专利名称：传染剂的快速死前检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及痕量的生物和化学产物(例如生物样品中构象改变形式的细胞朊病毒蛋白)的快速死前检测方法。
背景技术：
传染性海绵状脑病(TSE, transmissible spongiform encephalopathy)或朊病毒病(prion disease)是哺乳动物的传染性神经退行性疾病，包括牛海绵状脑病(“疯牛”病)、鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病、绵羊的羊瘙痒症和人的克雅氏病(CJD， Creutzfeldt-Jakob disease)。TSE可通过摄取受感染的组织或输血而在宿主之间传递。 TSE的临床症状包括人的运动协调性丧失和痴呆。其具有数月至数年的潜伏期，但当临床症状出现之后，其进展迅速、不可医治并最终致命。降低TSE风险的尝试已经导致农产品、药物、化妆品、血液和组织捐献以及生物技术产品的生产和贸易的显著改变。TSE与宿主编码的细胞朊病毒蛋白(PrPG)转换为构象改变形式(PrPse)相关。对来自死后动物或人的脑组织的神经病理学检查仍是TSE诊断的“黄金标准”，其通常显示星形细胞增生和海绵状变化，有时伴有含ft·!^的淀粉样蛋白沉积的形成。与其它技术(Wells 和Wilesmith，1995 favier-Widen等，2005)相比，它非常特异但灵敏度较低。尽管通过免疫组织化学技术(使用特异性针对I^rP的抗体来检测在淀粉样蛋白沉积中的积累 (van Keulen等，1995; 1996))可提高显微镜观察的灵敏度，但这些方法不适于快速、常规的分析。另外值得关注的是，由于TSE相关分子在机体组织中的不均勻分布(其在神经系统组织中的浓度总是最高，而在容易获取的体液(如，血液或尿)中的浓度却非常低)，因此 TSE的实验室诊断变得愈发复杂。PrP^具有独特的物理化学和生化特性，例如聚集性、不溶性、蛋白酶消化抗性和富含β片层的二级结构。PrPk的这些经变化特性之一一即对蛋白酶消化的部分抗性，构成了大多数诊断性生化测试的基础。为了区分IM3g和通常用蛋白酶K(PK，proteinase K)预处理样品。由于具有部分消化抗性，而易于被1 消化，因此预处理的结果导致与富含M3g的样品相比，在富含的样品中的干扰消除或降低。然而，同时也提出，死于CJD的患者的脑中大多数M3se是的1 敏感性形式(SPrPse)，这使得在 PrP^浓度非常低的死前测定中用Hi进行处理是不切实际的。开发不需要蛋白水解处理样品的诊断性测定可消除与蛋白水解消化相关的问题以及测定灵敏度低的问题。目前的Pri^e检测方法很耗时，并在疑似患病动物表现出一种或多种疾病症状之后应用死后分析。目前的诊断性方法主要基于对I^Pg和押！^的物理化学差异的检测，它们是迄今为止唯一可靠的TSE标志物。例如，最广泛使用的诊断性测试利用脑样品中I^rPse 的相对蛋白酶抗性并联合使用针对IM3se之1 抗性部分的、基于抗体的检测来区分I^Pg和 PrPsc0尚不能通过使用常规方法(例如，聚合酶链式反应、血清学或细胞培养测定)来检测朊病毒病。尚未鉴定出传染剂特异性核酸，并且受感染的宿主不引发抗体应答。PrPsc与本文中讨论的三种抗体(8E9、11F12和5D6)的抗体-抗原结合事件已在 2008 年 10 月 31 日由 Chang 等人电子发表的 PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, 205 J. NeuroimmunoL , 94,94-100 中表征，其内容通过引用整体并入本文。这些抗体与ft·!^上的不同表位相互作用。单克隆抗体(Mab， Monoclonal antibody) 8E9 结合 PrI^e 的 155 200 位氨基酸区域。Mab 11F12 结合 PrI^c 的93 122位氨基酸区域。Mab 5D6结合ft·产之尚不明确的构象表位。在构象表位的情形中，抗体不结合特异性的连续氨基酸序列，而是结合这样的蛋白质结构区域，所述区域可包括来自氨基酸一级结构的几个不连续区域的氨基酸残基。使用这三种抗体进行捕获酶联免疫吸附测定(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)。只有使用Mab 11F12作为捕获试剂以及使用生物素化的单克隆抗体5D6作为检测物时才可成功地结合并鉴定PrPSe。只有依此方式的抗体组合在感染的仓鼠、感染羊瘙痒病的绵羊或感染CWD的鹿中提供同样的结果。使用加热和/或十二烷基硫酸钠(SDQ变性，检测得到进一步地加强。据认为，这种检测加强是由PrI^e中抗体诱导的表位暴露所致。简言之，一种抗体(Mab 11F12)与的结合以某种方式暴露表位， 这使得第二种抗体(Mab 5D6)更好地结合。尚不知道这是否通过以下方式而发生PrP构象改变、PrPc重折叠成PrKe和/或1 抗性形式或sPrPe形式的改变，使其更容易与另外的抗体相结合。Chang 等人在 2009 年 2 月 27 日电子发表的 Surround Optical Fiber Immunoassay(SOFIA) :An Ultra-Sensitive Assay for Prion Protein Detection,159 Journal of Virological Methods，15，15-22 中还公开了包绕光纤免疫测定(SOFIA, surround optical fiber immunoassiiy) 。 SOFIA Mab Sf 1 帛白勺 |S| 胃个生 g 1 绕光学检测技术的灵敏度相结合。为检测极低的信号水平，使用低噪的光电二极管 (photo-voltaic diode)作为系统的检测器。SOFIA使用激光照射容纳样品的微毛细管。随后，从所述样品收集的光通过光纤被导向传递光学器件。之后，对所述光进行光学过滤以用于检测，所述检测为测量电流并通过数字信号处理锁定放大器针对噪声而进行放大。结果利用计算机显示，并储存于设计用于数据采集的计算机软件中。罗丹明红(Rhodamine Red)可被SOFIA检测的浓度达到0. 1阿克(ag)。因此， SOFIA显示，来自未用1 处理的仓鼠脑的ft·产的检出限约为10ag，并且推断，来自绵羊和鹿之脑物质的PrKe的检出限约为1飞克(femtogram)。然而，假定抗体反应性相同的话，Western印迹显示，在克当量基础上，仓鼠脑比绵羊和鹿之脑物质中的PrKe高出至少10 100倍，即表明在后两个物种中检出的蛋白质可以为10 IOOag的范围或更多。已报道蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA，protein misfolding cyclic amplification)的实验室技术支持向PrKe的特异性重复性转换，其导致小量的扩增。尽管已在唾液、血液、尿和粪便中检测到CWD传染剂，但是从上述物质中直接免疫检测尚未成功(Haley等，2009a，b)。另外，针对上述某些物质中CWD传染剂的成功检测还需要对连续PMCA (sPMCA，serial PMCA)的产物进行生物测定(Mathiason等，2006，2009 ； Haley等，2009a，b ；Tamguney等，2009)。为了利于用外周组织(尤其是血液)对TSE进行临床前检测，可通过PMCA (Saborio等，2001)扩增样品中的靶标I^rPse。已报道，PMCA提高了对来自实验性羊瘙痒病感染的啮齿动物(Saborio等，2001 ；Deleault等，2003 ；Bieschke 等，2004)、分别天然感染牛海绵状脑病和羊瘙痒病的牛和绵羊(Soto等，2005)以及最近地来自患有克雅氏病的人(Jones等，2007)和患有慢性消耗性疾病的鹿(Kurt等，2007)的脑中ft·产检测的灵敏度。另外，已报道PMCA在绵羊和仓鼠(均处于疾病的终末期)的血液中和在症状发生前的动物中(Castilla 等，2005a，b ；Saa 等，2006 ；Murayama 等，2007 ；Thorne 和 iTerry, 2008)以及在尿和脑脊液中(Atarashi 等，2007，2008 ；Murayama 等，2007)检测出
使得该技术成为有用的诊断工具。然而，到目前为止，由于需要多轮循环从而通过免疫印迹法看到终产物，因此PMCA亦受到了阻碍。事实上，进行多轮PMCA可导致假阳性结果。经过192个循环，对照血液样品显示出从I^Pg向Pri^e的自发转换，因此，这在某种程度上使得该技术不足以用于诊断目的。PMCA具有巨大的潜力，但受到多种根本上的和技术上的困难(包括实现最佳灵敏度所需的时间长度(约3周))的阻碍。当前的学说为PrP&与传染性直接相关，其在脑中的积累导致神经病变和临床疾病。还假设ft"产积累之速率和方式以及由此的神经病变形成之速率决定了疾病的潜伏期 O^rusiner等，1990 ；Carlson等，1994)。然而还显示，与预期不同的是，在无症状小鼠的CNS 中可存在高水平的积累和传染性(Bueler等，1994)。对天然和实验感染的绵羊的另一些研究(Madec等，2004 ；Bulgin等，2006)也已表明PrI^e水平、IHC染色拓扑学、组织学病变和临床疾病的程度之间不一致。为了提高食品安全性，使用死前、临床前测试(即在症状出现前进行测试)针对所有动物筛查朊病毒病是非常有益的。然而，在症状出现前的宿主中，PrPk水平非常低。此外，PrP^在机体组织中一般不均勻分布，其在神经系统组织中的浓度总是最高，而在容易获取的体液(如，血液和尿)中的浓度却非常低。因此，需要这样的测试来检测极少量的ft~P， 以及区分IM3g和PrPsc。确保能够进行早期诊断对于真正具有价值的治疗性介入来说是关键性的。对于要进入人类食物链的动物以及血液和组织捐献者来说，可在出现任何临床症状之前可对朊病毒传染剂进行检测是必需的。因此，针对朊病毒的灵敏度更高的检测方法有持续的需求。发明概述PrPc的构象改变形式是PrPse。一些人认为I^rPse是TSE中的传染剂(朊病毒传染剂)，而另一些人则不这么认为。PrPk可以是疾病过程的神经病变产物、传染剂的组分、传染剂本身等。不管它在疾病状态中的实际功能是什么，但明确的是ft·!^与疾病进程特异性地相关，并且对其的检出指示了引起朊病毒病之传染剂的感染。
本发明提供了通过在生物样品中检测来诊断朊病毒病的方法等。所述生物样品可以是脑组织、神经组织、血液、尿、淋巴液、脑脊液或其组合。不存在表明未感染多达本方法检出限的传染剂。检测到ft·!^的存在表明感染了与朊病毒病相关的传染剂。 可在疾病进展的症状出现前阶段和有症状阶段检测朊病毒传染剂的感染。这些及其它改进已通过使用SOFIA(开发用于检测的基于激光的免疫测定 (Chang等，2009))来实现。SOFIA的灵敏度和特异性(Chang等，2009)使得不需要进行Hi 消化以区分正常和异常的I^rP同工型。此外，检测血浆中的已通过有限次PMCA然后 SOFIA而解决了。由于SOFIA的灵敏性，可减少PMCA的循环数，从而降低了 Pri^e自发形成和检出假阳性样品的机会。本发明满足了前述的在症状出现前和有症状的TSE感染动物(包括人)中进行灵敏度提高的朊病毒病检测的需要，其通过提供使用高灵敏度仪器(与先前所述的方法相比，该仪器需要更少的样品制备物)连同新近开发的针对PrP之Mab的分析方法来实现。本发明方法提供的灵敏度水平足以在脑组织中检出PrPSc;。当与有限次sPMCA联用时，本发明方法提供的灵敏度水平足以在死前采集的血浆、组织和其它流体中检出PrPSe。 对于脑物质来说，样品采集和分析之间的时间可少于M小时。本方法将用于抗原捕获和浓缩之Mab的特异性与包绕光纤检测技术的灵敏度相结合。与先前所述的在脑勻浆物中检测PrPk的方法不同的是，当用于研究脑勻浆物时，这些技术不使用种子聚合(seeded polymerization)、扩增或酶消化(例如，通过蛋白酶K(或“PK”))。这是很重要的，因为先前的报道已表明具有不同Hi敏感性的异构体的存在降低了该测定的可靠性。该测定的灵敏性使其适于作为用于在生物流体中快速检测朊病毒的平台。除了朊病毒病之外，本发明方法可提供针对广谱的感染和疾病的快速高通量测试方法。尽管已发现将约40个循环的sPMCA与免疫沉淀联用不足以通过ELISA或Western 印迹检测血浆中的PrPse，但是通过SOFIA方法却很容易测量PrPSe。根据本发明，用于本发明测定平台必需的有限数目的循环基本上消除了获得PMCA相关之假阳性结果(例如先前报道的那些(Thorne和Terry，2008))的可能性。以下代表了本发明的一些非限制性实施方案。根据第一个实施方案，公开了用于在怀疑具有I^rPse的生物样品中检测是否存在PrP^的方法，其包括如下步骤通过将I^rPse 从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的；用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的I^rPse ；以及利用分析仪器来检测经标记的PrPSe。根据本发明的第二个实施方案，公开了用于在怀疑具有的生物样品中检测是否存在PrP^的方法，其包括如下步骤通过将PrP^从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的IM3se ；用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的IM3se ；以及利用分析仪器来检测经标记的PrPSe。在该实施方案中，所述IM3se是未经消化的。根据本发明的第三个实施方案，公开了用于在怀疑具有的生物样品中检测是否存在PrP^的方法，其包括如下步骤通过将PrP^从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的IM3se ；用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的PrPk ；以及利用分析仪器来检测经标记的PrPSe。浓缩Pri^e与分析经标记PrKe之间的持续时间优选为约48小时或更短。
根据本发明的另一个实施方案，公开了用于在怀疑具有ft·!^的生物样品中检测是否存在的方法，其包括如下步骤通过sPMCA扩增样品中的；通过将从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的；用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的I^rPse ；以及利用分析仪器来检测经标记的PrPSe。根据本发明的又一个实施方案，公开了用于在怀疑具有ft·!^的生物样品中检测是否存在的方法，其包括如下步骤通过sPMCA扩增样品中的；通过将从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的；用至少一个分子标记物标记浓缩的ft~PSe，以得到经标记的I^rPse ；以及利用分析仪器来检测经标记的ft~PSe。在该实施方案中，所述生物样品是脑组织、神经组织、血液、尿、淋巴液、脑脊液或其组合。


图1是显示根据本发明一些方法适于分析的仪器的一个实施方案的示意图。图2是显示根据本发明一些方法适于分析之仪器的端部孔口组件(end port assembly)的一个实施方案的侧视示意图。图3是根据本发明一些方法适于PrP^分析之仪器的样品容器的一个实施方案的示意图。图4是从一个侧面看图3之样品容器的示意图。图5是从顶部看图3之样品容器的示意图。图 6 显示使用 Mab 08-1/5D6 (A)、08_1/11F12 (B)和 08_1/8E9(C)对来自感染洸3K 的仓鼠(H)、感染羊瘙痒病的绵羊⑶和感染CWD的鹿⑶的未处理和经1 处理的全脑裂解物的Wfestern印迹分析。图7显示使用比色法在OD4tl5测量抗体结合。捕获ELISA测定使用Mab 11F12作为捕获试剂和经生物素化的5D6作为检测试剂。来自正常的和感染的仓鼠、绵羊和鹿的脑组织勻浆物。使用未经I3K处理和经1 处理的脑裂解物进行测定。图8显示在捕获ELISA之后对未经I3K处理的脑勻浆物进行Wfestern印迹分析。在与图7所述同样的条件下，使用未经生物素化的检测试剂，利用正常绵羊(NS)、感染羊瘙痒病的绵羊(SS)、正常的鹿、感染CWD的鹿(CWD)、正常仓鼠(NH)和感染261的仓鼠Q63K) 进行所述捕获ELISA。使用Mab 8E9进行免疫染色。图9显示使用来自未感染的和感染的仓鼠、绵羊和鹿的脑裂解物在捕获ELISA中互换上述捕获试剂和检测试剂的比较。将使用5D6作为捕获试剂和11F12作为生物素化的检测试剂(5D6/生物素11FU)的研究与使用11F12作为捕获试剂和5D6作为生物素化的检测试剂(11F12/生物素5D6)的研究进行比较。图10显示使用图1的仪器获得的数据，显示罗丹明红的稀释物(■)以及来自小鼠㈩、仓鼠( )、绵羊(▼)和鹿(·)的rPrP (重组的相对信号强度。图11显示使用图1的仪器在来自感染的仓鼠、绵羊和鹿的经1 处理的和未处理的正常的(空心柱)和感染的(实心柱)的脑勻浆物中检测ft~p。X轴的数值表示对初始样品10倍连续稀释的程度。例如，针对仓鼠的“-10”表示样品以1X10,的系数进行稀释。图12显示在Mab 8E9免疫沉淀之后对PrP进行^festern印迹分析。图13显示PrP经Mab 8E9免疫沉淀的捕获ELISA分析结果。
图14显示sPMCA之后对PrP^进行Western印迹。图15显示羊瘙痒病绵羊的第三眼睑淋巴组织的免疫组织化学。在滤泡内可见 PrPsc免疫组化染色(红色)。图16显示在进行和不进行sPMCA时，使用SOFIA检测羊瘙痒病绵羊之血液样品中的 PrPsc0图17显示在进行和不进行sPMCA时，使用SOFIA检测CWD血液样品中的PrPSc。发明详述"PrPsc"应理解为是指IM3g的构象改变形式。I^rPse与疾病过程特异性地相关，对其的检出指示感染了引起朊病毒病的传染剂。TSE应被理解为包括但不限于人类疾病克雅氏病(CJD)、格-施-沙综合征(Gerstmarm- StraUSSler -Scheinker, GSS)、致命性家族性失眠症(FFI,fatal familial insomnia)和库鲁病(kuru)，以及上述疾病在动物中的形式 牛海绵状脑病(BSE，bovine spongiform enc印halopathy，常称为“疯牛病”)、慢性消耗性疾病(CWD，chronic wasting disease)(在麋鹿和鹿中)和羊瘙痒病(在绵羊中)。应理解，“蛋白质的”意指朊病毒可包含蛋白质以及其它生化实体，因而并非是指所述朊病毒仅由蛋白质组成。涉及浓缩时使用的“尽可能地分离出来”应理解为是指通过本文所述的方法，样品中残余的任何样品基质或非PrPk材料不足以被检出或干扰检测。“经标记的I^rPse”应理解为是指已共价或非共价地连接荧光标记物的PrPSe。优选地，单个分子上连接一个荧光标记物。“能够检测”意指与分析不含经标记之Prfe的样品时仪器产生的背景噪声信号相比，仪器产生显著更高的信号。尽管特定样品可包含高于阿摩尔(attomole)的量，但应理解，分析时经标记的Pri^样品要被稀释至约0. 1阿摩尔/毫升，仪器会产生可重复的和统计学显著的信号。“阿摩尔的量”意为0. 1阿摩尔至1飞摩尔。“死前”应理解为是指从中采集样品的生物体死亡之前。“临床前”或“症状出现前”应理解是指从不表现出朊病毒病症状的生物体中采集样品。“种子聚合”应理解为是指引发从PrPG向Pr严的转换，所述I^rPse具有较高的 β-折叠片层(蛋白酶抗性的)含量。“酶促消化”应理解为是指通过有意引入样品中的蛋白酶降解蛋白质，所述蛋白酶在特定氨基酸之间诱导选择性切割。“酶促消化”应理解为不包括自身消化或由样品中天然存在的酶引起的消化。本文使用的“未经消化的”应理解为是指在样品制备或分析期间均不进行Prfe的酶促消化。本发明方法包括例如从期望确定是否已发生感染的动物或人中获得样品的步骤， 所述样品可含有或不含有异常的I^rP同工型(PrPse)。如果样品来自被感染的生物体，则该样品包含I^rPse和样品基质，应理解所述样品基质包括非I^rPse组分(例如细胞、细胞组分、 生物分子、非ft·!^蛋白等)。所述样品可采集自神经组织、血液、尿、淋巴液、脑脊液、其它体液，及其组合，以及包含这些。一经采集，所述至少被半纯化或浓缩，其通过将目的I^rPse与样品基质进行分
9离来实现。可通过本领域技术人员已知的多种方法进行浓缩，所述方法包括但不限于使用分子抗体、免疫沉淀、磁珠、塑性表面上的抗体捕获、应用磷钨酸钠、甲醇的方法，及其组合。 在一个实施方案中，通过使用单克隆抗体进行浓缩。在SOFIA中，使用几种PrP特异性Mab， 所述Mab最近被报道当在捕获ELISA中一起使用时具有协同作用(Chang等，PrP Antibody Binding-induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity,J. of Immunology, 205 卷，1-2 期，94-100 页(2008))。还可通过Kim等，2005(其通过引用并入本文中)所述的技术(其为基于免疫沉淀的捕获测定，使用经染料标记的抗I^rP Mab连同第二种经生物素化的抗Mab和缀合有链霉亲和素的磁珠)进行浓缩。该技术的变化形式包括经染料标记的抗I^rP Mab以及直接与磁珠缀合的第二 I^rP Mab。浓缩的样品可包含至少0. 1阿摩尔的I^rPse，或至少200阿摩尔，或者从约0. 1阿摩尔至约1. 0纳摩尔、或者从约0. 1阿摩尔至约1飞摩尔、或者从约0. 4至约1. 0阿摩尔的 PrPsc0可用一个或多个荧光分子来标记经浓缩样品中的PrPk以得到经标记的PrPSe。可通过本领域技术人员已知的多种方法进行标记，包括但不限于荧光标记、磷光标记、放射性同位素标记、生物素化以及本领域技术人员了解的其它标记方法。在一个实施方案中，所述标记是荧光标记，荧光标记物是罗丹明红。在一个替代性的实施方案中，可通过除荧光以外的方法检测，包括但不限于磷光，红外、可见光和紫外波长的吸收，以及本领域技术人员了解的其它光谱手段。在一个实施方案中，随后用合适的分析仪器分析所浓缩的样品，所述仪器能够灵敏而快速地检测ft~PSe。在一个实施方案中，所述仪器能够检出阿摩尔量的经标记ft~PSe。在一个实施方案中，包括浓缩I^rPse、标记和检测的步骤的时间为48小时或更短，或者M 小时或更短，或者12小时或更短，或者3小时或更短。在一个实施方案中，可针对本发明的目的应用例如2005年12月7日提交的美国专利申请No. 11/634，其通过引用整体并入本文)所述的仪器。图1示意系统100的一个替代性实施方案。在这一实施方案中，四个线性阵列(linear array) 101从样品托 (sample holder) 102延伸至端部孔口(end port) 103，其中安置有伸长的、透明的样品容器 306。将端部孔口的远端104插入端部孔口组件200中。所述线性阵列包含多个具有第一端部和第二端部的光纤，所述多个光纤任选地被保护性的和/或阻隔性的鞘所包绕。光纤的数目可变，在一个实施方案中，光纤的数目为约10至约100个，或者从约25至约75个，或者为约50个。线性阵列的数目可变，且至少为2个。线性阵列的最大数目取决于样品托的尺寸，因为样品托必须足够大以向光纤的第一端部提供足够的空间来包绕并靠近(例如， 约Imm至约Icm)样品容器。在一个实施方案中，线性阵列的数目为2至10个，或者为约4 至6个，或者为4个。在一个实施方案中，所述线性阵列呈平面阵列安置，其中相邻的线性阵列彼此之间等距定位并包绕所述样品托。当线性阵列的数目为4个时，相邻线性阵列彼此之间以呈90度角定位。线性阵列的长度可在很大范围内选择，其取决于光纤的数目和性质。其长度必须足以允许在不损害光纤完整性的前提下捆束来自每个线性阵列的光纤。原则上讲，光纤的长度没有上限，其应使得样品位于远离用于分析样品之诊断设备的位置。光纤的第一端部可以以基本上线性的方式沿着包含样品之容器的长度而安置。光纤的第二端部被捆束在一起形成单个端部孔口。换句话说，来自每个线性阵列之光纤的给定长度之第二端部混杂在一起形成单个束。优选地，来自每个线性阵列之光纤的第二端部在束内随机穿插。多个光纤接收由目的分析物发出的信号，并将该信号从光纤的第一端部传递至包含光纤之第二端部的端部孔口。所述光纤具有高数值孔径(NA)，其对应于 sinee/2，其中θ是所接收的入射光的角度(光接收角)。在这一实施方案中，NA可为约 0. 20至约0. 25，且光接收角为约20度至约45度。所选择的光接收角使得基本上所有的发射信号均可被所述多个光纤拦截。这确保了对来自稀释的分析物(例如，PrPsc)的信号的最佳收集效率。在一个实施方案中，所述光纤包含熔融二氧化硅。光纤的直径可为约50微米至约 400微米。将来自每个线性阵列的光纤进行捆束提供了多种优势。可使用单个检测器，而无需针对每个线性阵列的检测器。对于包含四个线性阵列的系统来说，这使得检测区域的大小变为四个单独检测器的1/4。这因此显著降低了背景噪声，继而提高了信噪比，并因而降低了检出限。在一个实施方案中，检测器的尺寸为约0. 5mmΧ0. 5mm至约ImmX 1mm。本实施方案之系统的检出限为至少0. 1阿摩尔分析物，或者为至少200阿摩尔、或者为约0. 1阿摩尔至约1. 0微摩尔、或者为约0. 1阿摩尔至约1纳摩尔、或者为约0. 4至约1. 0阿摩尔分析物。或者，在本实施方案中，系统的检出限为至少0. 1阿克分析物，或者为至少10阿克的分析物。图2示意本实施方案之端部孔口组件的一个实施方案。将包含成束光纤的单个端部孔口远端104插入到端部孔口组件200的入口 202。通过光纤，信号经端部孔口组件200 传递至出口 207，并随后被传递到传出光纤208，其继而与检测器相连。传出光纤208的直径可为约300微米至约500微米，且优选为约400微米。因此，所述端部孔口组件将单个端部孔口光耦合至检测器。所述端部孔口组件可包含第一透镜203，其用作使入射信号准直。 所述端部孔口组件还可包含第二透镜204，其用作将传出信号会聚成适合传出光纤208的 NA0所述端部孔口组件还可包含至少一个陷波滤波器(notch filter) 205和至少一个带通滤波器(bandpass filter) 206。合适的检测器的非限制实例包括光二极管检测器、光电倍增管 (photo-multiplier)、电荷耦合装置、光子计数仪、光谱仪，及其任何组合。图3示意本实施方案之合适的样品托102的一个实施方案。设置了隔挡物 (spacer) 303，从而为伸长的、透明的容器306提供空间以穿过样品托300。在一个实施方案中，样品托300为毛细管，并可由玻璃、石英或本领域技术人员已知的任何其它合适材料制成。仅作为举例，所述毛细管可容纳100微升液体。设置隔挡物303还提供了使光纤的第一端部包绕并靠近透明容器的狭缝304或空间。隔挡物302被顶端板305和底端板302固定到位，所述顶端板和底端板利用紧固物301 (例如螺钉)连接至隔挡物303。所捕获的发出信号通过光检测器转化成电信号，并传递至分析仪(未显示)，所述分析仪接收电信号并分析样品中是否存在分析物。分析仪的实例是本领域技术人员公知的。所述分析仪可包括使得能够进行电信号之相灵敏度检测的锁定放大器(lock-in amplifier)，或本领域已知的用于分析由本文所述不同类型之光检测器产生的电信号的任何其它方法。
可针对收集来自报告分子的光对开发用于这些测定的仪器进行优化。在基于荧光的测定中，目前使用的染料具有接近或高于90%的量子效率。在一个实施方案中， 所述染料是罗丹明红Xanvitrogen Corp. , Carlsbad CA)。此外，对跨导前置放大器 (transconductance pre-amplifier)和锁定检测器装置进行优化以便于低信号/低噪声检测。首先，选择用于光斩波器(optical chopper)的合适的调制频率，其应当与线频率或环境中其它电来源的噪声不接近。此外，锁定放大器应当采用线滤波(line filtering) 0 在一个实施方案中，调制频率为753Hz，且锁定放大器设置在60Hz和120Hz滤波。基于预期的信号水平来选择跨导前置放大器的灵敏度，并使前置放大器的输入阻抗最大化，并在一个实施方案中设定为InA/V。在一个实施方案中，带通滤波器的频率中心为斩波频率，例如 753Hz ο
实施例1.组织样品的采集^ M Chang, B.等，“PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, “ J. Neuroimmunol. 205 1-2 10,94-100 M (2008) ^ 描述采购并扩增感染263K羊瘙痒病的仓鼠品系。从感染了羊瘙痒病的绵羊和感染了 CWD 的白尾鹿的临床患病期间收集脑，并在-80°C冷冻。类似地，收获来自未感染之动物的脑并冷冻° 按照 D. R. Brown 等，“Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase，" Biochem J. 344卷 1-5页(1999)的描述，将鹿、仓鼠、小鼠和绵羊 PrP的全长编码区克隆进pET-23载体中，从而得到无标签的蛋白质(rfrP)。表达和纯化与 C. E.Jones 等，"Preferential Cu2+ coordination by His96 and His111 induces β -sheet formation in the unstructured amyloidogenic region of the prion protein, " J. Biol. Chem. 279 页，32018-32027 Q004)的操作步骤基本相同。使用在磷酸盐缓冲盐水(PBQ中制备的20%羊瘙痒病绵羊脑勻浆物(来自临床和免疫组织化学阳性动物的7份羊瘙痒病脑的混合物)进行实验性口服感染。所有未感染的动物都被安置在隔离的无羊瘙痒病的设施中。绵羊之羊瘙痒病的临床症状包括轻微的头部震颤发展到全身震颤、摩擦导致的羊毛脱落、啃咬肢端、高度敏感和步态异常。商业公司(Gene Check, Inc.，Greeley, CO)进行了绵羊的基因分型。对于IHC而言，在水中清洗经福尔马林固定的第三眼睑组织15分钟，并在99%甲酸中浸泡1小时。用水清洗3小时后，在Microm STP 120中，所述组织被石蜡包埋，并切成 4微米用于封片。使载玻片干燥至少M小时，脱石蜡并随后使用Ventana (Ventana Medical Systems Inc.，Oro Valley,AZ)的专利试剂(朊病毒增强溶液和抗PrP抗体)和Benchmark LT自动化系统进行免疫染色。对于采血(经IA⑶C批准)而言，束缚动物并用针插入颈静脉。采血(使用柠檬酸钠作为抗凝剂)之后，立即将血液的一半冷冻并运走。4°C下，将剩余一半的所收集全血样品低速离心15分钟。取出血浆，冷冻并利用干冰运送。白尾鹿的饲养和取样方案是经Colorado Division of Wildlife' s (CDOff) IACUC 批准的。使用罐装浓缩牛奶和已有方案(Wild和Miller 1991 ；Wild等1994)用奶瓶饲喂来自几个放养来源的新生白尾鹿的幼鹿。在整个研究中，除了采集样品期间之外，鹿被限制在生物安全围场中。在所有的围场中，提供自由摄取的食物、水和补充剂。在约6月龄时，将约0. 5g同种的、合并的、经感染的脑物质置于舌根来口服接种白尾鹿幼鹿；先前的分析显示这种接种混合物(inoculum pool)是感染性的，并且每克脑组织含有约6 μ g PrPcro (Raymond等2000 ；Wolfe等2007)。所有鹿均由对识别CWD之临床症状富有经验的兽医来评估，并主观地对行为改变、身体状况变差、共济失调、流涎或烦渴进行打分。用于本研究的五只鹿在本源朊病毒蛋白基因第96位密码子处的甘氨酸和丝氨酸是杂合的，在感染后253或343天(dpi，day post infection)的扁桃体活检中有IM3·积累(Wolfe等 2007)，并在891至1774dpi时的尸检中被证实为朊病毒感染。891dpi时，从所述五只接种的白尾鹿中采集血样。取样时，其中一只动物(BC04) 处于临床慢性消耗疾病的终末期，两只(N204和W1004)显示身体状况有些差，而另外两只 (I304、K304)临床上正常。对于取血样来说，用甲苯噻嗪(xylazine)使鹿镇静，对覆盖颈静脉的皮肤进行无菌处理，通过颈静脉穿刺将血液收集进入经柠檬酸钠处理的塑料袋中。冷却血袋，并连夜运走用于处理。2.单克隆抗体的制备使用最初由HiImert和Diringer (1984)报道并由Rubenstein等(1994)改良的方法，从感染的仓鼠脑中分离出由含有第90-231位氨基酸(aa) (PrP90^231)之核心蛋白构成的经Hi处理的ft~PSe。使用盐酸胍溶解该材料，按照先前的描述(Kang等，200 进行提取和甲醇沉淀，并用作抗原。免疫PrP+小鼠，并按照先前描述的ELISA (Kascsak等，1987)监测其免疫应答。其中一只经免疫的小鼠用于制备杂交瘤。此小鼠在融合前4天通过静脉内途径接受磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中抗原的最后一次免疫。将脾细胞与表达降低水平之细胞表面I^rPe的SP2/0骨髓瘤细胞系融合(Kim等，2003)。按照先前的描述(Kascsak等， 1987)通过ELISA筛选杂交瘤，所得到的细胞通过有限稀释被克隆3次。使用一次性生物反应瓶antegra Biosciences, Switzerland)进行大规模Mab生产，使用蛋白G免疫亲和层析(Pierce，Rockford，IL)从培养基中纯化出抗体。利用微量BCA蛋白质测定(Pierce) 来测定蛋白质，并用小鼠Mab分型试剂盒(Pierce)进行分型。使用EZ-Iink生物素化试剂盒(Pierce)对每种Mab进行生物素化。使用溶解的IM3sg作为免疫原和低PrP表达的SP2/0骨髓瘤细胞系制备多种Mab。 选择这些 Mab 中的三种(即 08-l/5D6(5D6)、08_1/11F12(11F12)和 08-1/8E9 (8E9))用于本研究，并分别分型为IgGl、IgG2b和IgG2b。所有这三种Mab均各自与正常的和疾病相关的PrP同工型反应。全脑裂解物的Wfestern印迹(图6)表明，所有这三种Mab都与来自感染^!BK的仓鼠、感染羊瘙痒病的绵羊和感染CWD的鹿的未经蛋白酶处理的脑样品以及经1 处理的反应(图6)。使用未处理的和经1 处理的部分纯化的PrKe制备物也观察到类似的结果 (数据未显示)。这些Mab也对正常的和异常的I^rP同工型以及分离自感染有ME7、139A和 22L的羊瘙痒病小鼠品系的小鼠脑和感染有CJD的人脑的经1 处理的Pri^e以及来自所有受试物种(包括牛)的未感染脑物质的I^rPe有免疫反应性(数据未显示)。通过间接ELISA，所述三种Mab对纯化自^!BK感染的仓鼠脑的经Hi处理的I^rPse 有免疫反应性。反应性程度取决于变性处理的程度。单独使用加热或SDS处理提高免疫反应性，而这两种处理联用得到最高水平的抗体结合和免疫反应性(表1)，大致为两种处理的加和作用，这提示表位暴露是受多种机制影响的。令人感兴趣的是，尽管5D6结合构象表位，但当PrP变性时该Mab的反应性并未损失，相反却得到增强。先前有报道(Tayebi等， 2004)热变性不足以破坏的多聚体结构。另外，通过ELISA，Mab对来自未感染脑的 I^Pg和非变性脑勻浆物中的总正常和异常的PrP同工型)具有同等的免疫反应性。用 SDS和热变性后，免疫反应性同等地增强约2倍。1 处理和变性之后，因为蛋白水解消化而存在较少的外源性脑蛋白结合，PrPsc的免疫反应性额外提高3倍(数据未显示)。为了提高PrP检测的特异性和灵敏度，使用了包括生物素化检测抗体的捕获 ELISA测定。如所预期地，对于每种生物素化的Mab来说，每个抗体分子与5 6个生物素结合。另外，如通过使用部分纯化的经Hi处理的进行间接ELISA所评估地，Mab的生物素化不干扰或降低其免疫反应性(数据未显示)。因此，检测抗体的结合和反应性上的任何差异都不是物理生物素化过程的结果。使用经Hi处理的已用SDS和热变性的检测了多种Mab组合，每种抗体均作为捕获试剂和作为检测试剂来进行评估(表幻。仅有一种抗体组合，即Mab 11F12作为捕获试剂和生物素化5D6作为检测试剂的组合成功地结合并鉴定出ft~PSe。无论是否来自感染的仓鼠、羊瘙痒病绵羊或感染CWD的鹿，结果都是相同的。然后，使用llF12-5D6Mab组合的捕获ELISA测定用于评价其在来自未感染的和感染的仓鼠、绵羊和鹿中的全部的和经Hi处理的脑勻浆物中检测PrP的能力(图7)。与上述的利用纯化的仓鼠脑进行的间接ELISA测定的结果类似，用捕获ELISA测定检测 PrP也取决于表位可用性，并由对脑裂解物的最初处理而确定。与未感染的脑物质相比，来自感染动物的未处理之脑裂解物显示出信号强度的略微(1. 5倍)增加，而单独使用去污剂或热变性导致4至7倍的增加。意料之中地，当联合使用SDS和加热处理时，达到了
检测的最高水平(大于10倍)。另外，SDS的浓度增加超过降低了 Prfe的可检测性， 这很可能是因为抗体-抗原结合的抑制和/或逆转所致。如下文所示地，这种苛刻的变性处理不足以完全破坏PrP的构象。先前有报道称，羊瘙痒病的传染性以及可能地构象的某些方面可在经过SDS、加热和SDS-PAGE处理后的纯化的I^rPse制备物中维持(Brown等， 1990 ；Rubenstein 等，1994)。通过捕获ELISA，可从来自全部三个物种的未经Hi处理的正常脑勻浆物中检出 ft~PG。在所有情况下，信号强度( 0. 25-0. 3)不超过背景( 0. 12-0. 15)的两倍。将该材料从孔中洗脱并用Western印迹进行检测。与上述直接从未经Hi处理的脑勻浆物中检测I^Pg的结果不同的是，所洗脱样品的Western印迹结果仅检出IgG轻链和重链。不可检测是由于结合物质的低水平所导致的。1 消化后，ELISA值降至背景水平，这表明被清除了。通过捕获ELISA测定，可在来自感染的仓鼠、羊瘙痒病和CWD绵羊的经1 处理的脑勻浆物中很容易地检测到I^rPset5令人感兴趣的是，利用未经1 处理的同时含有 PrPc和的脑勻浆物进行的捕获ELISA测定显示出高于所致信号强度(通过未经 Hi处理的正常组织来测定)和所致信号强度(通过经Hi处理的感染组织来测定)之总和的信号强度(图7)。增加的信号强度可能是因为sPrP^m存在和结合所导致。另一种解释是蛋白质(可能是全长与捕获Mab的结合诱导了抗原的空间改变，导致针对第二 Mab的表位更易接近。这一过程被称为“正免疫协同性”。如图7所示，用本研究中使用的给定Mab组合，正免疫协同性的程度是物种依赖性的。与仅从IM3g和组合计算得出的结果相比，来自感染CWD的鹿的与5D6的结合显示了高出58%的最大水平，而羊瘙痒病绵羊的显示了 46%的增加。来自感染的仓鼠的Prfe显示了最低的、却依然显著的40%的增加。图7中的数值是根据每个物种的六份单独样品的三次读数，并表示为平均值士标准偏差。抗体诱导的I^rPse空间重排和/或构象改变可通过显示11F12-5D6所捕获物质具有针对另一 PrP特异性Mab的改变的表位而加以证实。利用未经Hi处理的、经SDS和加热变性的ft·!^进行捕获测定。然后，与生物素化的Mab 8E9、链霉亲和素-碱性磷酸酶和底物一起孵育。没有高于背景的信号表明Mab 8E9的表位不再可获得或不再可接近。然而， 从微量滴定孔中洗脱11F12-5D6所捕获的物质并然后用Mab 8E9进行Wfestern印迹和免疫染色，显示出强的染色，这表明Mab 8E9表位又再次可获得(图8)。可能是SDS-PAGE 样品缓冲液的处理以及在SDS存在下进行电泳改变了 11F12-5D6与的结合，并逆转了抗体诱导的Prfe改变，从而再一次使8E9结合成为可能。尽管利用Western印迹和间接ELISA测定Mab 8E9能够直接结合I^Pg和PrPs%但是在捕获ELISA测定中用8E9替代5D6却导致PrP的不可检出(其表明生物素化的8E9不与抗原结合)。另外，11F12-5D6抗体对的PrPe特异性不仅由于这些特异性Mab的存在所致，也由于结合事件的顺序所导致。当与11F12-生物素化5D6组合(11F12/生物素5D6) 相比时，交换所述抗体的顺序(即，使用5D6作为捕获试剂，使用生物素化的11F12作为检测试剂(5D6/生物素11F12))导致对来自未经1 处理的脑裂解物的最小结合(图 9)。通过比较PrP信号和背景信号的差异获得信噪(S/N)比，所述PrP信号是在使用感染的脑裂解物的捕获测定中获得的，所述背景信号获自来自仓鼠、绵羊和鹿的脑组织的未感染材料(S/N = (S-SO)/(3 σ SO)；其中S =信号，SO =平均背景信号，σ SO =背景信号的标准偏差)。小于1的S/N比值表明Mab的结合非常弱，以致所测量的信号包含显著量的噪声。另一方面，等于1或大于1的S/N表明测量中的噪声并不显著，表明测量结果中的大部分功率是特异性Mab结合的结果。当S/N比值增加时，置信水平指数增加。对于5D6/生物素11F12对来说，仓鼠、绵羊和鹿的S/N比值分别为约0. 6,0. 1和0. 3，表明Mab的结合是非特异性的。然而，对于11F12/生物素5D6组合来说，S/N比值为约19(仓鼠)、28(绵羊) 和42(鹿)。这些比值表明高度显著的特异性Mab结合特性。图9中的值基于对每个物种的六份单独样品的三次读数，所计算的ELISA结果以平均值士标准偏差表示。将感染样品的增加的抗体结合(根据OD4tl5)与未感染的对照相比较。对感染样品的信号功率与对照样品的功率(噪声)计算得到的信噪比(S/N)以对数作图。3.免疫测定为制备10%脑勻浆物，在ImM苯甲磺酰氟(PMSF)存在下(如果要用蛋白酶 K(PK)处理勻浆物，则从裂解缓冲液中省去PMSF)，在10倍体积的冰冷裂解缓冲液(IOmM Tris-HClU50mM NaClU % Igepal CA-630 (Nonidet Ρ-40)、0· 5%脱氧胆酸盐、5mM EDTA, PH 8.0)中勻浆脑组织。以1，OOOXg离心10分钟后，分装上清液并储存于-80°C。用于捕获测定的方案和试剂描述于Chang，B.等，“PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, " J. Neuroimmunol.205卷，1-2期，94-100页(2008)中，其内容通过引用整体并入本文。如下文所述，本文中使用的产生鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞系已如所示进行了保藏。对于捕获 ELISA测定来说，在室温下，用亲和纯化的11F12捕获单克隆抗体(Mab) (5 μ g/ml)包被96孔板2 3小时。在4°C下，用PBS中的3%牛血清白蛋白(Sigma)过夜封闭所述经包被的孔。用PBST将所述孔清洗三次。抗原是添加了终浓度为的PMSF的未经1 处理或经 PK处理(100 μ g/ml PK, 50°C，30分钟)的脑裂解物。用1 % SDS (终浓度)处理所有样品， 100°C下加热10分钟，并以16，OOOXg离心5分钟。以10倍系列稀释上清液，每孔中加入 100 μ 1。在37°C下孵育板1小时。将孔用PBST清洗三次，加入100 μ 1生物素化的5D6检测剂Mab (5 μ g/ml)。60分钟后，用PBST洗所述孔，并于37°C下加入100 μ 1链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(1 5，000) 60分钟。向每孔中添加PNPP (磷酸4-硝基苯二钠盐六水合物)(Sigma)底物溶液(100 μ 1),60 分钟后，在 OD405 用 ELISA 读数仪(Bio-Tek，Vermont, NY)测量产物。对于激光分析来说，用生物素化的Mab 5D6孵育，然后添加链霉亲和素缀合的罗丹明红(1 1000)。37°C下孵育60分钟后，用PBST清洗孔，并在100°C下用100 μ 1 的IN NaOH处理10分钟，并随后在室温下振摇20分钟。所述材料被置于ΙΟΟμΙ Microcap (Drummond Scientific,Broomal 1,PA)微毛细管中，所述微毛细管随后被插入特别设计的管状样品托中用于激光激发和发射检测。计算相对于初始的脑组织稀释度。如图例中所述，每个值(数据点)表示来自多个测定的平均值士标准偏差(SD)。Western 印迹如上所述，在裂解缓冲液中制备10%的脑勻浆物。低速(2000Xg，10分钟)离心样品。将10微升上清液与最终的IX样品缓冲液混合，在100°C下加入4分钟，并用12%丙烯酰胺凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移到硝酸纤维素膜上，并以NBT 和BCIP为底物使用链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(Kascsak等，1986)或者按照先前所述 (LaFauci等，2006)利用super signal west femto最高灵敏度底物(Pierce)通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(PierCeTM)进行免疫染色。对于SDS-PAGE之前经1 消化的样品，50°C下，将低速离心得到的40 μ 1上清液与100 μ g/ml PK (终浓度)孵育30分钟， 然后添加1 % PMSF, 1 X SDS-PAGE样品缓冲液，并在100°C下加热5分钟。5.免疫沉淀用PBS 将 MagnaBind 蛋白 G 珠(Pierce)清洗 3 次，用 50 μ 1 PBS 重悬，向 200 μ 1 的10%脑勻浆物中添加总体积1. 2ml PBS中的50 μ g Mab 8E9 (10mg/ml)。室温下混合1小时后，利用磁场分离磁珠，用含有0. 2%吐温20的PBS(PBST)洗3次，并随后重悬于600 μ 1 PBS中。在100°C下加热10分钟并以16，OOOXg微量离心3分钟后，将上清液用于捕获 ELISA。对于血液样品来说，将111叫11动丨11(1蛋白6珠重悬于10(^1 PBS中，然后添加总体积为5ml的PBS中的100 μ g Mab 8E9，并在室温下混合1小时。用PBST清洗所述珠，用含有 500 μ 1血浆的5ml PBS重悬，并再孵育1小时。如上针对脑的描述来分离所述珠，用PBST 清洗，加热，并通过捕获ELISA分析经微量离心的上清液。6.蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA，protein misfolding cyclic amplification)作为用于脑和血液sPMCA的来源，对来自正常仓鼠、绵羊和鹿的10% (重量/ 体积)脑勻浆物[在含有150mM NaClU. 0% Triton X_100、4mM EDTA和完全蛋白酶抑制剂混合物(complete protease inhibitor cocktail) (Calbiochem)的 PBS 中制备]进行离心(1，500 X g，30秒)，并迅速冷冻上清液。将来自感染的仓鼠、羊瘙痒病绵羊和CWD 鹿的脑勻浆物的500 μ 1等份的10倍系列稀释物(10_8至10_")与来自对应物种的100 μ 1 的10%正常脑上清液混合，并振摇孵育(37°C下1小时)。然后对各样品进行超声08W输出功率)，然后添加额外的100 μ 1的10%正常脑勻浆物，并孵育(37°C下振摇孵育1小时)。 这被定义为一个扩增循环。每轮5个循环之后，通过从初始反应管中移出500 μ 1的PMCA 反应混合物至新的管并添加100 μ 1的10%正常的脑勻浆物来继续进行PMCA。与上述针对脑的PMCA类似，利用500 μ 1等份的未稀释之羊瘙痒病绵羊或CWD鹿的血浆进行PMCA。 PMCA之后，以2，000 Xg离心样品10分钟。对于脑样品来说，用蛋白酶K(PK) (100 μ g/ml) 消化200 μ 1上清液(500C, 30分钟)，然后添加1 %蛋白酶抑制剂混合物和1 % SDS0 100°C 下加热样品10分钟，用Western印迹法(Chang等2009)分析10 μ 1等分试样。对于血液来说，在PMCA之后，不处理或者用Hi处理500 μ 1经扩增的血液样品，然后在Wfestern印迹或SOFIA分析之前，用Mab 8E9进行免疫沉淀。对于全部PMCA样品来说，相对于初始的未稀释脑或血液样品来表示稀释度。对未进行PMCA的血液样品进行免疫沉淀，并如上所述进行类似处理(但不进行超声处理和37 °C孵育循环)。7. SOFIA用捕获Mab 11F12 (100 μ 1，5 μ g/孔)在室温下包被96孔高结合板(Costar，NY) 3 小时，并在4°C用TBS中的酪蛋白过夜封闭。将蛋白G磁珠和Mab 8E9混合60分钟，用PBST 清洗3次，沉淀被重悬于800 μ IPBS中。离心血液样品(800 X g，5分钟)，并将800 μ 1上清液与SDS (1 %终浓度)混合，在100°C下加热10分钟，与G珠-Mab 8E9混合60分钟，并用 PBST清洗3次。清洗过的最终沉淀用800 μ 1 PBS重悬，并加热10分钟。以16，OOOXg离心 5分钟后，向每孔添加100 μ 1上清液。室温下孵育(1小时)并用PBST清洗，加入100 μ 1生物素化的Mab 5D6 O μ g/孔)1小时，然后进行清洗并与100 μ 1链霉亲和素-罗丹明红-X 缀合物(Invitrogen) 一起孵育1小时。用PBST清洗4次后，添加100 μ 1的IN NaOH,并加热该板(100°C，10分钟)，室温下混合30分钟，并用等摩尔量的HCl中和。对90 μ 1等分试样进行分析。8.仪器所述装置是围绕常用的一次性100微升微毛细管(Drummond Scientific Co., Broomal 1,PA)而设计的样品托。通过沿毛细管轴向会聚来自固态倍频Nd:YAG激光器(Beam of Light Tech. , Clackamas, OR)的暂短调制光来激发样品，功率一般为30mW，连续波的波长为532nm，该波长与罗丹明的吸收峰很好地匹配。光纤组件被设计成包含4个线性阵列， 其跨越毛细管长度的约1/3，且彼此之间围绕毛细管的周长呈90度定位。由于光纤的大数值孔径(0.22，或接受角为 23度)，光纤的这种定位导致对样品视野的完全覆盖。4个线性阵列收集的光被捆绑在一起(即，捆束或合并)，并会聚进入传递光学系统，所述传递光学系统中安置了全息陷波滤波器(holographic notch filter) (Kaiser Optical Systems Inc. Ann Arbor,MI)和带通滤波器(Omega Optical，he. Brattleboro，VT)。这些分别用于消除来自激发光源的散射光和对报告染料的荧光检测进行频带限制(band-limit)。光随后被会聚回单个、多模式的400微米光纤(Thorlabs ，Inc. Newton, NJ)并偶联至单个低噪声光电二极管检测器(United Detector Technology，Hawthorne，CA)(其被安置于直接位于检测电子器件的前置放大器上的BNC连接器上)。信号检测采用相灵敏的或“锁定”的检测方案。用光学斩波器(Thorlabs he.)调制激发源，以产生针对检测系统的参考频率。所述二极管检测器被安置在跨导前置放大器(Manford Research Systems, Inc. Sunnyvale, CA)的输入端，以降低总的线阻抗并消除与这些低水平信号相匹配的阻抗的难题。随后用锁定放大器(Stanford Research Systems)检测所述信号，通过 LabView (National Instruments Inc.，Austin, TX)进行数据采集。该程序由电子条形图表组成，其支持锁定放大器的电压读数，所述读数周期性地将测量值的历史数据呈现给操作者，并以ASCII文件存储带有时间印记的数值。应当选定锁定放大器的时间常数，以提供十分之几赫兹的频带宽。为进行这些测量，选定了 3秒的时间常数。在获得稳定读数的过程中(在该情形下为3至30秒)，所述锁定需要多个时间常数。加载新样品之后，在信号稳定后(20至30秒) 记录测量值。对激发源的调制和锁定检测器的参考频率为753Hz，选择该频率用以使环境噪声最小化。除了以线频率过滤，锁定放大器还使用两倍线频率过滤，以调制频率带通过滤前置放大器信号。对于所述样品来说，选定InA/V的前置放大器灵敏度，得到IM Ohm的输入阻抗。在进行测量时，保留一系列启动操作，包括所有电子器件(激光器、锁定放大器、前置放大器)预热15分钟，目测检查暗信号水平以确保系统正确地电接地，测量激光器的功率以检查稳定性和输出水平，目测检查激光器排列。使用装有经蒸馏的去离子水的毛细管来检查基线信号的对照测量值。通过测量浓度递减的罗丹明红的荧光信号发射来测试仪器的灵敏度极限。浓度为 0.01阿克(ag)[20阿摩尔(am)]时，罗丹明红是可检测的(图10)。通过使用来自鹿、仓鼠、小鼠和绵羊的全长重组ft~p(rprp)进行测定来进行特异性和灵敏度的测定。无论测试什么物种，可检测的极限> IOag rPrP0再看图10，数据是利用图1中的仪器获取的，其中向100 μ 1微毛细管中加入罗丹明红(■)的水稀释物，并记录包绕光纤荧光信号发射。基于只有水时的荧光信号发射来计算相对信号强度。在来自小鼠(*)、仓鼠( )、绵羊(▼) 和鹿(·)的情形中，用1 % PrP-7-脑勻浆物稀释rfrP，并进行SOFIA。基于单独使用rPrP 稀释物(1% PrP+脑勻浆物)进行的类似测定来计算相对荧光信号强度。针对每个rPrP 浓度，在InA/V的前置放大设置下，一式三份进行测定，以信号强度(与对照相比的增加百分比)的平均值士SD对数据进行作图。检测来自正常和感染的仓鼠、鹿和绵羊的脑勻浆物是否可用于本发明的方法。 10%脑勻浆物的Wfestern印迹证实初始材料中存在I^rPset5在I3K处理之前的10%脑勻浆物中清晰地显示典型的PrP条带模式，在1 消化后，条带向较低分子大小的I^rPse特征性地移动，伴有I^rPe从正常仓鼠脑物质中清除，作为完全蛋白水解消化的确证。来自临床动物的经去污剂提取的脑勻浆物的系列稀释物已证明Western印迹法对I^rPse的检出限为约10_3 10_4，而用捕获ELISA检测ft·产在另外进行IO1 IO2倍稀释的情况下仍是灵敏的(数据未显示)。相比之下，使用同样的Mab和脑勻浆物，本文中报道的测定的灵敏度比Western印迹法和捕获ELISA高出至少5个数量级。使用本发明的方法，使用信号与基线的比值(S/B) 来评估脑勻浆物中I^rP的可检测性。已确定，大于1. 1的S/B比值表明存在ft~P。通过本发明的方法测定来自仓鼠、绵羊和鹿的正常和感染的脑组织的、经Hi处理的和未处理的脑勻浆物的系列稀释物(图11)。数值表示为以来自样品的罗丹明红荧光发射信号(S)与来自只有稀释物脑勻浆物或勻浆缓冲液)荧光发射的背景基线信号(B)的比值。 数据表示为三次独立实验的平均值士 SD，每次独立实验都在InA/V的前置放大器设置下针对每个脑勻浆稀释物一式三份进行。如预期地，经I3K处理后，无论测试浓度如何，来自正常脑组织的所有样品的S/B比值均低于1. 1，表明不存在ft~Pe。如总的信号输出或S/B比值高于1. 1所证明地，来自感染仓鼠的经Hi处理的脑勻浆物的10倍系列稀释物的蛋白酶抗性押！^在10_"稀释时是可检出的，而来自绵羊和鹿的可检测稀释度为10_1(1。此外，对于仓鼠以及绵羊和鹿来说，来自I3K处理的脑勻浆物的最大检测范围为10_7 10_8稀释。在10倍系列稀释未经1 处理的正常脑勻浆物的情形中，对于仓鼠来说，用SOFIA 可检测I^Pg的稀释度为10—11，对于鹿和绵羊来说则为10,(峰值检测10_6 10_7稀释)，而后S/B比值都降至1. 1以下。来自感染的仓鼠、感染羊瘙痒病的绵羊和感染CWD的鹿的未经1 处理的脑组织的S/B比值也表明PrP的存在情况。来自感染组织的系列稀释脑勻浆物都显示对于绵羊和鹿来说10_"稀释(峰值检测为10_7)以及对于仓鼠来说10_13稀释(峰值检测为10_8)时S/B值大于1. 1。这些结果表明，来自未经蛋白酶处理的感染脑组织的PrP可被稀释至超过I^Pg可检测性水平来稀释，但仍然维持对总PrKe的检测能力。这些结果进一步提示，在临床疾病期的感染脑中，与I^Pg相比，总押！^至少多出llog。支持这一点的是，以前已报道过，在羊瘙痒病感染的脑中有的积累并达到高于I^PgIO倍的浓度。使用以前发表过的针对感染261的仓鼠的数据(R. Atarashi等〃 Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein, “ Nature Meth. vol. 4 Q007) 645-650页)，针对来自未经PK处理的仓鼠脑中的 PrPsc, SOFIA的检出限为约10ag。从来自仓鼠数据的直接推测提示，可从绵羊和鹿的脑物质中检出1飞克ft~PSe。然而，假定抗体反应性相同，对稀释样品的Western印迹表明，在克当量基础上，与绵羊和鹿的脑物质相比，在仓鼠脑中有至少多出10 100倍的(数据未显示)，这表明在前两种物种中蛋白质的检出可以在10 IOOag或更低的范围内。9.血液中PrP^的检测使用Mab 8E9的免疫沉淀作为连接PMCA和SOFIA的桥梁，所以，检测该Mab在PrP 免疫沉淀中的应用。对来自未感染的和感染的仓鼠(未感染感染(％ )-100 0、 90 10,70 30,50 50)的多种比值的10 %脑勻浆物混合物进行免疫沉淀，并通过 Western印迹分析(图12)。以不同比例组合10%正常脑勻浆物(NBH，normal brain homogenate)和感染^!BK的仓鼠脑勻浆物063K BH)(泳道1、5_只有NBH ；泳道2、6-90 μ L NBH 禾口 10 μ L 263Κ BH ；泳道 3、7_70 μ L ΝΒΗ+30 μ L263 BH ；泳道 4、8_50 μ L ΝΒΗ+50 μ L 263Κ BH)，并用Mab 8Ε9进行免疫沉淀。免疫沉淀的样品为未处理的(泳道1_4)或在用Mab 11F12进行Wfestern印迹和免疫染色之前用Hi处理的(泳道5_8)。在未经Hi消化时，无论脑勻浆物比值如何，所有样品都表现出类似的免疫染色强度(泳道1-4)。当与仅含有经1 处理的感染263的脑勻浆物(未显示数据)直接相比时，经Hi处理的免疫沉淀(泳道5-8) 的Wfestern印迹表现出类似的免疫染色。这些结果表明，Mab 8E9免疫沉淀和PrPs% 且I^Pg的存在不抑制或降低IM3se免疫沉淀最大值。为了定量和定性评估所分离的IM3，用 Mab 8E9免疫沉淀物进行捕获ELISA，所述免疫沉淀物来自正常和感染沈3的仓鼠的I3K未处理的脑勻浆物的组合(图13)。所述捕获ELISA使用与SOFIA相同的Mab对(11F12为捕获Mab，5D6为检测剂Mab)。正常脑感染脑的组合的Mab 8E9免疫沉淀之后，捕获ELISA 引起ELISA信号强度增加，这是因为起始混合物中感染脑物质水平增加。因为所述脑物质未经蛋白酶消化，所以每种混合物包含单独的I^Pg或者I^Pg和I^rPse之混合物，如Wfestern
19印迹所证实的那样(图12)。然而，用捕获ELISA进行的免疫沉淀分析表明增加的信号强度依赖于IM3se而非的存在。这指出了这些特异性Mab的用途和用于检测的方法。 尽管免疫沉淀-捕获ELISA模式可以很容易地检测来自感染的仓鼠、羊瘙痒病绵羊和 CffD鹿的脑来源的PrPse,但无法在来自临床动物的血液中检出ft·产。以前已经报道了在连续PMCA(sPMCA)之后在来自感染的仓鼠血液和羊瘙痒病绵羊样品中检测的能力。然而，Prfe检测所需的大数目的PMCA循环数使得该技术在诊断测定中并不实用。在血液中检测PrPk的问题已经通过联合sPMCA、随后的免疫沉淀经扩增的靶标以及用灵敏的SOFIA测定而得以解决(Chang等，2009)。使用仓鼠脑评价并验证了 sPMCA(图14)。对仓鼠脑勻浆物的稀释物进行7、14和40个循环的PMCA(泳道 7-10)，同时，以类似的方式处理同样的样品，只是不超声处理(泳道3-6)。用Mab 11F12对 10 μ L等份的每种样品进行Western印迹分析。对照样品是感染沈；31(的仓鼠脑勻浆物的 10_2稀释物，在进行Western印迹分析之前不用(泳道1)和用(泳道2) 消化。使用正常仓鼠脑勻浆物作为I^Pg来源，对10_8 10—11稀释(相对于初始的脑组织)的10%感染 263K的仓鼠脑勻浆物进行sPMCA。7个循环的sPMCA之后，在所有的稀释物中都无法检测到 M^，但完成14个循环后，在10_8稀释的样品中可以检出(图14，泳道10)。40个循环的 sPMCA(SPMCA40)之后，在受试的感染沈；31(的脑勻浆物的所有稀释物中均可以检出Hi抗性的(图14，泳道7-10)。类似地，平行处理稀释的仓鼠脑勻浆物(只是省去PMCA超声步骤)，未显示任何PrP^扩增，正像不存在Hi抗性的免疫染色所证实地(图3，泳道 3-6)。比较不进行PMCA(10_6，相对于初始脑组织)和sPMCA 检测之后的的检出限， 并考虑所分析的样品大小，估计PMCA导致了 IO4倍的扩增。使用来自临床动物的稀释的绵羊脑或CWD脑勻浆物(以及相应物种的未感染的脑勻浆物作为I^rPe的来源)进行类似的PMCA实验表明，采用28个循环的PMCA，在感染脑的 10_8稀释下，使用Western印迹对扩增的ft·产有了最初的检出。与仓鼠脑相比，对于来自绵羊和鹿脑的的最初检出需要增加循环数是由初始脑组织中起始的量较少所导致的。如预期地，SPMCA4tl结束时，增加的免疫染色强度和1 抗性之押！^的检出限证明了来自羊瘙痒病绵羊和CWD鹿脑勻浆物中的ft·!^得以扩增。与感染的仓鼠脑相比，尽管绵羊和鹿脑组织含有较少的PrPse,但相对于初始的I^rPse水平，扩增水平仍约为41og (未显示)。对来自羊瘙痒病绵羊和CWD鹿的血浆进行sPMCA4Q。绵羊的样品由三组(表3，组 1-3)羊瘙痒病绵羊组成，在采血时，基于是否存在临床症状和第三眼睑淋巴滤泡的免疫组织化学(IHC)(图15)进行区分。在采血时组3中的所有动物均未表现出临床症状，其最终发展为临床疾病。将未感染的绵羊组(表3，组4)进行安置，并维持在隔离的无羊瘙痒病区域。CWD样品由多只实验性感染的(口服途径)临床前和临床白尾鹿(表4)组成。 对所有绵羊和CWD样品分别进行SPMCA4tl，并在1 消化后用Western印迹法分析。对血浆进行SPMCA4tl后，在用Mab 8E9免疫沉淀浓缩PrP之前或之后，对经I3K处理的PMCA产物的Western印迹未显示任何ft~PSe。添加多聚腺苷酸[poly (A)](已报道其促进来自绵羊血液之低水平的快速检测(Thorne和Terry，2008))并未将扩增效率提高至能够检测经 SPMCA40的来自羊瘙痒病绵羊或CWD鹿血浆中IM3se的程度。sPMCA4(1后来自绵羊血液的I^rPse 的不能检出与所用的绵羊基因型无关(数据未显示)。也即，Prfe来源和正常绵羊脑之间绵羊基因型的配对不足以增加通过免疫印迹对扩增产物的检出。因为Western印迹未提供任何信息，因此不清楚是否起初就存在于来自CWD和包含羊瘙痒病的三组绵羊的任何动物的血液中，或者是否PMCA能成功地在仅40个循环后检出扩增的PrPse,而Wfestern 印迹的灵敏度则不足以检出。已报道，由于明显自发产生的PrPs%对绵羊血液进行PMCA可导致假阳性结果(Thorne和Terry，2008)。因此，使用包绕光纤免疫测定(SOFIA) (Chang 等，2009)检测未处理的和经Hi处理的、经Mab 8E9免疫沉淀的sPMCA4(1产物中的PrPs%而非继续增加PMCA循环数。我们的研究证明，在不进行sPMCA 时，用SOFIA从羊瘙痒病绵羊和未感染绵羊之血浆样品中得到的读数是近似的，且接近基线水平(图16)。在SPMCA4tl 之前，单个样品的SOFIA信号强度(样品/背景)范围为0. 5 0. 9 (组1)、0. 7 1. 2 (组 2)、0. 8 1.3(组3)和0.6 1. 1(组4)。因为以前对SOFIA动态范围的研究(Chang等， 2009)证明Hi未处理的临床绵羊脑ft·产在飞摩尔范围内是可检测的(Chang等，2009)，因此在羊瘙痒病绵羊血浆样品中的I^rPse水平很可能低于可检出范围。为了使I^rPse水平扩增至SOFIA的动态范围内，进行了 SPMCA40以及随后的Mab 8E9免疫沉淀。在经免疫沉淀的 SPMCA40产物中可以用SOFIA检出未经I3K处理的I^rPse (图16)。sPMCA 之后，对照组(组 4)的单个样品的信号强度的范围(0. 7 1. 2)与PMCA之前的样品没有显著性差别。然而， 无论其临床表现如何，所有三个羊瘙痒病绵羊组的SOFIA信号强度范围都彼此相近(组1 4. 3-4. 8，组2 :4.4-5. 1，组3 :4. 8-5. 3)，并显著大于PMCA之前值(pre-PMCA)以及未感染样品(组4)。当考虑到疾病的证实依赖于被羊瘙痒病感染的绵羊、但不依赖于临床症状和神经病变的存在时(因为所有三组受试绵羊均存在I^rPse)(图16)，就会理解本方法的价值。 PrPsc扩增也与基因型相容性无关，因为当使用来自ARQ/ARQ或ARQ/VRQ绵羊的正常脑勻浆物时，与任何感染的绵羊血浆样品的扩增无差异。另外，没有必要使用Hi消化来区分I^Pg 和因为无论在免疫沉淀和免疫测定分析之前SPMCA4tl产物为未处理的(图16)或经 Hi处理的(未显示)，SOFIA的结果都是相同的。根据与绵羊羊瘙痒病相关的临床症状的出现和免疫组织化学(IHC)，通过将血浆样品分为3组得到了图16中的数据。对每种血浆样品进行PMCA4ci( ■)或不进行PMCA孵育(□)。每种样品或是未处理的或是经Hi消化的， 然后进行Mab 8E9免疫沉淀，并用SOFIA分析ft~PSe。一式三份地地测定来自3组中每一个的血浆样品，且综合每个组中所有样品的数据，并表示为平均值士标准偏差。在获自多个临床前和临床鹿CWD病例的血浆中进行了类似的研究(图17)。类似于上述绵羊血浆样品，在不进行SPMCA4tl时，对CWD样品进行SOFIA获得的信号与未感染对照的没有差异，其本身接近背景。此外，1 抗性的不能被SPMCA4tl后的捕获ELISA或 Western印迹所检出。然而，在sPMCA40产物进行免疫沉淀之后，用SOFIA可从全部临床前和临床的CWD血液中检出ft·产(图17)。此外，与羊瘙痒病的绵羊样品类似，SOFIA值有赖于从感染动物来源的样品，但用SOFIA对疾病的验证是不依赖于患病动物的临床状态的。 图17中的数据通过对来自五个CWD病例的每种血浆样品进行SPMCA4tl ( ■)或维持不进行 PMCA(D)而得到的。所有样品或是未消化的或是经Hi处理的，随后进行Mab 8E9免疫沉淀和SOFIA。显示Hi未处理样品的结果，其值表示为一式三份测定的平均值士SD。在4个未感染鹿的血浆样品的情形中，一式三份地分析4个样品中的每一个，4个样品综合的结果表示为平均值士SD。在本发明的全部实施方案中，除非另外特别说明，所有百分比均为占总组成重量的百分比。除非另外特别说明，所有比值均为重量比值。所有范围是开放式的并且可进行组合。有效位的数目不表示对所示数量的限制，也不表示测量的精确度。除非另外特别指明， 所有数字表示的量都理解为被词语“约”所修饰。发明详述中引用的所有文献的相关部分均通过引用并入本文；对任何文献的引用不应解释为承认其为本发明的现有技术。如果本文中术语的含义或定义在某种程度上与通过引用并入本文的文献中的同一术语的含义或定义相冲突时，以本文中的含义或定义为准。尽管已举例说明并描述了本发明的具体实施方案，但是很明显地，对于本领域专业人员来说，可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下进行多种其它改动和修改。因此， 其旨在囊括所附权利要求覆盖的本发明范围内的所有这些改动和修改。参考文献列表Atarashi, R. et al. 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1.在怀疑含有PrKe的生物样品中检测PrP^是否存在的方法，所述方法包括；a.通过将ft·!^从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的 PrPsc ；b.用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的PrPk；和c.使用能够检测阿摩尔量之经标记PrKe的仪器来检测所述经标记的PrPSe。
2.权利要求1的方法，其中所述ft·!^是未经消化的。
3.权利要求1的方法，其中浓缩所述和检测所述经标记之间的持续时间为 48小时或更短。
4.权利要求1的方法，其中浓缩所述和检测所述经标记之间的持续时间为 M小时或更短。
5.权利要求1的方法，其中所述样品包括脑组织、神经组织、血液、尿、淋巴液、脑脊液， 或其组合。
6.权利要求1的方法，其中所述样品包含约0.1阿摩尔至约200阿摩尔的经标记ft~PSc;。
7.权利要求1的方法，其中所述样品不进行种子聚合。
8.权利要求1的方法，其中所述分子标记物是荧光标记物、磷光标记物、放射性同位素标记物，或其组合。
9.权利要求8的方法，其中所述分子标记物是荧光标记的抗PrP抗体。
10.权利要求9的方法，其中所述分子标记物还包含生物素化的抗PrP抗体。
11.权利要求1的方法，其中浓缩所述ft·!^的步骤采用抗体、免疫沉淀、磁珠，或其组合。
12.在怀疑含有I^rPse的生物样品中检测PrP^是否存在的方法，所述方法包括a.通过sPMCA扩增所述样品中存在的PrKe；b.通过将ft·!^从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的 PrPsc ；c.用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPse,以得到经标记的PrPk；和d.使用能够检测阿摩尔量之经标记PrKe的仪器来检测所述经标记的PrPSe。
13.权利要求12的方法，其中浓缩所述ft·!^的步骤采用分子抗体、免疫沉淀、磁珠，或其组合。
14.权利要求12的方法，其中所述ft·!^是未经消化的。
15.权利要求12的方法，其中扩增IM3se和检测所述经标记ft·严之间的持续时间为48 小时或更短。
16.权利要求12的方法，其中扩增ft·产和检测所述经标记ft·产之间的持续时间为M 小时或更短。
17.权利要求12的方法，其中所述样品包括脑组织、神经组织、血液、尿、淋巴液、脑脊液，或其组合。
18.权利要求12的方法，其中所述样品包含约0.1阿摩尔至约200阿摩尔的经标记 PrPsc0
19.权利要求12的方法，其中所述分子标记物为荧光标记物、磷光标记物、放射性同位素标记物，或其组合。
20.权利要求12的方法，其中浓缩所述ft·!^的步骤通过单克隆抗体或其抗原结合部分而发生，其中所述抗体具有与杂交瘤08-1/8E9所产生的抗体基本上一致的重链和轻链氨基酸序列。
21.权利要求12的方法，其中标记所述的步骤通过如下而发生a.单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有与杂交瘤08-1/11F12所产生的抗体基本上一致的重链和轻链氨基酸序列；b.用生物素化的单克隆抗体或其抗原结合部分标记所述捕获的PrPs%其中所述抗体具有与杂交瘤08-1/5D6所产生的抗体基本上一致的重链和轻链氨基酸序列。
22.权利要求1的方法，其中所述分析仪器公开于美国临时专利申请61/211，264中。
23.权利要求1的方法，其中所述分析仪器公开于美国临时专利申请11/634，546中。
24.权利要求12的方法，其中所述分析仪器公开于美国临时专利申请61/211，264中。
25.权利要求12的方法，其中所述分析仪器公开于美国临时专利申请11/634，546中。
26.单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合并增强第二单克隆抗体与PrP^的结
27.单克隆抗体或其抗原结合部分，其在第二单克隆抗体与ft·!^结合之后以增强的方式与正常结合。
28.单克隆抗体或其抗原结合部分，其与Pri^e正常结合，其在第二单克隆抗体与I^rPse 结合之后不能结合。
29.用于检测的试剂盒，其包含；a.第一单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合并增强第二单克隆抗体对的结合；和b.第二单克隆抗体或其抗原结合部分，其在第一单克隆抗体与ft·!^结合之后以增强的方式与结合。
30.权利要求四的试剂盒，其中所述第一抗体具有与杂交瘤08-1/11F12所产生的抗体基本上一致的重链和轻链氨基酸序列，并且所述第二抗体具有与杂交瘤08-1/5D6所产生的抗体基本上一致的重链和轻链氨基酸序列。
31.权利要求四的用于检测IM3se的试剂盒，其还包含； 能够免疫沉淀PrP^的第三单克隆抗体。
32.权利要求四的用于检测IM3se的试剂盒，其还包含；与能够检测阿摩尔量之经标记PrP^的仪器联用的至少一个瓶、皿或毛细管。
全文摘要
在怀疑含有PrPSc的生物样品中检测PrPSc之存在与否的方法，所述方法包括如下步骤通过将PrPSc从样品基质中尽可能地分离出来以浓缩可能存在于所述样品中的PrPSc；用至少一个分子标记物标记浓缩的PrPSc，以得到经标记的PrPSc；利用能够检测阿摩尔量之经标记PrPSc的仪器来检测经标记的PrPSc，并且其中浓缩PrPSc与分析经标记PrPSc之间的持续时间为约48小时或更短。
文档编号G01N33/53GK102365096SQ201080013755
公开日2012年2月29日 申请日期2010年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者佩里·克莱顿·格雷, 理查德·鲁本斯坦, 马丁·S·皮尔奇 申请人:洛斯阿拉莫斯国家安全有限责任公司, 纽约州立大学研究基金会