专利名称：微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量筛选和鉴定微生物交叉抗原的方法。
背景技术：
业已证明，采用疫苗接种是预防微生物性疾病的有效途径。由于病原菌较多，对所有病原菌逐一进行接种具有一定困难。这在养殖动物微生物性疾病的预防上，表现得极为突出。因为在实际生产中，如针对养殖动物的所有常见致病菌逐一进行免疫在经济上和操作上是不可能的。因此，研制新型疫苗，以控制有关疾病，特别是养殖动物病害是一项紧迫任务。有学者发现不同细菌间的脂多糖(LPS)和核心抗原具有交叉保护作用。新近，我们发现嗜水气单胞菌和温和气单胞菌之间具有明显的交叉保护作用，并采用蛋白质组学结合免疫保护攻毒技术从嗜水气单胞菌的外膜蛋白质中发现了2个多价疫苗靶位。这些结果说明，细菌间存在交叉中和原性基因。因此，研制基因工程多价疫苗将成为今后疫苗发展的最重要方面。多价疫苗靶位来自具有交叉反应的免疫原，但采用常规方法从全部微生物蛋白质中鉴定所有具有交叉免疫原性的蛋白质十分困难。目前对交叉免疫原的发现往往是从一种偶然观察到的交叉免疫现象中认定，或者是对单个基因的确定，因此，效率不高。蛋白质组学(proteomics)是一种高通量筛选的技术，是功能基因组研究的重要平台，通过由蛋白质组学与免疫印迹(Western blotting)技术相结合而发展起来的免疫蛋白质组学(immunoproteomics)技术，已在患者血清中鉴定了白色链球菌(Candida albicans)和砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的免疫原性蛋白质。这些免疫性抗原可作为监测疾病进展的一种指标，将成为研制新疫苗的对象，有助于摆脱传统疫苗研制的束缚，加快新疫苗的研制。但现有的免疫蛋白质组学技术仅能确定具有免疫原性的蛋白质，而无法确定该蛋白质是否具有交叉免疫原性。

发明内容
本发明旨在提供一种高通量筛选和鉴定微生物交叉抗原的方法，其技术方案是利用双向电泳(2-DE)技术使微生物蛋白质展示在一个平面上，再采用多种抗血清(同种抗血清和异种抗血清)的免疫蛋白质组学技术，确定具有交叉免疫原性的蛋白质，最后采用质谱技术分析和鉴定这些免疫原。
本发明所说的微生物交叉抗原的筛选和鉴定方法的具体步骤如下
1)用双向电泳法分离微生物蛋白质将微生物收集后，按质量比微生物∶超声缓冲液＝1∶2～4加入超声缓冲液，超声波破碎，然后进行双向电泳。
2)双向电泳后，进行免疫转印，分别采用多种抗血清作为第一抗体，酶标抗体为第二抗体，用联苯二胺(DAB)或电化学发光试剂(ECL)显色，当作为第一抗体的抗血清有2种以上为阳性时，该点即为具有交叉免疫原性的蛋白质。
3)再分析这些免疫原的交叉程度和范围，阳性抗血清越多，交叉反应范围越大；阳性显色越强，交叉反应程度越好。
4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白质，按常规质谱样品处理方法进行样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。
所说的微生物为细菌，真菌，病毒。
所说的超声缓冲液可选用Tris-HCl或乙二胺四醋酸盐(EDTA)等。
超声破碎时所采用的输出功率、时间、次数和时间间隔等可按研究对象进行调整，一般可采用每次10～20秒，间隔20～40秒，超声2～4次。
所说的多种抗血清选用抗同种微生物和异种微生物的特异性抗血清。
本发明先利用双向电泳技术使细菌或病毒蛋白质展示在一个平面上，再采用同种和异种血清的Western blotting以确定具有免疫原性的蛋白质，最后利用质谱技术和生物信息分析确定这些交叉免疫原性蛋白质的种类。从而建立了一种采用多种抗血清作为第一抗体的免疫蛋白质组学技术，用于高通量筛选具有交叉免疫原性的蛋白质以作为多价疫苗的候选靶位。根据免疫原的交叉程度和范围，可以确定其作为交叉免疫原的可能性及其作用范围。本发明可迅速确定某种微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白质，从而达到高效、快速、经济、实用的优选交叉免疫原的目的。本发明能够高通量筛选具有交叉原性的疫苗候选位点，为确定作为多价疫苗靶位的基因奠定了扎实基础，提高了制备多价疫苗靶点的效率。由于所有微生物作为抗原免疫动物后，机体均会产生针对其抗原的特异性抗体，这些抗体均可以作为第一抗体进行Western blotting试验，用于筛选交叉免疫原。故本发明的原理与方法具有普遍性，不仅可以用于细菌，而且还可以用于真菌和病毒等微生物交叉抗原的鉴定。
本发明进一步发展了免疫蛋白质组学技术，即建立一种采用多种抗血清作为第一抗体的免疫蛋白质组学技术，从而可以确定与一种以上抗血清发生免疫反应的蛋白质。由于这一设计是基于高通量筛选的蛋白质组学技术，故不仅可以快速确定某种微生物中所具有的交叉免疫原，而且可以得知这些免疫原的交叉范围。根据这些免疫原的交叉程度和范围，可以确定作为多价疫苗靶位的可能性和作用范围。


图1为副溶血弧菌的双向电泳及其自身和异种抗血清的免疫转印结果。其中，A、副溶血弧菌外膜蛋白质的2-DE图谱；B、副溶血弧菌抗血清与副溶血弧菌外膜蛋白质的2-DEWestern-blot结果；C、嗜水气单胞菌抗血清与副溶血弧菌外膜蛋白质的2-DEWestern-blot结果；D、河弧菌抗血清与副溶血弧菌外膜蛋白质的2-DE Western-blot结果；E、溶藻弧菌抗血清与副溶血弧菌外膜的2-DE Western-blot结果。
图2为大肠杆菌的2-DE及其自身和异种抗血清的Western blotting结果。其中，A、大肠杆菌外膜蛋白质的2-DE图谱；B、温和气单胞菌抗血清与大肠杆菌外膜蛋白质的2-DEWestern-blot结果；C、大肠杆菌抗血清与大肠杆菌外膜蛋白质的2-DE Western-blot结果；D、副溶血弧菌抗血清与大肠杆菌外膜蛋白质的2-DE Western-blot结果；E、河弧菌抗血清与大肠杆菌外膜蛋白质的2-DE Western-blot结果。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明的工艺步骤及其突出效果作进一步说明。
实施例11、细菌培养、计数、收集和破碎微生物采用副溶血弧菌，为本室保存菌种。将副溶血弧菌接种于LB培养基，28℃摇床培养18h，作为种子菌。而后以1∶50(菌液∶培养基)(体积比)比例接种于上述同种培养基，28℃摇床培养18h。培养结束后，取2mL菌液进行平板菌落计数。其余培养液于4000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次，称菌体重，再用以1∶3(质量比)的比例加入超声破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA)。用超声细胞破碎仪超声破碎。超声破碎采用输出功率40％，每次10～20秒，间隔20～40秒，超声2～4次。
2、抗病原菌抗血清的制备培养18h的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌，4000rpm离心10min；用0.65％生理盐水悬浮，血球计数板计数，将菌液稀释至1×108个/mL；分别注射小鼠，每只0.1mL，对照组注射生理盐水；每隔1周注射1次；第3周免疫后的第10天处死小鼠取血，静置；4000rpm离心10min，取出血清，分装，-20℃保存。
3、外膜蛋白的提取超声破碎后的副溶血弧菌液，2500g，4℃离心10min，收集上清。上清液100，000g，4℃离心40min。弃上清，沉淀用2％月桂酰基氨酸钠(配于50mmol/LTris-HCl，pH7.4)洗涤，室温放置20min。100,000g，4℃离心40min。沉淀溶于一定体积超声缓冲液中。用Bradford法测定样品中蛋白质浓度。
4、双向电泳法操作步骤第一向预电泳200V 15min，300V 30min，400V 2h，上样(样品为副溶血弧菌液)后电压400V，18h等电聚焦后迅速取出胶条，平衡后移至10％十二烷基磺酸纳一聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上继续电泳，其一端外侧加上标准蛋白质，1％琼脂糖封固。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，扫描，输出照片。参见图1-A，结果显示，比较清楚的蛋白点40余个。
5、Western-blotting操作步骤双向电泳结束后，进行电转，恒压40V电转过夜；电转结束后，用丽春红染色检测电转的效果；洗去丽春红，加封闭液(脱脂奶粉用TTBS配制为5％终浓度)封闭，室温孵育1h；三羟甲基氨基甲烷-盐酸-吐温20缓冲液(TTBS)洗膜，3次，每次5min；分别加入鼠抗副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌抗血清(用封闭液配制)，室温孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；加入辣根过氧标记的山羊抗鼠抗体(用封闭液配制)，室温孵育1h；取出膜，TTBS洗膜3次，每次10min；50mmol/LpH7.4 Tris-HCl洗膜5min；DAB显色；终止反应，扫描，封好膜，保存。Western-blotting分析，结果有8个抗原出现明显的交叉结合反应(见图1-B～E)，分别编号为1～8。
6、质谱样品的制备用一干净解剖刀切下目的蛋白点，从无蛋白质污染区切下一块大致相同的胶块为对照，把胶块切成约1mm3大小，置于0.5ml试管中，接着按以下步骤进行用50％乙腈(ACN)洗胶块以脱掉考马斯亮蓝(2～3次×15min)，弃50％ACN；100％ACN覆盖胶块至白色，弃ACN；接着用0.1mol/L NH4HCO3泡胀，然后反复用ACN/0.1mol/LNH4HCO3洗至无色，真空离心干燥。用10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)/0.1mol/L NH4HCO3于56℃还原45min后，再用新鲜配置的55mmol/L碘乙酰胺/0.1mol/LNH4HCO3烷基化，避光30min。重复上述步骤至脱色干净。真空离心干燥后加入胰酶(Trypsin)(12.5μg/mL)冰上孵育45min，吸掉多余酶液后加入无酶消化液，37℃过夜。依次用5％三氟乙酸(TFA)和50％ACN/2.5％TFA反复抽提1～2次，合并上清液，真空离心干燥。点样前加1～2μL 0.1％TFA溶解样品。
7、肽质量指纹图谱样品的分析和数据库查询质谱样品使用德国BRUKER公司的基质辅助激光解析电离(ReFlexTMIII MALDI-TOF)质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准蛋白分子峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。
通过Mascot(http//www.matrixscience.com.)数据库选择NCBI，种属选择otherproteobacteria.Peptident(http//www.expasy.org/tools/peptident.htmL).数据库选择Swiss-prot，种属选择其它细菌(other bacteria).用ExPASy Molecular Biology Server网站提供的Peptident软件(http//www.expasy.org/tools/peptident.html)进行查询。查询条件肽质量指纹图谱中的肽片段质量控制在800～3500，表观分子量的误差范围为±20％，对表观pI值未作要求，肽片段分子量最大容许误差范围为±0.5Da，每个肽允许有2个不完全裂解位点，物种来源选择细菌，离子选择[M+H]+(数据库中的选项，无中文名)和单一同位素(monoisotopic)，最少匹配肽片段数规定为4，半胱胺酸为碘乙酰胺处理。鉴定结果见表1。
表1副溶血弧菌与自身和异种抗血清的交叉反应蛋白质的MALDI-TOF/MS鉴定

实施例2 除细菌改为大肠杆菌外，其余均与实施例1相同。结果如下1、大肠杆菌细胞外膜的2-DE图谱采用2-DE技术，对大肠杆菌的细胞外膜进行分析，结果发现约40个蛋白点，见图2-A。
2、免疫原性蛋白确定采用Western blotting技术，分别以鼠抗温和气单胞菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、河弧菌抗血清和HRP-兔抗小鼠为第一和第二抗体，按试验程序进行Western blotting分析，结果有6个抗原出现明显的结合反应，分别编号为1～6。大肠杆菌细胞外膜的Western blotting的结果见图2-B～E。
3、MALDI-TOF肽质量指纹谱分析采用生物质谱对6个具有交叉免疫原性的蛋白点进行分析，分别得到各自的肽质量指纹图谱。
根据获得的肽指纹谱数据和分子量范围及其他一些参数，通过Peptident软件查询SWISS-PROT数据库中与之匹配的蛋白质，搜索结果如表2所示。
表2.大肠杆菌与自身和异种抗血清的交叉反应蛋白质的MALDI-TOF/MS鉴定

权利要求
1.微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于其步骤如下1)用双向电泳法分离微生物蛋白质将微生物收集后，按质量比微生物∶超声缓冲液＝1∶2～4加入超声缓冲液，超声波破碎，然后进行双向电泳；2)双向电泳后，进行免疫转印，分别采用多种抗血清作为第一抗体，酶标抗体为第二抗体，用联苯二胺或电化学发光试剂显色，当作为第一抗体的抗血清有2种以上为阳性时，该点即为具有交叉免疫原性的蛋白质；3)再分析这些免疫原的交叉程度和范围，阳性抗血清越多，交叉反应范围越大；阳性显色越强，交叉反应程度越好；4)免疫原的定性取出具有交叉免疫原性的全部蛋白质，按常规质谱样品处理方法进行样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。
2.如权利要求1所述的微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于所说的微生物为细菌，真菌，病毒。
3.如权利要求1所述的微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于所说的超声缓冲液选用Tris-HCl或乙二胺四醋酸盐。
4.如权利要求1所述的微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于超声破碎时每次10～20秒，间隔20～40秒，超声2～4次。
5.如权利要求1所述的微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于所说的多种抗血清选用抗同种微生物和异种微生物的特异性抗血清。
全文摘要
微生物交叉抗原的筛选与鉴定方法，涉及一种高通量筛选和鉴定微生物交叉抗原的方法。用双向电泳法分离微生物蛋白质，再免疫转印，多种抗血清作为第一抗体，酶标抗体为第二抗体，显色后检查其阳性；分析免疫原的交叉程度和范围；免疫原的定性，确定抗原的蛋白质种类。建立了一种采用多种抗血清作为第一抗体的免疫蛋白质组学技术，用于高通量筛选具有交叉免疫原性的蛋白质以作为多价疫苗的候选靶位。根据免疫原的交叉程度和范围，可以确定其作为交叉免疫原的可能性及其作用范围。可迅速确定某种微生物的具有交叉免疫原性的全部蛋白质，高效、快速、经济、实用。其方法具有普遍性，不仅可用于细菌，而且还可用于真菌和病毒等微生物交叉抗原的鉴定。
文档编号G01N33/544GK1563982SQ20041003328
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月14日 优先权日2004年4月14日
发明者彭宣宪, 徐常新, 彭博, 王三英 申请人:厦门大学