专利名称：用于显微镜观察的植物样品的前处理方法
技术领域：
本发明涉及用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，特别是一种植物材料超薄切片、半超薄切片、表面扫描样品制作前的处理方法，属于显微镜样品制作技术领域。
背景技术：
显微技术已成为现代科学技术研究中不可缺少的重要工具。透射与扫描电子显微镜在生物学、医学、材料学及其他学科方面有着广泛应用，与光学显微镜相比，具有高分辨率、高放大倍数和可做高分辨图像的特点，利用它可以获得生物组织细胞精细的超微结构， 显微结构或立体结构图像，为物体组织表面或断面的精细结构的研究提供了光学显微镜技术所不能得到的大量信息，为研究微观世界开辟了新的领域。而光学显微镜可为生物组织显微结构的观察提供较广的视野，提供生物细胞显微水平的结构信息。细胞超微结构、显微结构、表面形态结构观察的效果，关键是样品的制备，而样品制备的关键步骤是材料的有效、快速固定。作物高产与稳产是提高我国经济安全和粮食安全的重要因素。目前，对作物细胞超微结构、显微结构以及表面特征及其变化的观察是评价作物抗逆性、适应性及其高产性状的重要方面，作物高产、优质、水肥高效利用机理等日益成为生物学领域的研究热点；因而，电子与光学显微镜样品的制备与观察也成为该领域研究的重要手段。然而，受众多因素和繁杂实验步骤的影响，显微镜样品的制备与观察往往难以成功。很多作物，例如小麦、玉米、水稻等我国重要农作物，其茎、叶表面为硅质细胞层，并包裹有腊质角质层，阻碍固定液在有效时间内进入组织细胞，使得材料不能充分固定，严重影响显微镜下的观察效果，甚至导致实验前功尽弃。另外，很多作物由于表面污物障碍而使扫描电子显微镜的观察效果大打折扣。例如，小麦白粉病为真菌性病害，发病初期，叶片、叶鞘和茎秆，甚至麦穗产生白色粉状小霉斑，表面覆有一层白色粉质；水稻、小麦等作物茎、叶表面具有一层疏水性的白色蜡质角质层；大豆由于较长而密集的腺毛以及经常发生的霜霉病导致叶片表面黏附较多的杂尘等异物；柽柳、补血草、滨藜等泌盐植物，从土壤中吸收盐分，部分盐离子如钾、钠、钙、 镁、氯和硫离子等会通过盐腺分泌出来，形成白色的结晶体粘附于叶片或茎的表面。以上黏附于材料表面的异物很难用常规方法去除，特别是对材料体积较小而又需要及时固定的样品。因此，显微镜观察植物样品的快速、有效固定以及表面黏附物体的洁净是保证植物细胞超微结构、显微结构、组织表面形态结构观察的关键步骤。公开号为。C W673722A(申请号为200510067183. X)的中国专利，公开了一种细胞凝集素探针。它设有组分I、II、III，其中；III为样品固定体系，选自鲁格氏碘液、多聚甲醛和戊二醛中的一种，鲁格氏碘液的浓度为10% 20%，鲁格氏碘液的终浓度为0. 5% 1. 5%，多聚甲醛的浓度为10% 20%，多聚甲醛的终浓度为0. 5% 1. 5%，戊二醛的浓度为20% 25%，戊二醛的终浓度为1. 0% 2. 5%。该申请中的固定体系是用来固定赤潮生物，由于赤潮生物中不存在作物表面的硅质细胞层和蜡质角质层，因此该固定液无法在有效时间内进入组织细胞，无法充分固定材料。

发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，该方法可有效地提高植物细胞超微结构、显微结构、表面形态结构的固定与表面的洁净，提高植物样品制作的成功率与观察效果。本发明解决技术问题所采取的技术方案是用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，步骤如下(1)吸取固定液2_3ml置入容积5_10ml的器皿中，然后冷却，得样品固定液；(2)将植物组织切成l_3m3的组织块，然后置入步骤(1)制得的样品固定液中，密封器皿；(3)对步骤( 制得的密封后的器皿抽气，使植物组织块全部沉到器皿底部；然后将器皿放入超声波清洗器，调整水温，工作频率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品在4°C下固定2-4小时，得经前处理的植物样品。所述步骤(1)中的固定液通过如下方法配制将戊二醛和多聚甲醛分别加入至磷酸缓冲液中，使戊二醛的终浓度为2. 2-2.8% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为2. 8-3. 2% (重量体积百分比)，磷酸缓冲液终浓度为 IOOmM0优选的，所述戊二醛的终浓度为2. 5% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为3% (重量体积百分比)。优选的，所述重量体积百分比单位为g/ml。优选的，所述的磷酸缓冲液的pH = 7. 2。所述步骤(1)中的冷却温度为4_8°C。所述步骤C3)将器皿放入超声波清洗器，使器皿的80%没入清洗槽的水中。所述步骤(3)中调整水温至4_8°C。经前处理的植物样品随后的处理可按常规超薄切片、半薄切片、扫描电子显微镜观察样品制作方法等现有技术进行处理。有益效果1、本发明的采用超声波清洗器处理植物组织块，通过超声波所具有的空化效应， 增大介质分子的运动速度及穿透力，激活固定液戊二醛和多聚甲醛分子，消除组织细胞间隙微小气泡对固定液入渗的阻碍，有效提升植物材料的固定效果，同时起到材料表面清洁的效果；2、超声波清洗器对于不可避免的需要隔离的材料必须间接处理，即放在容器中再置于清洗槽内进行，本发明所采用的特定的超声波频率和功率使得固定液分子具有很强的穿透力，使得间接处理与直接处理有着同样的效果；3、本发明的操作步骤均是在4_8°C下进行，细胞中的蛋白水解酶类、脂肪酶类、淀粉酶类等处于钝化状态，避免以上酶类对细胞结构以及有机大分子的降解，有利于稳定细胞超微结构、显微结构以及表面形态结构，使观察效果达到最佳状态；
4、样品固定液中加入3%的多聚甲醛，多聚甲醛溶解于水后解聚为分子量较小的单体或寡聚体，可快速通过细胞壁、细胞质膜渗透到细胞内部，起到快速固定的效果；5、本发明可有效地提高植物材料组织细胞超微结构的固定与表面洁净效果，使细胞内叶绿体、线粒体、细胞核等膜系统清晰度显著增加；对诸如胞间连丝等在常规操作中难以观察到的细胞组分其固定效果更为显著；同时，由于对材料表面进行了有效的清洁，因而在扫面电子显微镜下对组织表皮细胞排列、气孔分布、腺毛、盐腺等植物材料表面形态结构的观察更为清晰；6、本发明操作简单，所用的超声波清洗器为实验室中的常规仪器，成本低，便于应用；7、本发明适用于所有需要固定的植物样品的制作，特别是对表面有较厚的蜡质角质层、表层为硅质细胞的植物材料，例如小麦、玉米、水稻等茎、叶组织，应用效果更佳。


图1是按照实施例1的方法制得的样品在透射电子显微镜下观察的照片；图2是按照实施例1中的对照例的方法制得的样品在透射电子显微镜下观察的照片；图3是按照实施例2的方法制得的样品在光学显微镜下观察的照片；图4是按照实施例2中的对照例的方法制得的样品在光学显微镜下观察的照片；图5是按照实施例3的方法制得的样品在扫描电子显微镜下观察的照片；图6是按照实施例3中的对照例的方法制得的样品在扫描电子显微镜下观察的照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。戊二醛购自Sigma公司，多聚甲醛购自上海试一化学试剂有限公司。实施例1、用于小麦穗下茎组织细胞固定、透射电子显微镜下对超微结构的观察用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，步骤如下(1)吸取固定液2_3ml置入容积5ml的小玻璃瓶中，然后冷却至4°C，得样品固定液，固定液通过如下方法配制将戊二醛和多聚甲醛分别加入至pH7. 2的磷酸缓冲液中，使戊二醛得终浓度为 2.5% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为3% (重量体积百分比，g/ml)，磷酸缓冲液终浓度为IOOmM ；(2)将穗下茎切成Im3的组织块，然后置入步骤(1)制得的样品固定液中，小瓶用橡胶瓶盖盖紧；(3)将医用注射器针头插入步骤( 制得的用橡胶瓶盖盖紧的小瓶内，抽气3-5分钟，以样品全部沉到瓶底为准；然后将器皿放入超声波清洗器，使器皿的80%没入清洗槽的水中，调整水温至4-8°C，工作频率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品在4°C下固定2-4小时，得经前处理的植物样品。
(5)按照《实用电子显微镜技术》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)49-66页的记载，随后的操作步骤与常规超薄切片的制作相同。将最终制作的小麦穗下茎秆组织细胞超薄切片在透射电子显微镜下观察，观察结果如图1所示(标尺=lym)。对照例按照《实用电子显微镜技术》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)49-66 页的记载进行操作，将最终制作的小麦穗下茎秆组织细胞超薄切片在透射电子显微镜下观察，观察结果如图2所示(标尺=lym)。通过将实施例1的结果图1与对照例的结果图2进行比较，可以得出，用本发明制作的超薄切片所观察的小麦茎秆组织细胞其超微结构观察效果显著提高，即使衰老的茎细胞其叶绿体中类囊体片层也非常清晰，说明本发明可有效对表面有较厚蜡质角质层、硅质细胞层的小麦茎组织细胞超微结构快速固定。实施例2、用于小麦穗下茎组织固定、光学显微镜下对显微结构的观察用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，步骤如下(1)吸取固定液2_3ml置入容积8ml的小玻璃瓶中，然后冷却至4°C，得样品固定液，固定液通过如下方法配制将戊二醛和多聚甲醛分别加入至pH7. 2的磷酸缓冲液中，使戊二醛得终浓度为 2.5% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为3% (重量体积百分比，g/ml)，磷酸缓冲液终浓度为IOOmM ；(2)将穗下茎切成3m3的组织块，然后置入步骤(1)制得的样品固定液中，小瓶用橡胶瓶盖盖紧；(3)将医用注射器针头插入步骤( 制得的用橡胶瓶盖盖紧的小瓶内，抽气5-8分钟，以样品全部沉到瓶底为准；然后将器皿放入超声波清洗器，使器皿的80%没入清洗槽的水中，调整水温至4-8°C，工作频率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗3_5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品在4°C下固定2-4小时，得经前处理的植物样品。(5)按照《实用电子显微镜技术》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)49-66页和68页的记载，随后的操作步骤与常规超薄切片的制作相同。将最终制作的小麦穗下茎秆组织细胞超薄切片在光学显微镜下观察，观察结果如图3所示(标尺=200 μ m)。对照例按照《实用电子显微镜技术》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)49-66 页和68页的记载进行操作，将最终制作的小麦穗下茎秆组织细胞超薄切片在光学显微镜下观察，观察结果如图4所示(标尺= 200μπι)。通过将实施例2的结果图3与对照例的结果图4进行比较，可以得出，用本发明制作的半超薄切片所观察的小麦茎秆组织细胞其显微结构观察效果显著提高，其薄壁细胞中叶绿体数目明显多于对照例中的叶绿体数目，说明本发明可有效对材料体积较大、表面有较厚蜡质角质层、硅质细胞层的小麦茎组织细胞显微结构快速固定。实施例3、用于小麦穗下茎组织表面的固定、扫描电子显微镜下对表面形态结构的观察用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，步骤如下(1)吸取固定液2_3ml置入容积IOml的小玻璃瓶中，然后冷却至4°C，得样品固定液，固定液通过如下方法配制将戊二醛和多聚甲醛分别加入至pH7. 2的磷酸缓冲液中，使戊二醛得终浓度为 2.5% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为3% (重量体积百分比，g/ml)，磷酸缓冲液终浓度为IOOmM ；(2)将小麦叶片组织切成3m3的组织块，然后置入步骤⑴制得的样品固定液中， 小瓶用橡胶瓶盖盖紧；(3)将医用注射器针头插入步骤( 制得的用橡胶瓶盖盖紧的小瓶内，抽气5-8分钟，以样品全部沉到瓶底为准；然后将器皿放入超声波清洗器，使器皿的80%没入清洗槽的水中，调整水温至4-8°C，工作频率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗3_5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品在4°C下固定2-4小时，得经前处理的植物样品。(5)按照《实用电子显微镜技术》(ISBN:978-7-206-05491-4，2007年12月出版)89-99页的记载，随后的操作步骤与常规超薄切片的制作相同。将最终制作的小麦穗下茎组织表面在扫描电子显微镜下观察，观察结果如图5所示(标尺=30 μ m)。对照例按照《实用电子显微镜技术》(ISBN :978-7-206-05491-4, 2007年12月出版)89-99 页的记载进行操作，将最终制作的小麦穗下茎组织表面在扫描电子显微镜下观察，观察结果如图6所示(标尺=30 μ m)。通过将实施例3的结果图5与对照例的结果图6进行比较，可以得出，用本发明制作的超薄切片所观察的小麦穗下茎组织表面非常洁净，其气孔等表面形态结构观察效果显著提高，说明本发明可有效对表面有白色蜡质层的小麦茎组织表面进行有效清洗。
权利要求
1.用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，其特征在于，步骤如下(1)吸取固定液2-3ml置入容积5-10ml的器皿中，然后冷却，得样品固定液；(2)将植物组织切成l_3m3的组织块，然后置入步骤(1)制得的样品固定液中，密封器皿；(3)对步骤( 制得的密封后的器皿抽气，使植物组织块全部沉到器皿底部；然后将器皿放入超声波清洗器，调整水温，工作频率40-60kHz，功率0. 3-0. 6w/cm2,清洗2_5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品在4°C下固定2-4小时，得经前处理的植物样品。
2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的固定液通过如下方法配制将戊二醛和多聚甲醛分别加入至磷酸缓冲液中，使戊二醛的终浓度为2. 2-2. 8% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为2. 8-3.2% (重量体积百分比)，磷酸缓冲液终浓度为 IOOmM0
3.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述戊二醛的终浓度为2.5% (体积百分比)，多聚甲醛的终浓度为3% (重量体积百分比)。
4.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述重量体积百分比单位为g/ml。
5.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液的pH= 7. 2。
6.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的冷却温度为 4-8 "C。
7.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤C3)将器皿放入超声波清洗器，使器皿的80%没入清洗槽的水中。
8.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中调整水温至4-8°C。
全文摘要
本发明涉及用于显微镜观察的植物样品的前处理方法，属于显微镜样品制作技术领域。步骤如下(1)吸取固定液置入器皿中，冷却，得样品固定液；(2)将植物组织切成组织块，然后置入步骤(1)制得的样品固定液中，密封器皿；(3)对步骤(2)制得的密封后的器皿抽气；然后将器皿放入超声波清洗器，清洗2-5分钟，得清洗样品；(4)将步骤(3)制得的清洗样品固定2-4小时，得经前处理的植物样品。本发明通过超声波所具有的空化效应，增大介质分子的运动速度及穿透力，激活固定液戊二醛和多聚甲醛分子，消除组织细胞间隙微小气泡对固定液入渗的阻碍，有效提升植物材料的固定效果，同时起到材料表面清洁的效果。
文档编号G01N1/34GK102175501SQ20111000321
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者冯波, 司纪升, 孔令安, 宋华东, 张宾, 李升东, 王法宏 申请人:山东省农业科学院作物研究所