、鸡肝、鸡蛋等产品的安全问题引起了人们的高度重视。我国农业部规定各种兽药针对不同种类动物的用法、用量和撤退周期，氟喹诺酮类的撤退周期为28天，牲畜在服用氟喹诺酮类抗生素至少28天以后才能够屠宰用于食品。为了检测氟喹诺酮类抗生素的残留量和保证消费者的权益，建立一种能够快速，灵敏、简单，同时能够实现批量检测的方法就显得尤为重要。传统检氟喹诺酮类抗生素的方法主要有液相色谱法、气象色谱法、酶联免疫法、气象色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，酶联免疫法虽然灵敏度高，但是，建立该方法需要复杂的过程包括抗原、抗体的制备，同时因其具有生物活性，因此在操作及储存过程中条件也较为严格。对于色谱检测方法，重点在于前处理，前处理过程容易造成目标物质流失，且仪器昂贵需要专业人员操作，也限制了其应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要也是对食品、环境安全的有力保障。

发明内容
本发明将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种用于检测培氟沙星的特异性分子印迹传感器制备方法，是以培氟沙星为模板，在金电极表面通过巯基苯胺及金纳米粒子，及培氟沙星之间的相互作用而制备的传感器。试剂与仪器电化学工作站(PASSTON 302N,荷兰，瑞士万通)，恒温培养箱(GRP-9050，上海森信实验仪器有限公司)，无水乙醇、乙酸、甲醇、均为分析纯(国药集团)。培氟沙星(PEF)、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸(中国兽医药品检查所)，对巯基苯胺(P-ATP)、氯金酸、四丁基高氯酸铵(上海源叶生物科技有限公司)本发明所制备的电化学分子印迹电化学传感器与传统的免疫传感器相比具有如下优势制备方法简单，特异性强；可重复使用；性质和结构稳定，无生物活性，机械强度强；成本低，具有良好的实用前景。


图I分子印迹传感器制备流程图2为经不同方式修饰后的电极的循环伏安图Ia为裸电极；lb为未去除培氟沙星后的电极；lc去除培氟沙星后的电极
具体实施例方式实施实例I培氟沙星分子印迹电化学传感器的制备I、电极抛光 取两根直径为2mm的金电极，将其置于Piranha溶液中浸泡15min后，分别用0. 3u m、0. 05 ii m的Al2O3抛光粉打磨后，在无水乙醇、超纯水中各超声5min，在-0. 3-1. 2V,50mv/s循环扫描至得到稳定的循环伏安图。2、电极自主装将抛光好的电极，置于50mmol/L的巯基苯胺乙醇溶液中室温孵育24h，之后分别用无水乙醇和超纯水清洗以去除未被金电极吸附的巯基苯胺。3、培氟沙星吸附将经巯基苯胺修饰的金电极，置于含有lOmmol/L的培氟沙星溶液中，室温孵育2h,之后再分别用无水乙醇和超纯水分别清洗，吹干备用。4、电镀聚合将经培氟沙星修饰的电极，浸入含有10mmol/L对巯基苯胺，50mol/L四丁基高氯酸铵，10mol/L培氟沙星和0. 2g/L高氯酸溶液中，在-0. 3-1. 2V，50mv/s，扫描10圈，之后将此电极在含有0. 2mol/L的盐酸的甲醇水溶液中浸泡lh，以除去模板分子培氟沙星，从而制备成传感器。5、对照传感器制备为确定所制备分子印迹电化学传感器对培氟沙星具有特异性识别性能，同时制备了非印迹的分子印迹电化学传感器，制备方法除不加模板分子培氟沙星以外，其余步骤均与印迹传感器相同。实施实例2培氟沙星分子印迹电化学传感器的应用I、待测样本滴加于分子印迹感器的工作电极表面，室温下孵育15min ；2、将分子印迹传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含0. lmol/LKCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液；3、设定适宜的扫描参数，进行循环伏安(CV)、交流阻抗(EIS)及差分脉冲(DPV)测定。实验结果显示随着标准品培氟沙星浓度地增加，其阻抗值增加。定义在洗掉模板分子培氟沙星后的分子印迹的工作电极的阻抗值为Re，吸附反应后的电极阻抗值为Rx，并计算A Ret = Rx-R0,以A Ret对标准品培氟沙星的浓度作图可得到线性曲线。培氟沙星标准品的浓度范围在0. l-10ng/ml内具有良好的线性相关，线性相关系数R2 = 0.9925。最低检测限可达到0. 03ng/mlo
对恩诺沙星、环丙沙星及氟哌酸进行特异性评价，结果显示，对恩诺沙星和环丙沙 星的交叉反应为21 % -25 %，而对于氟哌酸的交叉反应率为11 % -15 %，而对于培氟沙星的加标回收率在85% -102%由此可以说该传感器具有良好的特异性，具较高的实用价值。
权利要求
1.一种检测抗生素培氟沙星的分子印迹电化学传感器，其特征在于将对巯基苯胺、氯金酸、培氟沙星采用电镀的方法修饰到金电极表面，在将模板培氟沙星去除后，得到分子印迹传感器。
2.根据权利要求I所述传感器，其特征在于，所述的金电极是指，直径为2mm且于Piranha溶液中浸泡15min后，分别用O. 3 μ m、0. 05 μ m的A1203抛光粉打磨后，在无水乙醇、超纯水中各超声5min的金电极。
3.根据权利要求I所述传感器，所用金电极首先采用对巯基苯胺通过金巯键进行修饰。
4.根据权利要求I所述传感器，经巯基苯胺修饰后的电极，将其插入lOmmol/L培氟沙星溶液中，室温孵育2h。
5.一种检测抗生素培氟沙星传感器的制备方法，其特征在于，将经培氟沙星修饰的电极，浸入含有10mmol/L对巯基苯胺，50mol/L四丁基高氯酸铵，IOmoI/L培氟沙星和O. 2g/L高氯酸溶液中，在-O. 3-1. 2V，50mv/s，扫描10圈，之后将此电极在含有O. 2mol/L的盐酸的甲醇水溶液中浸泡lh，以除去模板分子培氟沙星，从而制备成传感器。
6.一种检测抗生素培氟沙星的传感器的制备方法，其特征在于，为证明所制备的分子印迹电化学传感器其空白对照的制备方法除不加模板分子培氟沙星以外，其他步骤与权利要求5所述的方法相同。
7.—种权利要求I所述传感器的应用，其特征在于，包括以下步骤 1)待测样本滴于如权利要求I所述免疫传感器的工作电极表面，室温下孵育15min； 2)电化学传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含O.lmol/LKCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液； 3)设定适宜的扫描参数，进行循环伏安以及差分脉冲伏安法测定。
全文摘要
本发明涉及一种检测抗生素培氟沙星的分子印迹传感器及其制备方法。基于电镀法制备能够特异性识别培氟沙星的分子印迹电化学传感器。该分子印迹电化学传感器，以金电极为工作电极，将其用巯基苯胺修饰，以增加培氟沙星结合位点，之后以氯金酸、巯基苯胺、四丁基高氯酸铵的混合溶液为电镀液，电镀制备分子印迹识别膜，采用盐酸电解离的方法去除分子印迹膜中的模板培氟沙星。所制备的分子印迹电化学传感器，结构稳定，制备方法简单，能够重复使用，灵敏度高，特异性好。本发明实现的牛奶中培氟沙星的痕量检测，提高检测灵敏度，成本低，有良好的应用前景。
文档编号G01N27/48GK102967638SQ201210495429
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者孙秀兰, 田秀梅, 张银志, 纪剑 申请人:江南大学