专利名称：一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白检测技术领域，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力的糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其制备方法。
背景技术：
糖尿病是人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白(GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白 糖化反应的产物。形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高.正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正t匕。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2 3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要。目前常用的糖化血红蛋白的检测方法有两大类高压液相方法(HPLC)和免疫方法。高压液相方法(HPLC)所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，且要仔细观察图谱，所以该法得不到普遍采用。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异；抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点，也得不到广泛使用。核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子，国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库，通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程)，并结合体外扩增技术，经过多轮的循环选择富集，获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25飞0个核苷酸。核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性，使其在疾病诊断中具有良好的应用前景，尽管目前成熟的临床应用报道较少，但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多，基于适体的检测新技术也不断出现。专利CN201010580661.8，名称为蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体及其制备方法，公布了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体的序列特征，通过设计合成单链DNA随机寡核苷酸库、筛选目的寡核苷酸序列、流式分析鉴定等步骤制备出蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸适体。专利CN201110148431. 9和专利CN201110148603. 2，公布了 HCV E1E2蛋白的和HCV NS5A蛋白核酸适体及其衍生物、筛选方法和应用，其中核苷酸适体衍生物包括取代后的RNA核酸适体、骨架改造后的衍生物、改造为肽核酸后的衍生物以及连接上放射性分子后的衍生物。专利CN201210214996. 7，公布了可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用，公开了一种用前述微流控芯片筛选所述核酸适体的筛选方法，包括优化核酸文库、初筛、纯化、循环几个主要步骤，该发明的检测方法具有高亲和力和高特异性的优点。
由上可知，核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于糖化血红蛋白GHb的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的糖化血红蛋白检测技术的不足，填补还未见糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种糖化血红蛋白GHb核酸适体及其制备方法，本发明所提供的核酸适体为SEQ ID NOTseq id no:4所示，分别命名GHbl、GHb2、GHb3、GHb4。本发明的方案是通过这样实现的
一种糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列包括有SEQ IDNO: rSEQ ID NO:4中的任意一条DNA片段序列，分别命名为GHbl、GHb2、GHb3、GHb4，其序列为
SEQ ID NO: I gggaggcatg tgtgctaagg cgtagcaggg ttggaaccc ；
SEQ ID NO:2 :gggaggcatg tgatttaagg cgcggcagat gttggaaccc ；
SEQ ID NO:3 gggaggcatg agacctatgg cgttgcattg gttggaaccc ；
SEQ ID NO:4 gggaggcatg ggaaacaatg cgccgcagag ttggaaccc0一种制备以上任一所述的糖化血红蛋白核酸适体方法，其特征在于包括以下步骤
(1)构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为IO5IO6的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(i-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N25~6(i为25 60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTAITCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区；
(2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将有活化氨基的微磁珠与糖化血红蛋白按照0. 05、. 2ml: Img的比例在偶联缓冲液中混合，再加入10(T200ul偶联剂溶液，25° C反应条件下轻混2(T30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物；
(3)初次筛选靶物质-核酸复合物将2 5nmol单链DNA随机序列寡核苷酸库溶于结合缓冲液，进行加热处理，单链DNA文库与没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37° C温育15 40min，用洗脱缓冲液洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92° C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列 的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选。(5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过12 20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与糖化血红蛋白结合的特异性和亲和力。以上所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体方法，所述的PCR扩增用到的PCR引物序列为
引物 I :5’ -ATACCAGCTTATTCAATT-3’
引物 2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’
所述的PCR扩增引物2的5’端含生物素标记；
所述PCR扩增工艺条件为94°C预变性5 min，94°C 30s, 47°C lmin，72°C lmin,扩增10 25个循环，最终延伸反应为72°C IOmin0以上所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体方法，所述的偶联缓冲液为含20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl，ImM DTT, pH 5. 5 ;所述偶联剂溶液为含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述结合缓冲液为含100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6，2 mMMgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2,0. 02% Tween 20, I mM DTT ;所述热处理为 90 °C 加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min ;所述洗脱缓冲液为含20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mM NaCl，10 mM EDTA。以上所述的糖化血红蛋白核酸适体或者所述的制备得到的糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒中。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种以上任一所述糖化血红蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种
(1)将权利要求I中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；
(2)权利要求I中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；
(3)权利要求I中所述核酸适体改造成的肽核酸；(4)权利要求I中所述核酸适体改造成的锁核酸。以上所述的一种糖化血红蛋白核酸适体衍生物，其特征在于，所述的核酸适体或者其衍生物用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒中。本发明的实质性特点和显著进步是(I)所筛选到的核酸适体分子量小，无毒性，有利于分子探针的设计，易于合成与标记；(2)核酸适体只特异的识别糖化血红蛋白，不结合非糖化血红蛋白和其它糖化蛋白质分子，结合糖化血红蛋白的能力是结合非糖化血红蛋白的能力的2(T80倍，可以成为鉴别糖化血红蛋白的试剂，提高检测方法的特异性和灵敏度，简化检测方法，降低成本。



图I.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHbl与糖化血红蛋白的结合能力曲线。图I中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为OD相对值.代表核酸适体GHbl与糖化血红蛋白的结合曲线，▲代表核酸适体GHbl与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。图2.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb2与糖化血红蛋白的结合能力曲线。图I中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为OD相对值，.代表核酸适体GHb2与糖化血红蛋白的结合曲线，_ 代表核酸适体GHb2与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。图3.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb3与糖化血红蛋白的结合能力曲线。图I中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为OD相对值，.代表核酸适体GHb3与糖化血红蛋白的结合曲线，,代表核酸适体GHb3与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。图4.酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHb4与糖化血红蛋白的结合能力曲线。图I中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为OD相对值，.代表核酸适体GHb4与糖化血红蛋白的结合曲线，代表核酸适体GHb4与非糖化血红蛋白Hb的结合曲线。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径中得到。实施例I糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHbl的制备
(1)构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为IXlO5的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~4(i-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N25~4(i为25 40个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTAITCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区；
(2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将0.25ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化血红蛋白在偶联缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl, ImM DTT, pH 5. 5)中混合，加入IOOul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混20小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物。(3)初次筛选靶物质-核酸复合物将2nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0. 02% Tween 20，
I mM DIT)，进行加热处理，90 ° C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育30min，用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行 分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；PCR 扩增工艺条件为94°C 预变性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,扩增 16个循环，最终延伸反应为72° C IOmin,引物I :5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素标记。(5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过15轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID勵:1，命名为61*1。本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍生物将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适体改造成的锁核酸。实施例2糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb2的制备
(1)构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为3X105的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3tr45-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N3tr45为3(T45个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTAITCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区；
(2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将I.Oml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化血红蛋白在偶联缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl, ImM DTT, pH 5. 5)中混合，加入120ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混25小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物。(3)初次筛选靶物质-核酸复合物将5nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.6，2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaC12, 0. 02% Tween 20，I mM DIT)，进行加热处理，90 ° C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育40min，用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；PCR 扩增工艺条件为94°C 预变性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,扩增 12 个循环，最终延伸反应为72° C IOmin,引物I :5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素标记。(5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过10轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:2，命名为GHb2。本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍生物将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适体改造成的锁核酸。实施例3糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb3的制备
(1)构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为IXlO6的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N35~6(i-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N35~6(i为35 60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTAITCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区；
(2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将0.5ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化血红蛋白在偶联缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl, ImM DTT, pH 5. 5)中混合，加入160ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混28小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物。(3)初次筛选靶物质-核酸复合物将3nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0. 02% Tween 20，
I mM DIT)，进行加热处理，90 ° C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA
文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育20min，用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；PCR 扩增工艺条件为94°C 预变性 5 min，94°C 30s, 47° C lmin, 72° C lmin,扩增 18个循环，最终延伸反应为72° C IOmin,引物I :5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素标记。(5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸 库经过20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:3，命名为GHb3。本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍生物将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适体改造成的锁核酸。实施例4糖化血红蛋白特异结合的核酸适体GHb4的制备
(1)构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为7X105的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为
5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N3cr5(l-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N3tr5tl为3(T50个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTAITCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区；
(2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将0.75ml带有活化氨基的微磁珠与5mg糖化血红蛋白在偶联缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，0. 15M NaCl, ImM DTT, pH 5. 5)中混合，加入200ul偶联剂溶液(含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25° C反应条件下轻混30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物。(3)初次筛选靶物质-核酸复合物将4nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6, 2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2, 0. 02% Tween 20，
I mM DIT)，进行加热处理，90 ° C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min，单链DNA文库于没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37°C温育15min，用洗脱缓冲液(20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mMNaCl, 10 mM EDTA)洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；PCR 扩增工艺条件为94°C 预变性 5 min，94°C 30s,47°C lmin, 72°C lmin,扩增 20个循环，最终延伸反应为72° C IOmin,引物I :5，-ATACCAGCTTATTCAATT-3，，引物2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’，引物 2 的 5’ 端生物素标记。(5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过25轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQ ID N0:4，命名为GHb4。 本实施例的上述核酸适体可衍生出以下可用于检测糖化血红蛋白的核酸适体衍生物将本实施例的核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；本实施例的核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；本实施例的核酸适体改造成的肽核酸；本实施例的核酸适体改造成的锁核酸。实施例5酶联核酸适体吸附测定法检测核酸适体GHbl、GHb2、GHb3、GHb4与糖化血红蛋白的结合能力
I)体外合成带有5’端生物素标记的糖化血红蛋白核酸适体。2)在96孔ELISA板上加入带有0. lmg/ml糖化血红蛋白和血红蛋白对照的包被液(Na2C03 15mM,NaHC03 35mM,NaCl 0. 2M)，每孔 100 y L，设定 PBS 孔为调零孔，4°C孵育过夜。3)用磷酸洗脱液洗涤ELISA板，然后封闭液包被96孔ELISA板，每孔100 u L，37°C封闭I小时后用洗脱液(PBS pH 7. 4，0. 05% Tween)洗涤。4)将生物素标记的核酸适体用磷酸缓冲液进行梯度稀释，浓度分别为0 nml/L，5nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, lOOnml/L, 200 nml/L,将 IOOy L 稀释的核酸适体非别接入包被有糖化血红蛋白和血红蛋白的96孔ELISA板中，25°C孵育30min。5)用洗脱液洗脱ELISA板后，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素用PBS按I :1000稀释后每孔加入IOOii L，37°C孵育30min。6)用洗脱液洗涤ELISA板，然后每孔加入辣根过氧化物酶显色底物TMB(3，3’，5，5’ -tetramethybenzidine) 80iiLM&2min，终止反应后在 OD 值为 450 nm 波长下检测吸光度。7)使用Sigma plot软件作图，计算出所筛选到的核酸适体与糖化血红蛋白相互作用的解离常数(kd)。检测到的核酸适体6册1、61*2、61*3、61*4与糖化血红蛋白的结合能力如图f 4所
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序列表
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〈120〉基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒及其检测方法 〈130〉 201权利要求
1.一种糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列包括有SEQid noTseq id no:4中的任意一条dna片段序列，其序列为SEQ ID NO: I gggaggcatg tgtgctaagg cgtagcaggg ttggaaccc ；SEQ ID NO:2 gggaggcatg tgatttaagg cgcggcagat gttggaaccc ；SEQ ID NO:3 gggaggcatg agacctatgg cgttgcattg gttggaaccc ；SEQ ID NO:4 :gggaggcatg ggaaacaatg cgccgcagag ttggaaccc0
2.一种制备权利要求I任一所述糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于，包括以下步骤 (O构建随机序列寡核苷酸库人工合成单链DNA序列，构建库容量为IO5IO6的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为5，-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N25~6(i-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3， 所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6(i和两端固定序列，所述中间随机序列N25~6(i为25 60个碱基的随机序列，所述两端固定序列为5’ -GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA,所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区； (2)制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物将有活化氨基的微磁珠与糖化血红蛋白按照O.05、. 2ml: Img的比例在偶联缓冲液中混合，再加入10(T200ul偶联剂溶液，25° C反应条件下轻混2(Γ30小时，使糖化血红蛋白C末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到糖化血红蛋白-微磁珠复合物； (3)初次筛选靶物质-核酸复合物将2 5nmol单链DNA随机序列寡核苷酸库溶于结合缓冲液，进行加热处理，单链DNA文库与没有结合糖化血红蛋白的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)糖化血红蛋白-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37° C温育15 40min，用洗脱缓冲液洗涤糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与糖化血红蛋白结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，糖化血红蛋白-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中92° C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液； (4)制备次级单链DNA寡核苷酸库将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选； (5)筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过12 20轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与糖化血红蛋白结合的特异性和亲和力。
3.根据权利要求2所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体的方法，其特征在于所述的PCR扩增用到的PCR引物序列为引物 I :5’ -ATACCAGCTTATTCAATT-3’引物 2 :5’ -Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’ 所述的PCR扩增引物2的5’端含生物素标记； 所述PCR扩增工艺条件为94°C预变性5 min，94°C 30s,47°C lmin，72°C lmin,扩增10 25个循环，最终延伸反应为72°C IOmin0
4.根据权利要求2所述的一种制备糖化血红蛋白核酸适体的方法，所述的偶联缓冲液为含20mM磷酸钾盐缓冲液，O. 15M NaCl, ImM DTT, pH 5. 5 ;所述偶联剂溶液为含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述结合缓冲液为含100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7. 6，2 mM MgCl2, 5mM KCl, I mM CaCl2,0. 02% Tween 20, I mM DTT;所述热处理为90 °C加热lOmin，置于冰上lOmin，然后温度放置5min ;所述洗脱缓冲液为含20 mM Tris-HCl pH7. 6，200 mM NaCl，10 mM EDTA。
5.根据权利要求I中任一所述的糖化血红蛋白核酸适体或者权利要求2 4所述方法制备得到的糖化血红蛋白核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒。
6.一种权利要求I中任一所述糖化血红蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种 (1)将权利要求I中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2)权利要求I中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)权利要求I中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4)权利要求I中所述核酸适体改造成的锁核酸。
7.—种权利要求2 4中任一所述制备得到的糖化血红蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种 (1)将权利要求I中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2)权利要求I中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)权利要求I中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4)权利要求I中所述核酸适体改造成的锁核酸。
8.根据权利要求6或7所述的一种糖化血红蛋白核酸适体衍生物，其特征在于，所述的核酸适体或者其衍生物用于识别、检测糖化血红蛋白，或者用于制备检测糖化血红蛋白的试剂盒。
全文摘要
本发明公开具有高特异性和高亲和力的糖化血红蛋白GHb的核酸适体及其制备方法。糖化血红蛋白GHb核酸适体的核苷酸序列包括有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的任意一条序列。糖化血红蛋白GHb的核酸适体制备方法包括构建随机序列寡核苷酸库、制备糖化血红蛋白-微磁珠复合物、初次筛选靶物质-核酸复合物、制备次级单链DNA寡核苷酸库、筛选并鉴定糖化血红蛋白核酸适体。制备获得的核酸适体无毒性，分子量小，易于合成与标记，只特异性识别糖化血红蛋白GHb，对其他同源非糖化血红蛋白Hb不识别结合，可成为检测糖化血红蛋白GHb含量的分子信标。
文档编号G01N33/68GK102965378SQ20121045684
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者李寿东, 胡建红, 李戈强, 李朝志, 李朝君, 谢志峰 申请人:广西安仁欣生物科技有限公司