专利名称：血吸虫虫卵粗抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白纯化和检测技术领域，特别涉及抗原纯化和抗体检测技术领域，具体是指一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒。
背景技术：
血吸虫病免疫学诊断方法是较可靠的辅助诊断方法，也是流行病学调查最常用的工具。在血吸虫病免疫学诊断方法中，目前常用的有酶联免疫法、间接血凝法、胶体染料试纸条法、胶体金斑点免疫渗滤法。虽然这些方法各有利弊，但在血吸虫病检测的敏感性和特异性方面没有明显区别，都纳入了中华人民共和国卫生行业标准一血吸虫病诊断标准(WS261-2006)。胶体金免疫层析试纸条是备受世界卫生组织推崇的“高技术制备，低技术应用”的免疫学诊断方法，其优势在于操作简便、反应快速，不需任何专门设备，不需工作人员特殊培训，既可用于血清流行病学调查，又能作为单份检测个别病例的免疫学诊断工具。但是，目前我国应用效果较好的几种血吸虫病免疫诊断试剂盒,不仅胶体金免疫层析试纸条,而且包括酶联免疫法、间接血凝法、渗滤法等,均将血吸虫虫卵粗抗原(SEA)作为检测用抗原，以检测血清中特异性抗体。这就不可避免的与其他寄生虫病如并殖吸虫病和华支睾吸虫病等存在着不同程度的交叉反应。原因在于SEA组分复杂，且与其它虫种存在一定的交叉抗原，其诊断效能受到较大限制。其次，在血吸虫病免疫学诊断方法中，与ELISA比较，胶体金免疫层析试纸条敏感性较低，受检的血清量较大(50 100 μ I)等缺陷依然存在，受检者需静脉抽血，增加疼痛和心理压力，依从度降低，不便于现场工作人员采样，使其现场大规模应用受到限制。再次，这些试剂盒适用对象单一，只针对人或者动物，增加现场流行病学调查成本和工作强度。因此，需要提供一种具有血清用量少，交叉反应低，应用范围广等特点，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学调查、疾病筛查以及免疫学诊断的快速检测方法。

发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，该血吸虫虫卵粗抗原纯化方法设计巧妙，操作简便，由此得到的纯化抗原作为血吸虫抗体检测抗原，可以减少血清用量，增加检测灵敏度，降低交叉反应率，扩大应用范围，检测效果准确可靠，操作简便易行，成本降低，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学调查、疾病筛查以及免疫学诊断，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法，其特点是，采用Sephacryl S-300HR柱层析分离血吸虫虫卵粗抗原,去除分子量〈lOkDa组分。
较佳地，最后用截留IOkDa分子量的超滤管进一步分离纯化。所述血吸虫虫卵粗抗原实际上是指破碎的血吸虫虫卵浸出物。较佳地，所述血吸虫虫卵粗抗原通过下述方法制备:从病兔肝收集分离血吸虫虫卵，加入生理盐水制成匀浆并超声粉碎，4°C冷浸3天后离心，所得上清即为所述血吸虫虫卵粗抗原。在本发明的第二方面，提供了一种血吸虫虫卵纯化抗原，其特点是，采用上述的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法制备而成。在本发明的第三方面，提供了上述的血吸虫虫卵纯化抗原在制备检测血吸虫抗体的检测产品中的应用。在本发明的第四方面，提供了一种血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特点是，包括血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有上述的血吸虫虫卵纯化抗原作为检测物质。较佳地，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有上述的血吸虫虫卵纯化抗原免疫家兔获得的抗体作为质控物质。较佳地，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的金标垫上具有胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原。更佳地，所述金标垫采用聚酯膜作为吸附材料，所述聚酯膜预先采用0.l%Triton-100溶液浸泡IOmin作亲水处理。更佳地，所述的胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之前保存在金标保存液中，所述金标保存液的配方为:0.01mol/L pH8.0PB, 1%BSA,0.2%PEG20000,0.01%迭氮钠，其余是蒸馏水。更佳地，所述的胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之时采用金标稀释剂稀释，所述金标稀释剂的配方为:0.01mol/L pH8.0PB,1.6%NaCl,0.01% 土温-20，20%蔗糖，1%BSA, 0.01%迭氮钠，其余是蒸馏水。较佳地，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒还包括样品缓冲液，所述样品缓冲液的配方为:0.02mol/L pH8.0PB, 1%BSA,0.05%PEG20000,0.02%迭氮钠，其余是蒸馏水。本发明的有益效果具体在于:1、本发明的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法采用S^hacryl S-300HR柱层析分离血吸虫虫卵粗抗原，去除分子量〈lOkDa组分，以之为血吸虫抗体检测抗原，可以减少血清用量，增加检测灵敏度，降低交叉反应率，扩大应用范围，检测效果准确可靠，操作简便易行，成本降低，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学调查、疾病筛查以及免疫学诊断，适于大规模推广应用。2、本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒包括血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有上述的血吸虫虫卵纯化抗原作为检测物质，可以减少血清用量，增加检测灵敏度，降低交叉反应率，扩大应用范围，检测效果准确可靠，操作简便易行，成本降低，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学调查、疾病筛查以及免疫学诊断，适于大规模推广应用。


图1是本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的一具体实施例的侧视示意图，其中I为硝酸纤维素膜；2为T线；3为C线；4为金标垫；5为样品垫；6为吸水纸；7为底板。图2是图1所示的具体实施例的俯视示意图，其中I为硝酸纤维素膜；2为T线；3为C线；4为金标垫；5为样品垫；6为吸水纸。图3是采用图1所示的具体实施例对最低阳性检出参考品(P16)测试结果，其中左起依次为P16原液、P16原液的1:4的稀释液、P16原液的1:8的稀释液、P16原液的1:16的稀释液、P16原液的1:32的稀释液、阴性参照。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。请参见图1 图2所示，本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜(NC膜)上包被有血吸虫虫卵纯化抗原作为检测线即T线。首先制备血吸虫虫卵粗抗原(可溶性SEA):取经皮接种1500条日本血吸虫尾蝴45d的家兔肝脏，按文献(毛守白.血吸虫生物学与血吸虫病的防治[M].北京:人民卫生出版社，1990:465.)方法收集分离虫卵，依次经200孔/25.4mm和300孔/25.4mm尼龙絹过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理(lmin，10次)，液氮冻融3次，4°C冷浸3天后，以IOOOOr/min离心30min，上清液即为SEA，用分光光度计测定蛋白含量，分装后一 20°C冻存备用。其次,血吸虫虫卵粗抗原纯化:本发明采用Sephacryl S-300HR柱层析分离SEA抗原，去除分子量〈lOkDa组分，并将蛋白液置截留IOkDa分子量的超滤管内进一步分离纯化，保留具有特异性反应活性的抗原蛋白组分，去除引起交叉反应的蛋白组分。具体操作:将烯丙基葡聚糖凝胶S-300HR预装柱装载于BioLogic LP纯化仪，用
0.05mol/LPBS充分平衡，取SEA2ml，加2ml I3BS,经0.45 μ m滤膜过滤后上样。流速定为Iml/min，由纯化仪自动控制，并按分子量大小依次收集>10kDa蛋白组分蛋白液。收集完毕后，将蛋白液置截留IOkDa分子量的超滤管内脱盐浓缩，用分光光度法测试蛋白浓度后分装保存于-20°C备用。检测线(T线)的组成:本发明以SEA纯化抗原作为检测线主要成分，包被液为
0.01mol/LpH7.2磷酸盐(PB)缓冲液，最佳包被浓度为0.8mg / ml。主要作用是提高检测的特异性。其原理为:当胶体金标记的SEA抗原与受检血清中相应抗体结合成复合物，经层析方式通过T线时，与包被的SEA结合，形成胶体金SEA抗原-特异性抗体-SEA结合物，胶体金滞留在T线上，产生红色条带。而由于T线上包被的是纯化抗原，若受检血清中只有其他抗体或交叉反应性抗体等，即使沾染上胶体金SEA抗原，在通过T线时，都不会与纯化抗原结合而滞留，不会形成红色反应带。划线(T线):本发明采用XYZ3050三维喷点系统以非接触方式作喷点式划线，避免在操作时对膜造成的物理损伤，与通常试纸条接触式划线比较，可避免非特异性抗体在T线滞留而产生假阳性反应，提高检测的特异性。具体操作:将2.25cm宽硝酸纤维素膜(NC膜，型号M135)粘在PVC底板上，以0.8mg / ml纯化SEA作为检测线(T线)溶液，用三维喷点系统以1μ I / cm的速率在硝酸纤维素膜上面进行划线，线距为距硝酸纤维素膜下端lcm,37°C烘干lOmin。本发明线距较通常试纸条延长2 3mm,有助于抗体与金标垫释放的SEA抗原充分结合，以提高检测的灵敏度。请参见图1 图2所示，本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有上述的血吸虫虫卵纯化抗原免疫家兔获得的抗体作为质控线即C线。抗SEA抗体制备:按常规方法用纯化SEA免疫2只新西兰白兔，加强免疫4次剖杀采血，收集分离血清，用辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体，然后用截留IOOkDa分子量的超滤管脱盐浓缩3次，测定蛋白浓度后分装保存于-20°C备用。本发明采用超滤管脱盐，效率高，耗时短，只需I小时就可完成，并且还可使抗体得到浓缩。而常规方法需时2天，对抗体活性保持构成负面影响。具体操作:将盐析法纯化的抗体溶液分置截留IOOkDa分子量的超滤管内，每管容积15ml，5000g离心15min，然后倒掉滤过液，在截留管内加0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，再同法离心，如此重复3次后，截留管内未滤出液即为已脱盐并浓缩的纯化抗体，用分光光度法测试蛋白浓度后分装保存于_20°C备用。划线(C线):本发明将抗SEA抗体作为质控线(C线)，包被液为0.01mol/LpH7.2PB缓冲液添加终浓度为3%甲醇组成，最佳包被浓度为5mg / ml。添加少量甲醇的目的是增强抗体在硝酸纤维素膜上面的吸附力。也采用非接触方式作喷点式划线，线距为T线上方5mm处。具体操作同3.。请参见图1 图2所示，本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的金标垫上具有胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原。胶体金标记SEA抗原:本发明采用胶体金直接标记SEA抗原，可以提高层析卡检测灵敏度。因为受检血清只要存在抗血吸虫特异性抗体，无论是IgG或IgM甚至IgA抗体，都可与SEA抗原结合，相比一般试纸条标记的是第二抗体，如抗人IgG，只能与人的IgG抗体结合；或者也有标记A蛋白的，可以与人或动`物的IgG结合，但不能结合其它抗体，本发明的灵敏度大为提高。再者，由于直接检测抗SEA抗体，无论是人还是动物，只要体内存在相应抗体，就可直接在层析卡T线显示红色条，扩大了应用范围，减少现场流行病学调查成本和工作强度。具体操作:采用柠檬酸三钠还原法制备直径为35nm的胶体金颗粒。即:取1%氯金酸5ml溶于495ml dH20，加热至100°C，快速加入1%柠檬酸三钠5ml，加热煮沸IOmin,溶液颜色由黑逐渐变为紫红色。冷却后用0.1!1101/1碳酸钾调溶液？!1至8.0。按最适蛋白稳定量为20μ g / ml计算，在500ml胶体金溶液内加入IOmg SEA，磁力搅拌30min，加入5%BSA100ml,继续搅拌5min, 10000r/min离心30min,沉淀物加入适量金标保存液调节浓度为250D值(529nm波长)，4°C保存备用。聚酯膜处理:聚酯膜是金标垫的吸附材料，本发明所用聚酯膜型号为6613，属疏水性，因此，须作亲水处理。处理所用表面活性剂的种类、浓度和作用时间等对于金标结合物的吸附、释放至关重要，吸附过强、释放过快均不利于金标结合物与抗体的结合，导致检测灵敏度降低。经摸索比较，本发明选择Triton-100为处理剂，浓度为0.1%。具体操作:将聚酯膜裁减成0.8 X 30cm大小，浸于0.l%Triton_100溶液中lOmin，取出后将剩余液体吸掉，置42°C烘干2h，室温保存备用。本发明的胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之前保存在金标保存液中，所述金标保存液的配方为:0.01mol/L pH8.0PB, 1%BSA,0.2%PEG20000,0.01%迭氮钠(N3Na),其余是蒸馏水。白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG) 20000均为保护剂，稳定胶体金状态。本发明提高BSA的浓度，除了稳定作用外，还具有封闭非特异性位点作用，降低非特异性反应。本发明的胶体金标记的上述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之时采用金标稀释剂稀释，所述金标稀释剂的配方为:0.01mol/L pH8.0PB,1.6%NaCl，0.01% 土温-20，20%蔗糖，1%BSA，0.01%迭氮钠，其余是蒸馏水。金标稀释剂配方中是否用表面活性剂以及所用种类和浓度等对于金标结合物的释放至关重要，释放过快不利于金标结合物与抗体的结合，浓度过高还会引发胶体金变性导致出现死金现象，导致检测灵敏度降低。经摸索比较，本发明选择土温-20，终浓度为0.01%。在配方中还有一个重要化合物，即蔗糖，对胶体金结合物起到稳定作用，可以延长使用期限，而且，如果不加蔗糖，甚至连反应带无法显色。本发明经多次反复探索比较，选择20%蔗糖溶液为最适浓度。金标垫制备方法:本发明将胶体金标记物用金标稀释液按1:1稀释，浸于
0.8 X 30cm大小已处理的聚酯膜lOmin，置42°C烘干6h，放入铝箔袋中，室温保存备用。本发明的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒还包括样品缓冲液，所述样品缓冲液的配方为:0.02mol/L pH8.0PB，1%BSA，0.05%PEG20000，0.02%迭氮钠，其余是蒸馏水。样品缓冲液组成成分及PH高低对反应条带的显色程度以及灵敏度均有影响。本发明较高浓度的BSA和较高pH值的Tris碱缓冲液(TBS)，一方面对已包被的硝酸纤维素膜进行封闭，另一方面增强了反应带显色程度，提高了检测灵敏度。本发明层析卡制备过程:本发明在对层析卡组成关键要素进行发明和改进的基础上，将各要素按序装配成可作即时检测的层析卡。具体步骤为:将2.25cm宽硝酸纤维素膜条粘在PVC底板上，以0.0ImoI/L pH7.2PB缓冲液将SEA纯化抗原稀释成0.8mg / ml浓度，作为检测线(T线)，以0.01mol/L pH7.2PB缓冲液添加3%甲醇，稀释抗SEA抗体至5mg /ml浓度作为质控线(C线)，用三维喷点系统以非接触方式按1μ I / cm的速率在硝酸纤维素膜上面作喷点式划线，37°C烘干lOmin。然后，按图1和图2示，在包被好的硝酸纤维素膜上方粘上吸水纸垫，下方依次粘上金标结合垫和样品垫，用自动切条机分切成3mm宽度试纸条，装入塑料卡盒中，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封，置室温保存备用。本发明层析卡使用方法:非常简便，即在加样孔内加5 μ I受检血清，然后加I滴样品缓冲液，20min时即可判断结果。T线和C线均出现为阳性，无T线为阴性结果。血清加样量减少:在上述最佳反应体系的基础上,本发明将血清用量减至5 μ 1，为目前血吸虫病检测试纸条最少用量。此举便于现场工作人员采样，只需用三菱针在耳垂或指末采集10 15 μ I血液至采血管，静置15min吸取血清即可进行检测。受检者无需静脉抽血，减少了疼痛和心理压力，更容易接受和配合操作。一、SEA纯化前后的检测效果比较本发明SEA经S印hacryl S-300HR柱层析纯化后检测灵敏度没有降低，与纯化前SEA—样均达到1:32，超过国家参考品对试纸条最低检出值1:4的8倍；并且纯化SEA的交叉反应率较纯化前明显降低，两者对其它寄生虫病的交叉反应率分别为2.1%和16.7%，其中对并殖吸虫病分别为5.6%和33.3%，均具有统计学意义(P〈0.05);此外，纯化抗原的特异性也较粗抗原明显提高(表I)。表ISEA粗抗原与纯化抗原血吸虫抗体检测结果比较
TablelComparison of results ofantibody to schistosomiasis with SEA purified or not in GICA

权利要求
1.一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法,其特征在于,采用Sephacryl S-300HR柱层析分离血吸虫虫卵粗抗原，去除分子量〈lOkDa组分。
2.根据权利要求1所述的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法，其特征在于，最后用截留IOkDa分子量的超滤管进一步分尚纯化。
3.根据权利要求1所述的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法，其特征在于，所述血吸虫虫卵粗抗原通过下述方法制备:收集血吸虫虫卵，加入生理盐水制成匀浆并超声粉碎，4°C冷浸3天后离心，所得上清即为所述血吸虫虫卵粗抗原。
4.一种血吸虫虫卵纯化抗原，其特征在于，采用根据权利要求1 3任一所述的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法制备而成。
5.根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原在制备检测血吸虫抗体的检测产品中的应用。
6.一种血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，包括血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原作为检测物质。
7.根据权利要求6所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的硝酸纤维素膜上包被有根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原免疫家兔获得的抗体作为质控物质。
8.根据权利要求6所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫层析卡的金标垫上具有胶体金标记的根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原。
9.根据权利要求8所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述金标垫采用聚酯膜作为吸附材料，所述聚酯膜预先采用0.l%Triton-100溶液浸泡IOmin作亲水处理。
10.根据权利要求8所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记的根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之前保存在金标保存液中，所述金标保存液的配方为:0.01mol/L pH8.0PB, 1%BSA，0.2%PEG20000,0.01%迭氣纳，其余是蒸懼水。
11.根据权利要求8所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记的根据权利要求4所述的血吸虫虫卵纯化抗原在吸附至所述金标垫上之时采用金标稀释剂稀释，所述金标稀释剂的配方为:0.01mol/L ρΗ8.0PB,1.6%NaCl，0.01% 土温-20，20%蔗糖，1%BSA, 0.01%迭氮钠，其余是蒸馏水。
12.根据权利要求6所述的血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒，其特征在于，所述血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒还包括样品缓冲液,所述样品缓冲液的配方为:0.02mol/LpH8.0PB, 1%BSA, 0.05%PEG20000,0.02% 迭氮钠，其余是蒸馏水。
全文摘要
本发明涉及一种血吸虫虫卵粗抗原纯化方法，采用Sephacryl S-300HR柱层析分离血吸虫虫卵粗抗原，去除分子量<10kDa组分。较佳地，最后用截留10kDa分子量的超滤管进一步分离纯化。收集血吸虫虫卵，加入生理盐水制成匀浆，然后超声粉碎并离心，所得上清即为血吸虫虫卵粗抗原。还提供了血吸虫虫卵纯化抗原、其应用以及血吸虫抗体检测胶体金免疫试剂盒。本发明的血吸虫虫卵粗抗原纯化方法设计巧妙，操作简便，由此得到的纯化抗原作为血吸虫抗体检测抗原，可以减少血清用量，增加检测灵敏度，降低交叉反应率，扩大应用范围，检测效果准确可靠，操作简便易行，成本降低，更适用于血吸虫病低度流行区现场流行病学调查、疾病筛查以及免疫学诊断，适于大规模推广应用。
文档编号G01N33/558GK103076447SQ201210580499
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者蒋守富, 刘静, 张小萍 申请人:上海市疾病预防控制中心, 上海疾控生物科技有限公司