专利名称：一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物 性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取 样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反 应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备 等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附 检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数 量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物 质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。克伦特罗(Clenbuterol，CLE)是一种β -肾上腺素受体激动剂，具有松弛支气管 平滑肌的作用，主要用于治疗猪、牛等的支气管哮喘等疾病。当使用量为临床治疗剂量的 5-10倍时，具有促进蛋白质合成和脂肪分解的作用，可显著体高胴体瘦肉率和饲料报酬，且 对猪的饲养效应尤为明显。但是，克伦特罗毒副作用较大，欧盟和中国等国家均禁止其作为 饲料添加剂使用，一些不法分子不顾消费者的健康安全，仍将其利用于畜牧生产中，导致其 在畜禽产品中残留，危害公众健康。动物组织中克伦特罗残留的检测方法主要采用气相色 谱法、液相色谱法、气相色谱_质谱法、液相色谱_联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测克伦特罗的专用化学发光免疫试剂盒。本发明提供的一种检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗 体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；其结
权利要求
一种检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；其结构式如式I所示(式I)。FSA00000216081000011.tif
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括发光 液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；所述试剂盒由克伦特罗特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩复 溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述克伦特罗特异 性抗体为克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗多克隆抗体，所述克伦特罗单克隆抗体是由保藏 号为CGMCC No. 3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的抗体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述标准品溶 液中标准品的浓度为ο μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、10 μ g/L或100 μ g/L，所述标准 品为克伦特罗；所述发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢；发光液B液为鲁米诺溶液；所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐缓冲 液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的磷酸 盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是PH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH值 为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制备得到的a、将每5mg克伦特罗半抗原加入2mL0. 5M的 硫酸水溶液中，得到的溶液称为A液；将每50mg的载体蛋白溶于4mL浓度为100mg/mL的碳 酸钠水溶液中，得到的溶液称为B液；将每30mg亚硝酸钠溶于ImL水得到的溶液称为C液； 在0°C条件下，将C液加入到A液中得到的混合物称为D液；b、将D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式为从开始加入 时计起，6min后开始搅拌混合液，并使混合液的pH保持在9_10之间，滴加完毕后，继续搅拌 反应4h，将得到的产物透析，得到所述包被原；所述克伦特罗半抗原的结构式如式II所示(式 I)。
6.根据权利要求1-5中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述克伦特罗 半抗原为克伦特罗。
7.根据权利要求1-6中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体。
8.—种检测克伦特罗的方法，包括以下步骤1)样品前处理将每2g动物组织勻浆后，加入IOmL 0. IM高氯酸水溶液，振荡混合lOmin，以3000g的 速度离心5min，将2mL上清液的pH值调至11，加入2mL乙酸乙酯与异丙醇混合液混勻， 3000g离心5min，取上层有机相氮气吹干，加入ImL复溶液溶解残留物，获得待测样本溶液； 所述乙酸乙酯与异丙醇混合液是由体积比为8 2的乙酸乙酯与异丙醇混合得到的；所述 动物组织为猪肉或猪肝；或取每IOmL猪尿以3000g离心5min ；取上清液，用复溶液稀释5倍后获得待测样本 溶液；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍 得到的；2)利用权利要求1-7中任一所述的检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒检测步骤1) 中的样本溶液。
9.由保藏号为CGMCCNo. 3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的克伦特 罗单克隆抗体。
10.保藏号为CGMCCNo. 3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE。
全文摘要
本发明公开了一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明所提供的检测克伦特罗的专用化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物。本发明的检测方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号G01N33/577GK101936984SQ20101024418
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者史为民, 吴聪明, 张素霞, 曹兴元, 汤树生, 沈建忠, 王战辉, 程林丽 申请人:中国农业大学