专利名称：一种禽网状内皮组织增生症病毒elisa抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学领域提供了ー种试剂盒，具体提供了一种禽网状内皮组织增生症病毒(REv)ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术：
禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotlleliosis, RE)是由禽反转录病毒属的网状内皮组织增生症病毒(REV)所引起的ー组病理综合征，包括网状内皮组织细胞瘤、矮小综合征、淋巴肿瘤和其他组织的慢性肿瘤等。继禽马立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今已经确定的禽类第三种传染性肿瘤病。最早的REV毒株是1958年从美国的一例患内脏淋巴瘤的火鸡脾脏中分离到的，经过在火鸡和鸡连续300次传代而获得的一株新病毒。
REV感染的自然宿主有火鸡、鸡、鸭、鹅等，可引起被感染禽的免疫抑制，干扰其他的免疫效应，导致免疫失败，并容易造成继发感染，使疫病的诊断和防控难度加大。现如今国内还没有有效的疫苗和药物来进行预防和治疗，对鸡群REV抗体水平进行检测，可确切了解鸡群抗体水平，进而了解感染状况，及时淘汰患病鸡，浄化鸡群。随着我国养鸡业受到REV感染的危害日益严峻，研制REV血清抗体检测试剂盒的临床需求更加迫切。REV标准毒株SNV的env基因编码的gp90C末端表位位于感染细胞的表面，含有顺序和构象表位，是病毒的免疫显性蛋白，能够激发感染宿主产生中和抗体；因此REV的env蛋白被认为是ー种应用于REV诊断的良好选择。目前，国内外采用的REV病毒检测技术主要有病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫组织化学、聚合酶链式反应(PCR)等。上述技术和方法虽然可以检测REV病毒或抗体水平，在实践中也取得了一定的效果。但均存在实验技术操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成品昂贵等缺点，不宣用于临床检测。国内至今还未见REV抗体检测试剂盒的相关专利，国外特异性检测REV抗体检测试剂盒虽已经商品化，但由于昂贵，很难大范围使用。与现有的国外商品化试剂盒相比，本试剂盒的特异性更强、敏感性更高。

发明内容
本发明的发明人针对现有REV病毒检测技术存在的诸多不足之处，提供了ー种禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要包含有预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白，采用这种试剂盒特异性达100% ;灵敏度为I : 700。本试剂盒用于对鸡群REV抗体水平进行检测，确切了解鸡群REV感染状況。本发明的具体技术方案是所提供的试剂盒主要包含有预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白；而且与常规试剂盒相比，本发明中应用的终止液为3moL/L的H2SO4溶液，主要原因是该终止液的使用可使结果由蓝色变为黄色，更易于人肉眼的观察。其中试剂盒中的REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清分别作为阳性对照和阴性对照，其均采用现有技术在严格的饲养条件下获得；其中，所述的经过原核表达并纯化后的env蛋白，是通过如下方法获得的提取感染了直接从市场上(中科院微生物菌种库)购得的REV标准毒株SNV株的DFI细胞DNA，根据REV-env基因序列设计特异性引物上游引物5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’，其基因序列如 Seq ID No :1 所示，下游引物 5’_CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3’，其基因序列如Seq ID No :2所示，并在引物中分别添加了 EcoR I和Xhol I酶切位点，以PCR扩增出env基因，将env基因克隆入表达载体pET_28a质粒，得到了重组载体pET-28a-env重组质粒，使用O. 2 O. 3mmoL IPTG诱导表达出了带有His标签的融合蛋白His-env，其分子量约为45KD，更具体的为46. 3KD，此蛋白以包涵体的形式存在，用8mol的尿素溶解包涵体，梯度尿素复性蛋白。 试剂盒中的其他组分中包被缓冲液为O. 05M ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液，IL溶液中含I. 59gNa 2C03，2. 93gNaHCO3，包被量为每孔O. 2 O. 3μ g ;封闭液为质量浓度是2 % 3%的脱脂奶粉水溶液，封闭时间为Ih ;样品稀释液为含有体积浓度为O. 5%。的吐温-20的O. Olmol/L及pH 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)，样品稀释倍数为600 700倍，孵育时间为2h ;酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗鸡IgG单抗酶结合物，其稀释倍数为5000倍，孵育时间为2h ;浓缩洗涤液为含有体积浓度为5%。的吐温-20的O. lmol/L及pH 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS);酶底物溶液为3，3，-5，5，-四甲基联苯胺溶液(TMB)，孵育时间为20-30min ;终止液为3mol/L H2S04溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。上述组分中的各种反应条件是本发明的发明人经过长期试验后，提供的最佳反应条件，判定依据为对每次反应的数据进行处理，计算反应的P/N值，以P/N值最大，且P值接近I作为间接ELISA最佳反应条件的判定依据。P/N值计算方法P/N值=阳性对照孔0D45Qnm均值/阴性对照孔0D45(lnm均值。通过上述方法获得的各种參数是本试剂盒检测过程中最佳的反应条件，可以最大限度的降低反应过程中可能出现的误差，能够更加准确的反应检测样本的真实情況；检测中用到的封闭液价廉易得，孵育条件为实验室常用的37°C温箱，上述的各个条件均为检测的正常进行提供了有利条件。而本发明上述的禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，步骤如下试剂盒内各组分回温到室温(18-25°C )，颠倒摇动混合均匀。I)取出包被板，记录样品位置；2)每空加入300 μ L封闭液，37°C温箱孵育Ih ；3)用大约350 μ L稀释后的洗涤液洗涤微孔共3_5次，洗涤后将孔内液体完全拍干;4)加100 μ L不需稀释的阳性对照血清至Al和BI孔，100 μ L不需稀释的阴性对照血清至Cl和Dl孔；5)加100 μ L稀释好的样品至相应的孔，所有样品既可进行双孔检测也可进行单孔检测；37°C温箱孵育2h ；6)重复步骤3 ；7)每孔加100 μ L酶标羊抗鸡抗体(HRPO)，37°C温箱孵育2h ；8)重复步骤3 ；9)每孔加100 μ LTMB底物溶液，37°C温箱显色20_30min ；10)每孔加100 μ L终止液终止反应；11)测量其0D450nm吸光值并进行记录。上述操作步骤简单，可靠性好，且准确度和快捷度都有了很大的提高。
综上所述，本发明提供了一种禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要包含有预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白，采用这种试剂盒特异性达100%;灵敏度为I : 700。本试剂盒用于对鸡群REV抗体水平进行检测，确切了解鸡群REV感染状況。较之现有REV病毒检测技术准确度和快捷度有了极大的提高


图I为SDS-PAGE分析诱导不同时间env蛋白的存在形式电泳示意图；图中M为170KD蛋白Marker ；1为诱导前包涵体；2为诱导Ih后包涵体；3为诱导2h后包涵体；4为诱导3h后包涵体；5为诱导3h后上清；图2为Western blot法检测蛋白特异性电泳图；图中 M 为 Protein Marker (KD) ；I 为 env 蛋白；图3为本发明试剂盒优化步骤图。
具体实施例方式下述实施例中除特殊注明外，其他均采用现有常规技术实施例II. REV env基因的克隆及测序提取感染了直接从市场上(中科院微生物菌种库)购得的REV标准毒株SNV株的DFI细胞DNA，根据REV标准毒株SNV株前病毒基因组DNA env基因两端的一段序列作为引物。上游引物为 5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’，其基因序列如 Seq ID No :1 所示，下游引物为 5’-CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3’，其基因序列如 Seq ID No :2 所示，并在引物中分别添加了 EcoR I和Xhol I酶切位点。PCR反应条件为95°C 5min，充分变性后进入循环体系95°C 30s, 60°C lmin，72°C 2min，共30个循环；然后72°C延伸lOmin。使用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。将pET_28a载体与PCR纯化产物分别用限制性内切酶EcoR I.Xhol I双酶切6h，按照胶回收试剂盒说明分别回收大片段，于16°C下连接过夜。连接体系为pET-28a载体I μ L，双蒸水3 μ L，纯化的DNA目的片段4 μ L，Τ4连接酶I μ L，10 X buffer I μ L，总体积为
10 μし转化产物按常规方法转化入CaC12法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序。2. His-env蛋白的表达和纯化将上述含有重组质粒的BL21菌接种于含卡钠霉素的LB固体培养基，37°C培养过挑取单菌落接种于含Kan (终浓度为30 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C振荡(200rpm)，培养至OD6tltl = O. 6，加入IPTG至终浓度为O. 2 O. 3mmol/L，37°C继续培养3h，同时设未诱导的重组质粒转化BL21菌作为对照。经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白His-env以包涵体形式表达,检测步骤如下收集培养的工程菌菌液，5000rpm，离心5min，弃上清；称取30g收集到的湿菌于500ml烧杯中，加入300ml的重悬液,加入转子在磁力搅拌器上搅拌20min,使菌体分散均匀；将上述烧杯置于冰浴，用超声破菌仪超声破菌，120W，工作4s，间歇4s，超声Ih左右，用枪头吹吸菌液，待菌体不再黏着时，第一次超声破菌结束；将超声破菌液转入500ml离 心管中，配平，放入高速冷却离心机中，12000rpm,4°C,离心20min ;取沉淀,加入200ml的重悬液，用上述方法进行第二次超声，然后离心，大约超声2 4次后，去沉淀，处理后用SDS-PAGE电泳检测；His-env蛋白的纯化步骤如下将上述沉淀用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，静置5min后，12000rpm, 15mi弃上清。用9倍体积的洗漆液II重悬沉淀,静置5min后，12000rpm, 15min,弃上清,保留粘稠上清。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后，12000rpm, 15min，弃上清，保留粘稠上清。按IOOml菌液加4ml溶解液，剧烈震荡Ih0 12000rpm，离心15min。取上清，即为溶解的包涵体。包涵体纯化所述试剂配制方法(I)细菌重悬液(250ml) :PBS (NaCl 2g, KCl O. 05g, Na2HP040. 36gKH2P040. 06g)，lmm/LEDTA.(2)溶液 I (250ml) 500mmol/L Tris-Cl (PH = 8. 0)，IOOmmoI/L NaCl，IOOmmoI/LEDTA(3)溶液 II (250ml):溶液 I，2M 尿素(4)溶液 III (250ml) 溶液 I，4M 尿素(5)包涵体溶解液(250ml):溶液I，8M尿素将上述溶解的包涵体装入透析袋中，依次使用20mmol/L Tris-Cl (PH = 8. O) AM尿素透析2h，20mmol/L Tris-Cl (PH = 8.0), 2M尿素透析2h，20mmol/L Tris-Cl (PH = 8· 0)，IM尿素透析 lh, 20mmol/L Tris-Cl (PH = 8· O)，O. 5Μ尿素透析 2h, 20mmol/L Tris-Cl (PH =8. 0), 20mmol/L Tris-Cl (PH = 8. 0)透析 6h, 12000rpm 离心 2min 弃掉沉淀,得到的上清极为纯化完成的His-env融合蛋白。使用SDS-PAGE法检测纯化后的蛋白。得到的蛋白经过Bradford法测定蛋白含量,稀释到O. 5mg/ml分装-20°C保存备用。SDS-PAGE操作步骤如下I)将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12%分离胶，快速注入到两玻璃板之间，胶上部加ImL蒸馏水封ロ，保持胶平整。待分离胶凝固后(约40min)，倒去分离胶表面的液体，用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子，并注意防止气泡的产生。等待其凝固。2)取纯化后的 His-env 蛋白 100 μ I 等量 2X SDS 上样 buffer,煮沸 5-lOmin。3)往电泳槽加入I X Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固后(约30min)，小心拔掉梳子，用缓冲液冲洗加样孔，用微量进样器上样，10 μ I/孔，正确连接电泳槽正负极，打开电源。先用80V电压电泳，待样品浓缩成一条线并进入分离胶后，提高电压至150V，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳。4)染色取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考染溶液中，染色4h以上。5)脱色将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色液，待凝胶蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中終止脱色。拍照保存。使用上述纯化得到的His-env融合蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验检测该蛋白的生物学活性。以IDEXX公司生产的REV抗体检测试剂盒检测为阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鸡IgG酶标ニ抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2，说明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。实施例2.抗体检测试剂盒的优化步骤常规的间接ELISA检测步骤如下I)包被取纯化的重组蛋白His-env，以碳酸盐缓冲液(1L溶液中含I. 59gNa2C03,2. 93gNaHC03)稀释至最佳浓度，包被反应板，100 μ I/孔，4°C过夜。2)洗涤甩去酶标板中的包被液，用PBST(体积浓度为O. 5%。的吐温-20的O. 01mol/L及pH 7.2的磷酸盐缓冲液)加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次,拍干。3)封闭各孔加入5被％脱脂乳水溶液，35(^1/孔，置37で培养箱孵育211，洗涤3次,3min/次,拍干。4)加样将待检血清按梯度稀释后加入包被板，100 μ I/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37°C温箱孵育lh，洗涤3次，3min/次，拍干。5)用封闭液将HRP羊抗鸡IgG酶标ニ抗按I : 3000稀释，100 μ I/孔，置37°C培养箱孵育lh，洗涤3次，3min/次，拍干。6)显色使用TMB单组份显色试剂盒(TIANGEN公司产品)按100 μ I/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，3M H2SO4终止显色。7)用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450值为N，阳性对照OD45tl值为P。若P/N > 2. O判为阳性。以上常规エ艺各參数，但是发明人经过试验发现，对本发明来说上述的并不是最佳的反应条件，为此发明人进行了优化，具体优化过程如下。优化条件的判定依据为对每次反应的数据进行处理，计算反应的P/N值，以P/N值最大，且P值接近I作为间接ELISA最佳反应条件的判定依据。P/N值计算方法P/N值=阳性对照孔0D45Qnm均值/阴性对照孔0D45(lnm均值。I.抗原抗体最佳稀释倍数将抗原(REN-env蛋白)与抗体(待检REV阳性血清)分别倍比稀释，正交实验进行ELISA检测。结果显示抗原胡最佳包被量为每孔O. 2 O. 3 μ g，待检血清最佳稀释倍数为600 700倍。
2.最佳包被液的选择分别用以下六种溶液作为包被液进行检测CB 50mmol/L PH 9. 6 碳酸盐缓冲液 TB 20mmol/LPH 8. 5Tris-HclPBS PH 7. 4 PBST PH 7. 4 W :蒸馏水 S :生理盐水结果显示最佳抗原包被液为CB 50mmol/L PH 9. 6碳酸盐缓冲液；PBST与蒸馏水不可用于包被。 3.最佳封闭液浓度的选择将试验室最常用、最易得的脱脂乳配制成O. 25% -7% 9个不同的梯度浓度，分别进行检測。结果显示最佳封闭液浓度为2 3wt %的脱脂乳水溶液。4.最佳封闭时间的选择用2 3wt%的脱脂乳水溶液分别做O. 5h-3h 6个梯度的封闭时间进行检测，结果显示最佳封闭时间为Ih。5.抗血清最佳作用时间的选择将抗血清及对照血清稀释相应倍数后，每孔加入100μ L，分为四组，每组孵育不同时间，结果显示待检血清最佳作用时间为2h。6. ニ抗最佳稀释度的选择ニ抗为北京博奥森公司羊抗鸡ニ抗(HRP标记)，将此ニ抗分别作1000-6000六个梯度稀释，分别进行检测，结果显示ニ抗最佳稀释倍数为5000倍。7. ニ抗作用时间的选择将以上ニ抗稀释5000倍在O. 5h-3h之间设置六组，分别作用于ELISA板进行检測，结果显示ニ抗最佳作用时间为2h。8.最佳显色时间的选择用TMB单组份底物显色液在15min-45min区间内分为六组分别进行检测，检测结果显不最佳显色时间为20 30min。9.临界值的计算随机抽取40份SPF鸡血清，用优化的ELISA方法检测，计算出这40份血清的平均OD450nm的平均值(X)和标准差SD，阴阳性临界值=X+3SD。当检测的样本0D45(lnm值彡X+3SD时，可在99. 9%的水平上判定为阳性。临界值计算结果为O. 340。实施例3.实验结果及分析本发明上述的禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，步骤如下试剂盒内各组分回温到室温(18-25°C )，颠倒摇动混合均匀。I)取出包被板，记录样品位置；2)每空加入300 μ L封闭液，37°C温箱孵育Ih ；3)用大约350 μ L稀释后的洗涤液洗涤微孔共3-5次，洗涤后将孔内液体完全拍干;4)加100 μ L不需稀释的阳性对照血清至Al和BI孔，100 μ L不需稀释的阴性对照血清至Cl和Dl孔；5)加100 μ L稀释好的样品至相应的孔，所有样品既可进行双孔检测也可进行单孔检测；37°C温箱孵育 2h;6)重复步骤3;7)每孔加100 μ L酶标羊抗鸡抗体(HRPO)，37°C温箱孵育2h ；8)重复步骤3;9)每孔加100 μ LTMB底物溶液，37°C温箱显色20_30min ；10)姆孔加100 μ L终止液终止反应；11)测量其0D450nm吸光值并进行记录； 应用上述的使用方法，发明人进行了如下的检测I.特异性检测按照优化的ELISA操作流程对ALV-J、MDV、NDV、H5N1、H9N1病毒阳性血清进行测定，以REV阳性血清与阴性血清作为对照，进行特异性试验，检测结果如下(表I)表I特异性试验结果
阳性阴性其他病原鸡抗血清对照对照 ALV-J MDV NDVH5H9
I 292(PX7 O しつU I7X0.085U I S3 0.095结果显亍ALV-J、MDV、NDV、H5N1、H9N1病毒阳性血清0D450nm值均小于O. 340，与REV阳性血清均无交叉反应，本发明所述的试剂盒具有良好的特异性。2.重复性试验2. I板内重复用同一批制备的env蛋白包被I快酶标板，在同一块酶标板内检测4份阳性血清样品，每份血清样品重复5孔，计算其平均值、标准差和变异系数(CV)，检测结果如下(表2)表2板内重复性试验结果
编号标准羌平均值 CV
10.392 0.402 0.428 0.415 0.381 0.019 0.404 4.6%
2I Ki 1.131 1.205 1.17 1.186 0.028 1.171 2.4%
30.951 0.929 I. !40 I て)15 0.941 0.100 ().990 10.1%
40.558 U ^17U 4乃 0.499 0.025 0.518 4 8%板内的变异系数最小值为L 4%，最大值为10. 1%，小于15%，说明同一份血清样本在同一块板内的变异程度较小，具有较好的重复性。2. 2板间重复用同一批制备的env蛋白包被5块酶标板，相同条件下分别在5块酶标板内检测4份不同的阳性血清样品，计算每ー份血清样品的平均值、标准差和变异系数(CV)，检测结果如下(表3)表3板间重复性试验结果
权利要求
1.一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包含有预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的erw蛋白。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求I或所述的试剂盒，其特征在于所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的erw蛋白，其制备方法为 提取感染了市购REV标准毒株SNV株的DFI细胞DNA，根据REV_env基因序列设计特异性引物上游引物 5 ’ -CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3，，其基因序列如 Seq ID No : I 所示，下游引物 5 ’ -CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3 ’，其基因序列如 Seq ID No : 2 所示，并在引物中分别添加了 EcoR I和XhoI I酶切位点，以PCR扩增出env基因，将env基因克隆入表达载体pET-28a质粒,得到了重组载体pET-28a_env重组质粒,使用O. 2 O. 3mmoLIPTG诱导表达出了带有His标签的融合蛋白His-env，其分子量为46. 3KD,此蛋白以包涵体的形式存在。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的预包被时采用的包被缓冲液为O. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液其IL溶液中含I. 59gNa2C03，2. 93g NaHCO3，包被量为每孔O.2 O. 3 μ g ; 封闭液为质量浓度是2% 3%的脱脂奶粉水溶液，封闭时间为Ih ； 样品稀释液为含有体积浓度为O. 5%。的吐温-20的O. Olmol/L及pH 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)，样品稀释倍数为600 700倍，孵育时间为2h ； 酶结合物为辣根过氧化物酶-山羊抗鸡IgG单抗酶结合物，其稀释倍数为5000倍，孵育时间为2h ； 浓缩洗涤液为含有体积浓度为5%。的吐温-20的O. lmol/L及pH 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)； 酶底物溶液为3，3，-5，5，-四甲基联苯胺溶液，孵育时间为20-30min ； 终止液为3mol/L H2SO4溶液。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为REV病毒阳性鸡抗血清；阴性对照为SPF鸡血清。
6.如权利要求I所述的一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，步骤如下试剂盒内各组分回温到室温(18-25°C )，颠倒摇动混合均匀 1)取出包被板，记录样品位置； 2)每空加入300μ L封闭液，37°C温箱孵育Ih ； 3)用大约350μ L稀释后的洗涤液洗涤微孔共3-5次，洗涤后将孔内液体完全拍干； 4)加100μ L不需稀释的阳性对照血清至Al和BI孔，100 μ L不需稀释的阴性对照血清至Cl和Dl孔； 5)加IOOyL稀释好的样品至相应的孔，所有样品既可进行双孔检测也可进行单孔检测；37°C温箱孵育2h ； 6)重复步骤3； 7)每孔加100μ L酶标羊抗鸡抗体(HRPO)，37°C温箱孵育2h ；8)重复步骤3；9)每孔加100μ LTMB底物溶液，37°C温箱显色20_30min ； 10)每孔加100μ L终止液终止反应；11)测量其0D450nm吸光值并进行记录。
全文摘要
本发明涉及动物病毒学领域，具体提供了一种禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要包含有预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白，采用这种试剂盒特异性达100％；灵敏度为1∶700。本试剂盒用于对鸡群REV抗体水平进行检测，确切了解鸡群REV感染状况。
文档编号G01N33/569GK102680682SQ20121017379
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者姜艳萍, 成子强, 王峰 申请人:山东农业大学