一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，属于生物【技术领域】。所述的试剂盒包括膜条、酶标液、底物和酶标孵育缓冲液；所述的膜条由固定板和依次固定在硝酸纤维素膜上的抗原条带、临界质控带、功能质控线构成；所述的抗原条带有AMA-M2、LKM-1、LC-1、SLA、F-actin、gp210、Sp100和La/SS-B中的8个或6个彼此独立的划线划到硝酸纤维素膜上形成。本发明可同时检测自身免疫肝病相关的8种抗体，并可作为辅助诊断的依据。本发明加入的La/SS-B条带，可将自身免疫肝病和因干燥综合征引发的肝损伤区分开来，为正确的给药方案提供依据。
【专利说明】一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种诊断疾病的试剂盒，具体地，涉及一种检测自 身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒。

【背景技术】
[0002] 自身免疫肝病是一类病因不明的慢性进行性肝脏疾病，与自身免疫反应急切相 关，早期临床表现隐匿，难以与慢性病毒性肝炎区分，而这两种疾病的治疗方式有很大的不 同，若治疗不当最终可发展为肝纤维化和肝硬化，只能通过肝移植延长患者生命。因此，自 身免疫性肝病早期诊断和鉴别诊断是十分迫切和必要的。自身免疫性肝病都有特异性的抗 体，是用于早期诊断和鉴别诊断疾病的重要依据。
[0003] 常见的自身免疫性肝病有自身免疫性肝炎（AIH)，原发性胆汁性肝硬化（PBC) 等。AIH特征性的自身抗体有：抗LKM-1 (肝肾微粒体抗体1)、LC-1 (肝胞液1抗原抗体）、 SLA(可溶性肝抗原抗体）和F-actin(F型肌动蛋白抗体）等抗体；PBC的特异性自身抗体 有AMA-M2 (线粒体M2抗体）、gp210 (跨膜糖蛋白210kd蛋白抗体）、splOO(磷酸化核蛋白 100kd多核点抗体）的抗体。
[0004] 干燥综合征患者的肝脏病变主要为肝脏增大（25%?28% )、碱性磷酸酶升高 (25%?33% )，病理活检可见原发性胆汁性肝硬化的表现，也可表现为慢性活动性肝炎。 原发性胆汁性肝硬化与干燥综合征具有一定的相关性，约3/4的原发性胆汁性肝硬化患 者有干燥症状，其中33%?47%的患者合并有典型的干燥综合征；而干燥综合征患者中 7%?13%抗微粒体抗体阳性，也提示原发性干燥综合征与原发性胆汁性肝硬化联系密切。 但原发性胆汁性肝硬化患者体内很少有抗SSA和抗SSB抗体，其干燥症状可能是继发性干 燥综合征的表现。
[0005] 对于自身免疫疾病诊断方法多采用间接免疫荧光分析法（IFA)、酶联免疫吸附法 (ELISA)和免疫印迹法，但各有其不足。间接免疫荧光分析法是检测自身抗体的常用技术。 其实验基质一般是鼠肝片或猴肝片，含有完整的抗原谱，适合筛查试验。但是有如下缺点： 不能作为确诊依据；结果的判断需要有丰富的经验；滴度的意义大于核型，但滴度的判定 主观性强；灵敏度较低，特异性也不高。
[0006] 酶联免疫吸附法（ELISA)具有灵敏度高，可作为筛选试验，也可作为确诊依据，还 可定量测定，检测病情和治疗效果。但一次试验只能检测单一指标，通量低，检测成本较高， 在自身免疫疾病的诊断应用推广方面存在着极大的局限性。Westernblot(WB)是在凝胶电 泳和免疫分析技术基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有SDS-PAGE的高分辨力核固 相免疫测定的高特异性和敏感性的优点，比较适合发现未知的抗体。而对于检测已知的抗 体，由于使用了天然的混合抗原，实验过程中经常出现找不到目标条带和条带偏移的问题， 给结果的判读造成了不少困难，极易误判和漏判。同时WB使用时间长，也不适合在临床检 验中推广。有人将WB改进，直接将纯化抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后进行免疫反应检 测抗体，形成了改良的免疫印迹法，但目前还很少有人将该方法用于检测自身免疫肝病的 自身抗体，且不能将自身免疫肝病和干燥综合征引起的肝炎区分开来。
[0007] 对于现有的试剂盒，存在下述缺点：
[0008] 1、WB使用时间长，操作复杂。
[0009] 2、WB使用了天然的混合抗原，实验过程中经常出现找不到目标条带和条带偏移的 问题，给结果的判读造成了不少困难，极易误判和漏判。
[0010] 3、ELISA方法一次只能检测一个项目，效率不高。
[0011] 4、IFA方法仅能进行筛查，不具有辅助诊断的意义。
[0012] 5、目前还没有能同时检测自身免疫肝病相关的7种自身抗体并将干燥综合征引 起的肝损伤区分开的线性免疫分析法。
[0013] 6、目前的试剂盒中，一般没有质控线或者一个质控线只能作为一个检测结果对 照，没有能够同时至少作为两个以上检测结果对照的质控线。


【发明内容】

[0014] 为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种检测自身免疫 肝病相关自身抗体谱的试剂盒。该试剂盒是一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱，可以 同时对6个或8个检测条带起到质控的作用，并且同时区分因干燥综合征引起的肝损伤的 试剂盒。
[0015] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的 试剂盒，包括膜条、酶标液、底物和酶标孵育缓冲液；
[0016] 所述的膜条由固定板和依次固定在硝酸纤维素膜上的抗原条带、临界质控带、功 能质控线构成；
[0017] 所述的抗原条带有AMA-M2、LKM-1、LC-1、SLA、F-actin、gp210、SplOO和La/ SS-B(抗干燥综合征抗原B抗体）中的8个或6个彼此独立的划线划到硝酸纤维素膜上形 成。
[0018] 所述SplOO、gp210、F-actin、LC-1和SLA由昆虫细胞sf9表达并纯化制得；所述 AMA-M2是从PBC患者的胆管上皮细胞中提取制得；所述LKM-1是人工合成的多肽；所述La/ SS-B是利用丙酮法从犊牛胸腺组织提取的天然蛋白。
[0019] 所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间的间隔 等宽。
[0020] 所述抗原条带宽度为0. 5?2mm，相邻抗原条带之间间隔为2mm?10mm。
[0021] 所述临界质控带的成分为0. 5?1yg/mL的人IgG。现有技术中有没有关于同一 对照线同时用于6个或8个抗原条带判读的记载。本发明通过创造性实验发现，选择一定 浓度范围的人IgG作为临界质控带，可以清楚准确的对6个或8个抗原条带进行判读。
[0022] 所述临界质控带的制备方法包括下述步骤：
[0023] 1)选择m个确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有8个抗 原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m 个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数据得到8组数值，分别计算这8组数 值的平均值M、标准差SD和各个抗原所检测抗体的临界质控值C0,其中CO=M-2XSD;同时 测得m个临界质控带的灰度值的平均值MI|S#、标准差SDI|S#和临界质控带的临界质控值C0I|S 界，其中C0_=M_+2XSD_ ;计算所有8个抗原检测抗体灰度值的平均值M,&、标准差SD总和总的临界值CO总，其中CO总=M总_2XSD总；
[0024] 2)如任一抗原条带C0及C0,e,均大于0)_，则0)_有效，如任一抗原条带C0或 C0,e,小于0)_，；则C0I|S#无效，则调整抗原包被量重复步骤1)重新测定，直至任一抗原条 带C0及C0总均大于C0临界；
[0025] 3)选择确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫 描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值C0I(^比较，如果 所有的样本灰度值均不大于C0^，则COi#有效；如果有一个或以上的样本灰度值大于C0I|S #，需再次测定验证；如仍有一个或以上的样本灰度值大于COlls#，则调整抗原包被量重复步 骤1)、步骤3)，重新确定膜条的临界质控值;
[0026] 4)根据确定的膜条的临界质控值确定临界质控带包被人IgG的浓度。
[0027] 所述的步骤1)中的m彡30。
[0028]该方法中，功能质控线属于现有技术，为免疫球蛋白G，其M^彡30，其目的是用于 判断该膜条的一次反应是否有效。步骤1)的阴性和步骤4)的阳性是指当具有这些抗原所 能检测到的抗体时为阳性，不具有这些抗原所能检测到的抗体时为阴性。本方案的膜条的 每个抗原都彼此独立地划线到硝酸纤维素膜上形成一个独立的抗原检测线，这些抗原检测 线统称为抗原条带，步骤1)中的"取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个 抗原所检测抗体的灰度值"，这里的灰度值为每一个抗原检出限检测样品后扫描得到的灰 度值。本方案的发明点可同时最多检测自身免疫肝病相关的8中自身抗体，而且设置了一 个可以同时对6条或8条检测条带起到判读的临界质控带。
[0029] 所述酶标液优选为pH7. 4的10mMTris-HCl含甘油35mL/L、吐温-201mL/L、小牛 血清 100mL/L、凯松 10mL/L。
[0030] 所述底物为：含0? 042%TMB、0. 3%丙酮、4%无水乙醇、0? 3g/LEDTA，3%甘油的 10mmol/L的柠檬酸缓冲液。
[0031]所述的孵育洗涤缓冲液优选为NaCl 80g/L、KH2P042g/L、Na2HP04?12H2014. 5g/L、 KC1 2g/L、吐温200.5ml/L。
[0032] 所述自身免疫肝病包括自身免疫肝炎I型、II型、III型和原发性胆汁性肝硬化。
[0033] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0034] 1、可同时检测自身免疫肝病相关的8种抗体，并可作为辅助诊断的依据。
[0035] 2、本发明具有独创性的临界质控带，一个临界质控带可以同时对6个或8个抗原 条带起到判读的作用，将显色条带与临界质控带的颜色的深浅比较即可判断结果：阳性： 颜色比临界质控带相同或深；阴性：颜色比临界质控带浅。
[0036] 3、本发明还改良了单试剂底物，加入底物后用纯化水、去离子水或蒸馏水即可终 止，且终止后颜色稳定，2年内不会退色。
[0037] 4、本发明加入的La/SS-B条带，可将自身免疫肝病和因干燥综合征引发的肝损伤 区分开来，为正确的给药方案提供依据。

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1是本发明膜条的结构示意图。

【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅 限于下述实施例。
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例的自身免疫肝病抗体谱检测试剂盒包括膜条、酶标液、底物和浓缩洗涤 孵育液，其中酶标液和浓缩洗涤孵育液的选择属于现有技术。
[0042]如图1所示，膜条由固定板和依次固定在硝酸纤维素膜上的抗原条带、临界质控 带、功能质控线构成，抗原条带由AMA-M2、LKM-1、LC-1、SLA、F-actin、gp210、SplOO和La/ SS-B中的8个或6个彼此独立的划线划到硝酸纤维素膜上形成，临界质控带同时作为抗原 条带中的至少6个抗原条带的对照条带。临界质控带的临界质控值确定方法如下：
[0043] 1)选择30个确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有8个抗 原，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将30 个样本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数据得到8组数值，分别计算这8组数 值的平均值M、标准差SD和各个抗原所检测抗体的临界质控值C0,其中CO=M-2XSD;同 时测得30个临界质控带的灰度值的平均值MI|S#、标准差SDI|S#和临界质控带的临界质控值 C〇?，其中C0_= ;计算所有8个抗原检测抗体灰度值的平均值M总、标准 差SD总和总的临界值C0总，其中C0总=M总_2XSD总；
[0044] 2)如任一抗原条带C0及C0,e,均大于0)_，则0)_有效，如任一抗原条带⑶或 C0,&小于C0^，则C0I(^无效，则调整抗原包被量重复步骤1)重新测定，直至任一抗原条带 C0及C0总均大于C0临界；
[0045] 3)选择确诊为阴性的新鲜血清标本100份作为样本，取膜条对每一个样本进行 检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值C0I(^比 较，如果所有的样本灰度值均不大于C0^，则COi#有效；如果有一个或以上的样本灰度值 大于需再次测定验丨正；如仍有一个或以上的样本灰度值大于，则调整抗原包被 量重复步骤1)、步骤3)，重新确定膜条的临界质控值C0^ ;
[0046] 4)根据确定的膜条的临界质控值确定临界质控带包被人IgG的浓度。
[0047] 实施例2
[0048]本实施例是对由AMA-M2、LKM-1、LC-1、SLA、F-actin、gp210、SplOO和La/SS-B这 8个彼此独立的划线到硝酸纤维素膜上的抗原条带进行试验测定。在实施例1的基础上，为 了使结果判定更加简单可靠，将每个抗原条带宽度均一设置，条带间隔等宽，抗原条带宽度 为0? 5?2mm，相邻抗原条带之间间隔为2mm?10mm。采用改良的含TMB0. 042%底物，用纯 化水、去离子水或蒸馏水即可终止，且终止后颜色稳定，2年内不会退色。所有的印迹抗原都 是高度纯化的，且采用了最新的包被工艺，具体方法见后述。
[0049]临界质控值的确定：
[0050] 1)确定各抗体的临界质控值
[0051] 随机选取临床确诊为阳性的新鲜血清标本30例，用本实施例的试剂盒检测，测定 其抗原条带所检测的相应抗体的灰度值，计算30份标本中各相同抗体的灰度值均值M和标 准差SD，可得到每个抗体95%的置信上限（M-2XSD)，即为各抗体的临界质控值，记做C0。 计算所有8个抗原检测抗体灰度值的平均值M&标准差SD和总的临界值CO,其中[email protected]=M总_2XSD总。结果见下表1所示：
[0052] 表1 8个抗原检测抗体灰度值的结果
[0053]

【权利要求】
1. 一种检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于包括膜条、酶标液、底 物和酶标孵育缓冲液； 所述的膜条由固定板和依次固定在硝酸纤维素膜上的抗原条带、临界质控带、功能质 控线构成； 所述的抗原条带有 AMA-M2、LKM-l、LC-l、SLA、F-actin、gp210、Spl00 和 La/SS-B 中的 8个或6个彼此独立的划线划到硝酸纤维素膜上形成。
2. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述Spl00、gp210、F-actin、LC-l和SLA由昆虫细胞sf9表达并纯化制得；所述AMA-M2是 从PBC患者的胆管上皮细胞中提取制得；所述LKM-1是人工合成的多肽；所述La/SS-B是利 用丙酮法从犊牛胸腺组织提取的天然蛋白。
3. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述抗原条带相互平行并且每个抗原条带宽度均一，各相邻抗原条带之间的间隔等宽。
4. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述抗原条带宽度为0. 5?2mm，相邻抗原条带之间间隔为2mm?10mm。
5. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述临界质控带的成分为〇. 5?1 y g/mL的人IgG。
6. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述临界质控带的制备方法包括下述步骤： 1) 选择m个确诊为阳性的新鲜血液标本作为样本，膜条的抗原条带中具有8个抗原，取 膜条对每一个样本进行检测，扫描得到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将m个样 本中相同的抗原所检测抗体的灰度值作为一组数据得到8组数值，分别计算这8组数值的 平均值M、标准差SD和各个抗原所检测抗体的临界质控值CO,其中CO = M-2XSD ;同时测 得m个临界质控带的灰度值的平均值MI|S#、标准差SDI|S#和临界质控带的临界质控值CO^， 其中C〇临界=M临界+2 XSD临界；计算所有8个抗原检测抗体灰度值的平均值M总、标准差SD总 和总的临界值C0总，其中C0总=M总_2XSD总； 2) 如任一抗原条带C0及C0总均大于C0临界，则C0临界有效，如任一抗原条带C0或C0总 小于CO^，;则C0I(^无效，则调整抗原包被量重复步骤1)重新测定，直至任一抗原条带C0 及C0总均大于C0临界； 3) 选择确诊为阴性的新鲜血液标本作为样本，取膜条对每一个样本进行检测，扫描得 到膜条中每一个抗原所检测抗体的灰度值，将其与膜条的临界质控值C0I(^比较，如果所有 的样本灰度值均不大于C〇n，则COng#有效；如果有一个或以上的样本灰度值大于C〇n， 需再次测定验证；如仍有一个或以上的样本灰度值大于COllSp则调整抗原包被量重复步骤 1)、步骤3)，重新确定膜条的临界质控值CO^ ; 4) 根据确定的膜条的临界质控值确定临界质控带包被人IgG的浓度； 所述的步骤1)中的m彡30。
7. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述酶标液为PH7. 4的10mM Tris-HCl含甘油35mL/L、吐温-201mL/L、小牛血清100mL/L、 凯松 10mL/L。
8. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于： 所述底物为含0. 042% TMB、0. 3%丙酮、4%无水乙醇、0. 3g/L EDTA，3%甘油的lOmmol/L的 柠檬酸缓冲液。
9. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于：所述的孵育洗涤缓冲液为 NaCl 80g/L、KH2P042g/L、Na2HP04 ? 12H2014. 5g/L、KCl 2g/L、吐温 200.5ml/L〇
10. 根据权利要求1所述的检测自身免疫肝病相关自身抗体谱的试剂盒，其特征在于： 所述自身免疫肝病包括自身免疫肝炎I型、II型、III型和原发性胆汁性肝硬化。
【文档编号】G01N33/558GK104459159SQ201410822845
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】张伟民, 黄颖冰 申请人:广州南杰生物技术有限公司