专利名称：金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片的制作方法
金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片技术领域 本发明涉及一种金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片。金黄色葡萄球菌是 一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。由 金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各国都极为普遍。特别是在北美及欧洲等地区发病 率更高。在上述这些国家中，每年有金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例，仅次于沙门氏菌， 而在细菌性食物中毒病例排到第2 3位，有此而造成的经济损失也相当惨重，在我国由金黄 色葡萄球菌引起的食物中毒病例也时有报导，所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食 品卫生的法定检测项目。我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准GB. 4789-10-84 作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5天左右，既费时又费力，多年来很多食品微生 物实验室都在探索和寻找一些准确性高，并快速的检测方法，传统常规检测诊断方法要经过 细菌分离培养及生化鉴定、血清学试验、肠毒素试验才能确诊。整个检测过程耗时长、 一般 需要5-6天，灵敏度不高，对快速准确诊断，抢救病人带来极大的不便，本发明打破传统常 规分步检测手段，在快速鉴别诊断食物中毒致病菌金黄色葡萄球菌的应用上具有明显的优势。 从而减少由于检测手段落后而造成对人体健康的危害，具有快速、准确、灵敏度高等特点。 较传统方法更具有应用价值，对指导临床诊断和治疗，防止滥用抗菌药物具有重要意义。
背景技术：
本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片。近年 来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金 黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒 占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常 多。金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造 成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食 物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时， 对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶: a.溶血毒素外毒素，分a、 p、 Y、 S四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素可破坏人的白细胞和巨噬细胞；C.血浆凝固酶当金黄色葡萄 球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的 吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶金黄色葡萄球菌 产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素金黄 色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、 B、 C、 D、 E及F五种血 清型。肠毒素可耐受100。 C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。此外，金黄色 葡萄球菌还产生纤维蛋白溶酶、耐热核酸酶、透明质酸酶和脂酶等多种与细菌的扩散和组织 损伤有关的物质。传统常规检测诊断方法是要经过标本采集、分离鉴定、生化鉴定、血清学 试验、肠毒素、血浆凝固酶试验才能确诊。整个检测过程耗时长、传统生化鉴定试验周期长， 操作繁琐， 一般需要5-6天，灵敏度不高，试剂质量无法保证，严重影响了致病菌确认工作、选择性分离培养的培养基上挑选可疑菌落需要经验，存在漏检的可能，对快速准确诊断，抢 救病人带来极大的不便，本发明打破传统常规分步检测手段，将黄金色葡萄球菌培养基及耐 热核酸酶，经一定工艺而成一种引起食物中毒黄金色葡萄球菌的快检纸片，在快速鉴别诊断 食物中毒致病菌金黄色葡萄球菌的应用上具有明显的优势。使检测确诊过程縮短至2-6小时， 鉴定的准确率均在97%以上。检测致病菌时耗时少、灵敏度高，准确性强。包装袋表面印有 黄金色葡萄球菌最大可能数(MPN)检索表，黄金色葡萄球菌的检测结果可直接在包装袋检索， 进行定量分析；确定葡萄球菌耐热核酸酶和血浆凝固酶的存在。含有中和剂，在检测中不易 受干扰因素影响等特点。
发明内容
本发明的要点在于选择合适的组分，并进行合理混配，经一系列现代生物技 术溶解、校正PH、高温灭菌、冷却、加指示剂、浸渍纸片、恒温烘干、无菌包装等工艺而成 一种金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片。本发明选择的快检试剂配方如下(克/每升蒸馏水)胰蛋白胨10.0-12.0;牛肉浸膏 5. 0-5. 5;酵母浸膏1. 0-1. 5;甘氨酸10-14;丙酮酸钠10-12;氯化锂5. 0-5. 5;卵黄亚碲酸 盐增菌剂50-60 mL;琼脂糖0. 08-0. 12;硫代硫酸钠0. 3-0. 5; 4%四唑指示剂2. 3-2. 8 mL; 4%甲苯胺兰2. 3-2. 8 mL;甘露醇10-12;磷酸氢二钾5. 0-5. 5;兔血浆3. 0-4. 0 mL;牛纤维 蛋白原O. 5-0. 6;蒸馏水加至1000 mL，调pH7. 1。耐热去氧核糖核酸为产毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐热，在IO(TC加热30min，不易 丧失活性，在130。C之下，其D值为16.6min，此酶之分子量为16800，等电点PH为9.6，耐 热去氧核糖酸与检测血浆凝固酶相似，是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法，在快检测片上， 耐热DNA酶反应看起来，呈粉红色环带包围着一个红色或兰色的菌落。快检试剂中含有丰富 的营养成分，其中以氯化锂代替亚碲酸钾，使菌落颜色呈黑色，试剂中兔血桨和牛纤维蛋白 原，便于检测凝固酶活力，胰蛋白胨中的胰酶可以抑制全部或部分围绕凝固酶阳性菌落周围 沉淀晕环纤维蛋白的溶解，因此凡存在血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，将在培养基中呈 现有晕环的黑色菌落，即可确认，并作计数。蛋白胨作为主要的组分，该组分为细菌的氮源， 为培养黄金色葡萄球菌提供其生长所需要的营养和能量；磷酸氢二钾作为主要的组分，该组 分为缓冲剂，为培养黄金色葡萄球菌提供其生长所需要一定的氢离子浓度，以保持较稳定的 pH环境；琼脂糖作为主要的组分，该组分为培养基的赋形剂，溶解冷却后可将培养基中的有 效成分凝固并挂载于纸片上；硫代硫酸钠作为主要的组分，该组分为中和剂，其作用是中和 祛除样品残留物的千扰因素；本发明产品的制备方法是1) 切纸将新华中速定性滤纸，切成10X12厘米，叠成5X6厘米大小的双层纸片，经 干烤或高压灭菌(高压后于37'C温箱烘干)后备用；2) 灭菌将耐高温的聚丙塑料薄膜袋，可按实验要求压合成一定规格的袋，100°C15分 灭菌后备用；3)制备培养基将胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸、丙酮酸钠、氯化锂、琼脂、 硫代硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾、牛纤维蛋白原蒸馏水按比例混合加热溶解，冷后调pH7. 1-7. 2， 10(TC15分灭菌，冷至6(TC左右按量加入4%TTC溶液、4%甲苯胺兰、卵黄亚碲 酸盐增菌剂、兔血浆混匀；4) 浸渍纸片用无菌镊子将纸片排放于消毒的内有制备好培养基的大搪瓷盘内，浸泡后 放4(TC左右恒温室或37'C温箱烘干；5) 包装将温箱烘干的浸渍纸片，无菌操作装入消毒的塑料袋内，再装入包装袋表面印 有金黄色葡萄球菌最大可能数(MPN)检索表的外包装袋内，封口后放冰箱保存备用。本发明具有以下优点(1)快检试剂营养丰富、配制简单；(2)临床应用效果满意，解决了床边接种的困难，污染小；(3)检测方法简单、时间短、选择性强、检出率高；(4)接 种样本8-12小时后，即能观察菌落生长情况，稳定性好；(5)对快速准确诊断，抢救病人对 指导临床诊断和治疗，防止滥用抗菌药物具有重要意义具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明按照下表所列数据(克/每升蒸馏水)及其所述步骤进行配置配方一胰蛋白胨10.0-12.0;牛肉浸膏5.0-5.5;酵母浸膏1.0-1.5;甘氨酸10-14;丙酮酸钠 10-12;氯化锂5. 0-5. 5;卵黄亚碲酸盐增菌剂50-60 mL;琼脂糖0. 08-0. 12;硫代硫酸钠 0. 3-0. 5; 4%四唑指示剂2. 3-2. 8 mL; 4%甲苯胺兰2. 3-2. 8 mL;甘露醇10-12;磷酸氢二钾 5.0-5.5;兔血浆3. 0-4. 0 mL;牛纤维蛋白原0. 5-0. 6;蒸馏水加至1000 mL，调pH7. 1。配方二胰蛋白胨11.0-12.0;牛肉浸膏5. 2-5. 5;酵母浸膏1.3-1.5;甘氨酸12-14;丙酮酸钠 11-12;氯化锂5.2-5.5;卵黄亚碲酸盐增菌剂55-60 mL;琼脂糖0.09-0.12;硫代硫酸钠 0. 4-0. 5; 4%四唑指示剂2. 5-2. 8 mL; 4%甲苯胺兰2. 4-2. 8 mL;甘露醇11-12;磷酸氢二钾 5.2-5.5;兔血浆3. 5-4. 0 mL;牛纤维蛋白原0. 5-0. 6;蒸馏水加至1000 mL，调pH7. 1。配方三胰蛋白胨10.0-11.0;牛肉浸膏5.0-5.4;酵母浸膏1.0-1.4;甘氨酸10-13;丙酮酸钠10-11;氯化锂5.0-5.3;卵黄亚碲酸盐增菌剂50-58 mL;琼脂糖0.08-0.11;硫代硫酸钠 0. 3-0. 4; 4%四唑指示剂2. 3-2. 7 niL; 4%甲苯胺兰2. 3-2. 6 mL 权利要求
1、本发明涉及一种金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片，特别是引起的食物中毒金黄色葡萄球菌产肠毒素快检试剂的配方及其制备方法，其特征在于具有如下配方(克/每升蒸馏水)胰蛋白胨10.0-12.0；牛肉浸膏5.0-5.5；酵母浸膏1.0-1.5；甘氨酸10-14；丙酮酸钠10-12；氯化锂5.0-5.5；卵黄亚碲酸盐增菌剂50-60mL；琼脂糖0.08-0.12；硫代硫酸钠0.3-0.5；4％四唑指示剂2.3-2.8mL；4％甲苯胺兰2.3-2.8mL；甘露醇10-12；磷酸氢二钾5.0-5.5；兔血浆3.0-4.0mL；牛纤维蛋白原0.5-0.6；蒸馏水加至1000mL，调pH7.1。
2、 一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片的制备方法，其特征在于 具有如下的步骤1) 切纸将新华中速定性滤纸，切成10X12厘米，叠成5X6厘米大小的双层纸片，经 干烤或高压灭菌(高压后于37'C温箱烘干)后备用；2) 灭菌将耐高温的聚丙塑料薄膜袋，可按实验要求压合成一定规格的袋，100°C15分 灭菌后备用；3) 制备培养基将胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸、丙酮酸钠、氯化锂、琼脂、 硫代硫酸钠、甘露醇、磷酸氢二钾、牛纤维蛋白原蒸馏水按比例混合加热溶解，冷后调 pH7. 1-7. 2， 100°C15分灭菌，冷至60。C左右按量加入4%TTC溶液、4%甲苯胺兰、卵黄亚碲 酸盐增菌剂、兔血浆混匀；4) 浸渍纸片用无菌镊子将纸片排放于消毒的内有制备好培养基的大搪瓷盘内，浸泡后 放40。C左右恒温室或37。C温箱烘干；5) 包装将温箱烘干的浸渍纸片，无菌操作装入消毒的塑料袋内，再装入包装袋表面印 有金黄色葡萄球菌最大可能数(MPN)检索表的外包装袋内，封口后放冰箱保存备用。
全文摘要
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌引起食物中毒快检纸片。特别是由产毒金黄色葡萄球菌的肠毒素引起的食物中毒快检试剂的配方及其制备方法。本发明打破传统常规分步检测手段，利用产耐热去氧核糖酸，血浆凝固酶的特性，使检测确诊过程缩短至8-12小时，鉴定的准确率均在97％以上。该快检纸片具有快速、准确、灵敏度高等特点。较传统方法更具有应用价值，对指导临床诊断和治疗，防止滥用抗菌药物具有重要意义。在快速鉴别诊断食物中毒致病菌产毒金黄色葡萄球菌的应用上具有明显的优势。
文档编号G01N33/52GK101566622SQ200810093450
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月21日 优先权日2008年4月21日
发明者于维森 申请人:于维森