专利名称：肾预后测定的制作方法
肾预后测定本发明涉及预测对象具有肾功能缺失风险，鉴定对象具有更高肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有肾衰竭/终末期肾病风险的方法。申请人:已对将游离轻链作为在患者中测定广泛的单克隆丙种球蛋白病的方法进行了多年研究。这种游离轻链在诊断中的用途详见“Serum Free Light ChainAnalysis, Fifth Edition (2008) A. R. Bradwell 等人，ISBN0704427028，，。抗体包含重链和轻链。它们通常具有2倍对称性并包括2条相同的重链和2条相同的轻链，每条含有可变区和恒定区结构域。每个轻链/重链对的可变结构域组合形成抗原结合位点，因此两条链都对抗体分子的抗原结合特异性有贡献。轻链有2种类型，κ和λ，并且任何给定的抗体分子由其中任一种而从不由两种轻链产生。在人类中产生大约2倍于λ分子的κ，但在一些哺乳动物中不同。轻链通常与重链连接。然而，在个体的血清 或尿液中可检测到某些未连接的“游离轻链”。可通过构建针对游离轻链表面的抗体特异地鉴定游离轻链，该表面通常通过轻链与重链的结合而被隐藏。在游离轻链(FLC)中此表面暴露，使得其可被免疫检测。商业可得的用于检测κ和λ游离轻链的试剂盒包括，例如，The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom 生产的“Freelite ，，。申请人以前已鉴定，确定游离κ/游离λ比将帮助在患者中诊断单克隆丙种球蛋白病。例如，它已被用作辅助诊断完整免疫球蛋白多发性骨髓瘤(MM)、轻链ΜΜ、非分泌型ΜΜ、AL淀粉样变性、轻链沉积病、潜伏性ΜΜ、浆细胞瘤和MGUS(意义未明的单克隆丙种球蛋白病)。FLC检测还用作，例如，辅助诊断其它B细胞恶液质，并事实上用作替代用于单克隆丙种球蛋白病一般诊断的尿本周蛋白分析。常规地，寻找λ或Κ轻链之一的增加和因此产生的异常比例。例如，多发性骨髓瘤由恶性浆细胞单克隆扩增引起，其导致产生单一类型免疫球蛋白的单一类型细胞增加。这导致在个体中观察到的λ或Κ游离轻链的量增加。可测定这种浓度的增加，并且通常测定游离κ与游离λ的比例并与正常范围相比较。这可帮助诊断单克隆疾病。另外，游离轻链测定还可用于下列在患者中对所述疾病的治疗。例如，可对治疗AL淀粉样变性后的患者进行预后。Katzman 等人(Clin. Chem. (2002) ; 48 (9) : 1437-1944)讨论了在单克隆丙种球蛋白病的诊断中游离κ和游离λ免疫球蛋白的血清参考区间和诊断范围。通过免疫测定研究了 21-90岁的个体，并与通过免疫固定获得的结果相比较以优化用于检测患B细胞恶液质的个体中的单克隆游离轻链(FLC)的免疫测定。记录κ和λ FLC的量和κ/λ比，以确定检测B细胞恶液质的参考区间。肾衰竭是多发性骨髓瘤(MM)患者中发病率和死亡率的主要原因。多至50%的患MM的患者初期表现具有肾损伤，12-20%具有肾衰竭而10%变为透析依赖的。这代表了透析人群的约 2% (Bradwe11 A. R. Serum Free Light Chain Analysis, 5th Edn, The Binding SiteLtd 2008)。单克隆FLC是不可逆的肾衰竭最强烈的原因之一。例如，FLC可以生理地堵塞
肾小管。单克隆FLC通过若干不同机制引起肾衰竭，任何所述机制可能参与急性骨髓瘤肾病和慢性肾衰竭。在MM中，单克隆sFLC可具有宽范围的浓度。另外，以前已显示它们的毒性差异很大。已经研究了丽中引起肾损伤必须的sFLC(血清游离轻链)浓度。此外，还研究了尿FLC排出率。除了作为肾损伤起因，已发现FLC排出可作为肾损伤的指示物。研究显示，sFLC κ /λ比是鉴定患丽和急性肾衰竭的患者中产生单克隆FLC的简单方法。然而，没有进行将sFLC浓度与非MM患者肾衰竭风险相联系的工作。现在申请人已鉴定了在不患有MM或相关疾病的个体中总FLC与进行性肾衰竭发展风险之间的相关性。这不同于观察到的在MM中有时发生的急性肾衰竭。在MM患者中肾小管生理堵塞一般发生于血液中FLC>500mg/l。
例如，申请人已发现，慢性肾病中FLC(—般50_200mg/l)可作为预测增加的肾功能衰退风险的标记物。以前没有报告这些浓度的多克隆FLC会引起显著的肾脏损伤，但它们是肾小球滤过减少和任何炎症增加的标记物。来自明显健康的个体的血清中的多克隆FLC浓度被产生率和移除率所影响；其由个体的肾脏过滤FLC的能力决定。在FLC清除受限的个体中，存在血清FLC水平增高。因此，现在相信FLC是肾功能的标记物。因为单体FLC κ分子(25kDa)和二聚体λ分子(50kDa)是与113Da的肌酐大小显著不同的分子，它们一起提供了肾小球滤过的另外的标记物。然而，与肌酐相反，增加的FLC产生可作为许多疾病的结果，所以血清FLC —般不能独立地用作肾功能标记物。但是，B细胞增殖/活性标记物是重要的，并且由于B细胞负责制造FLC，这是临床有用的。FLC产生是B细胞上调的早期指示物。这方面，它可以补充CRP的用途，其为T细胞介导的炎症反应标记物。高FLC浓度是慢性肾或炎症紊乱或B细胞恶液质的指征。因此，异常的FLC测定结果可为目前需要若干诊断测试组合的多种紊乱的标记物。与此相反，当FLC测定结果正常时，暗示了肾功能良好，无炎症疾病并且无B细胞恶液质迹象。本发明提供了预测对象具有肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有更高肾功能缺失风险，和/或鉴定对象具有肾衰竭/终末期肾病风险的方法，所述方法包括检测来自对象的样品中的游离轻链(FLC)的量，其中更高的FLC的量与增加的肾功能缺失风险和/或增加的肾衰竭/终末期肾病风险相关。所述对象可为明显健康的或具有肾损伤指征，例如慢性肾病(CKD)的对象。本发明另一方面提供了具有肾损伤的对象的预后方法，其包括检测来自所述对象的样品中的FLC的量，其中更高的FLC量与增加的肾功能缺失风险相关。本发明另一方面提供了监测肾损伤的方法，其包括检测来自具有肾损伤的患者的样品中游离轻链(FLC)的量并将该样品中FLC的量与以前从所述患者获得的样品中检测到的FLC的量比较，其中与以前的样品相比检测到的FLC的量增加表明所述患者肾功能缺失的风险增加，而FLC的量降低表明该患者肾功能缺失的风险降低。例如，这可用于监测例如抗高血压药物或免疫抑制剂治疗的效果。FLC可为κ或AFLC。然而，优选测量总FLC( λ和κ FLC)浓度，由于单独检测κ FLC或λ FLC可能错过例如患者中单克隆产生的异常高水平的一种或其它FLC。
总游离轻链意指样品中游离K轻链加上游离λ轻链的总量。优选地，对象不需要具有B细胞相关疾病的症状。所述症状可包括反复感染、骨疼痛和疲劳。这样的B细胞相关疾病优选为非单克隆FLC疾病。一般地，它不是骨髓瘤(例如完整免疫球蛋白骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤)、MGUS、AL淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、滤泡中心细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、前B细胞性白血病或急性淋巴细胞白血病。此外，所述个体一般不具有降低的骨髓功能。所述个体一般不具有通常发现于许多这样的疾病中的异常κ : AFLC比。样品一般为来自对象的血清样品。然而,全血、血浆、尿液或其他组织或液体样品也是潜在可利用的。一般地，通过免疫测定(例如ELISA测定)或利用荧光标记珠(例如Luminex 珠)确定FLC (例如总FLC)。
例如，夹心测定使用抗体检测特定抗原。所述测定所使用的一或多种抗体可标记有能够将底物转化为可检测的分析物的酶。这样的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他本领域已知的酶。另外，其它可检测的标签或标记物可用于替代所述酶或与其共同使用。其包括放射性同位素、本领域广泛的有色和荧光标记标记物(包括荧光素、AlexaFluor>Oregon 绿、B0DIPY、罗丹明红、Cascade 蓝、Marina 蓝、Pacific 蓝、Cascade 黄、金)；以及缀合物例如生物素(例如，可从Invitrogen Ltd, United Kingdom获得)。还可以使用染料溶胶、化学发光标记物、金属溶胶或有色乳胶。可根据本文描述的不同发明将一或多种这些标记用于ELISA测定，或另外用于本文描述的其它测定、标记的抗体或试剂盒。夹心型测定的构建本身是本领域公知的。例如，将FLC特异的“捕获抗体”固定于基质上。可通过本领域公知的方法将“捕获抗体”固定于基质上。样品中的FLC被“捕获抗体”结合，其通过“捕获抗体”将FLC结合于基质。未结合的免疫球蛋白可被洗去。在ELISA或夹心测定中，可通过使用标记的、对感兴趣的FLC的不同部分(不同于结合抗体)特异的“检测抗体”确定结合的免疫球蛋白存在。可使用流式细胞术检测感兴趣的FLC的结合。此技术在领域是公知的，例如用于细胞分选。然而，它还可用于检测被标记的颗粒例如珠，并用于测量它们的大小。大量的图书描述了流式细胞术，例如 Practical Flow Cytometry, 3rd Ed. (1994) > H. Shapiro, AlanR. Liss, New York和Flow Cytometry, First Principles(2nd Ed.)2001, A. L. Given, WileyLiss0将一种结合抗体(例如FLC特异的抗体)结合于珠(例如聚苯乙烯或乳胶珠)。将所述珠与样品和第二检测抗体混合。优选用可检测的标记物标记的检测抗体，其可结合于样品中待检测的FLC。当待检测的FLC存在时，这获得具有标记的珠。还可使用本文描述的对其它分析物特异的其它抗体以允许检测所述分析物。然后通过流式细胞术检测被标记的珠。不同的标记物，例如不同的荧光标记物可用于，例如，抗游离λ和抗游离κ抗体。本文描述的对其它分析物例如细菌特异性抗原特异的其它抗体还可用于本文描述的这个或其它测定以允许检测所述分析物。这允许同时确定结合的每种类型的FLC的量或确定其它分析物的存在。可选地或另外地，不同大小的珠可用于不同的抗体例如不同标记物特异性抗体。流式细胞术可区分不同大小的珠并因此可快速地在样品中确定每种FLC或其它分析物的量。例如，另外的方法使用了结合于荧光标记的珠(例如商业可得的Luminex 珠)的抗体。不同的珠用于不同的抗体。不同的珠标记有不同的荧光混合物，因此允许通过荧光波长确定不同的分析物。Luminex 珠可从 Luminex Corporation, Austin, Texas, UnitedStates of America 获得。优选地，使用的测定为散射比池法(nephelometry)或透射比池法(turbidimetry)。用于检测λ或κ FLC的散射比浊测定或透射比浊测定一般是本领域公知的，但是不用于总FLC测定。它们对测定具有最好水平的灵敏度。可分别确定λ和kFLC的浓度或由单一测定得到总FLC浓度。这样的测定一般包括比例为60:40的抗κ和抗AFLC 抗体，但也可使用其它比例，例如50:50。还可以产生针对游离λ和游离Κ轻链混合物的抗体。可将总FLC的量与标准的、预先确定的值相比以确定总量是否高于或低于正常值。如下文所详细讨论的，申请人已鉴定，更高浓度的血清FLC与患者中显著增加的肾功能缺失可能性相关。尤其，例如，对具有较低血清FLC水平的人。FLC的>68mg/l的绝对水平或每单位GFR的FLC的>1. 7ml/l的校正水平与增加的肾功能缺失或肾衰竭风险相关。过去，已经生产了用于分别测量κ和XFLC的测定试剂盒，以允许计算比例。它们常规地用于已展现出疾病症状的个体中。优选地，所述测定能够在样品中确定FLC(例如总FLC)，从例如大约lmg/1至100mg/l，或lmg/l-80mg/l。可预期在不要求以不同稀释重测定样品的情况下检测绝大多数个体中的血清FLC浓度。优选地，所述方法包括检测样品中总游离轻链的量，其利用免疫测定，例如利用抗游离κ轻链和抗游离λ轻链抗体或它们的片段的混合物。这样的抗体可为50:50比例的抗κ :抗λ抗体。可通过使用标记的抗体或片段直接检测，或使用标记的针对抗游离λ或抗游离κ抗体的抗体间接检测结合于FLC的抗体或片段。所述抗体可为多克隆的或单克隆的。可使用多克隆抗体是因为它们允许在待检测的相同类型的轻链之间的某些变异，这是由于它们被构建为针对相同链的不同部分。多克隆抗体的产生描述于，例如，W097/17372中。优选地，被鉴定并且发现为显示了增加的肾功能缺失可能性的显著的血清FLC (例如总FLC)的量为至少68mg/l或至少每单位GFR I. 7mg/l FLC。还提供了例如用于本发明的方法的FLC测定试剂盒。所述试剂盒可检测样品中总FLC的量。它们可与用于本发明的方法的说明书一起提供。测定试剂盒还用于本发明的方法，其包括一或多种抗FLC抗体和一或多种用于检测其它肾功能标记物(例如肌酐、尿素或胱抑素C)的试剂和/或用于测定尿中的肾功能标记物(例如白蛋白或尿游离轻链)的试剂。所述测定试剂盒适于在样品中检测低于25mg/l,最优选低于20mg/l或约10mg/l,低于5mg/l或4mg/l的总游离轻链(FLC)的量。一般校准物测量l-100mg/l的范围。例如，测定试剂盒可为散射比浊测定试剂盒。优选地，试剂盒为包含一或多种针对FLC的抗体的免疫测定试剂盒。一般地，试剂盒包括抗κ和抗λ FLC抗体的混合物。一般地，使用50:50的抗游离κ和抗游离λ抗体混合物。所述试剂盒适于在样品中检测l-100mg/l，或优选l-80mg/l总游离轻链的量。还可使用能够结合FLC的抗体片段,例如( Fab)2或Fab抗体。抗体或片段可标记有例如上文描述的标记。因此可提供标记的抗免疫球蛋白结合抗体或其片段以检测结合FLC的抗游离λ或抗游离κ。试剂盒可包括校准液以允许在指定的范围内校准测定。校准液优选包含预先确定浓度的FLC，例如IOOmg/1至lmg/1，低于25mg/l，低于20mg/l，低于10mg/l，低于5mg/l或至lmg/1。还可通过优化抗体和包被于乳胶粒子上的“封闭”蛋白的量，以及，例如通过优化补充试剂例如聚乙二醇(PEG)的浓度修改试剂盒。 所述试剂盒可包括，例如，多个FLC标准对照。标准对照可用于验证待产生的FLC或其它组分的浓度的标准曲线。这样的标准对照确认了之前校准的标准曲线对所使用的试剂和条件是有效的。它们一般在测定来自对象的样品时基本上同时使用。标准物可包括一或多个低于20mg/l，更优选低于15mg/l，低于大约10mg/l或低于5mg/l的FLC标准物，以允许所述测定校准更低浓度的游离轻链。测定试剂盒可以是散射比浊或透射比浊试剂盒。它可为ELISA、流式细胞术、荧光、化学发光或珠型测定或试纸。这样的测定在现有技术中是普遍已知的。测定试剂盒还可包括本发明的方法的说明书。例如，说明书可包括对认为是正常值的总游离轻链浓度的指征，低于该值或实际上高于该值，显示了个体增加的或降低的肾功能缺失的可能性指征。这样的浓度可如上文定义。现在将参考下列附图
，仅以实施例的方式描述本发明图I显示了与血清中总FLC浓度(mg/1)相比较的肾功能变化(δ GFR)。图2是使用商业可获得的分别抗游离κ和抗游离λ的测定试剂盒获得的FLC浓度与使用组合的抗λ和抗κ游离轻链抗体的总FLC测定试剂盒获得的总FLC浓度之间的比较。肾功能预后方法收集1300名具不同程度肾损伤的患者的血清样品(“基线”)并然后随访长达63个月的一段时间。更详细地，将患者从肾脏诊所召集到伯明翰大学医院(University HospitalBirmingham)。所述患者具有一系列肾脏问题,包括GFR降低，蛋白尿,血尿,慢性肾病(所有阶段)，终末期肾衰竭(血液透析和腹膜透析)和肾移植受者。进行的测试和评估包括血清肌酐和估算的肾小球滤过率(eGFR)。如下计算每单位GFR的校正的FLC水平总血清FLC浓度(mg/1)除以估算的肾小球滤过率，其以mls/min/1. 73m2的形式由Cockcroft-Gault方程(REF)计算出。因此,给出了患者与肾功能无关的血清总FLC水平，其以每单位GFR mg/1的形式。参考
Cockcroft DW, Gault MH:Prediction of creatinine clearance from serumcreatinine. Nephron 16:31-41，1976.尿白蛋白/肌酐比。血清FLC 浓度，κ 和 λ (Freelite, The Binding Site, Birmingham, UK).通过将κ FLC和λ FLC的值相加计算出总血清FLC浓度。随访根据肾功能衰退率对患者进行随访。结果 在随访过程中，发展的风险(肾功能丧失或SGFR)与总血清FLC浓度强烈相关。
权利要求
1.预测对象具有肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有更高肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有肾衰竭/终末期肾病风险的方法，所述方法包括检测来自所述对象的样品中的游离轻链(FLC)的量，其中更高的FLC的量与增加的肾功能缺失风险和/或增加的肾衰竭/终末期肾病风险相关。
2.监测肾损伤的方法，其包括检测来自具有肾损伤的患者的样品中游离轻链(FLC)的量并将该样品中FLC的量与以前从所述患者获得的样品中检测到的FLC的量进行比较，其中与以前的样品相比检测到FLC的量的增加表明所述患者肾功能缺失的风险增加，而FLC的量的降低表明该患者肾功能缺失的风险降低。
3.权利要求I或2的方法，其中所述对象没有显示B细胞相关疾病的症状。
4.权利要求1-3的方法，其中所述对象没有显示多发性骨髓瘤的症状。
5.权利要求1-4的方法，其中所述游离轻链的量是样品中总游离轻链的量。
6.权利要求1-5的方法，其中在来自所述对象的血清样品中确定所述FLC。
7.权利要求1-6的方法，其中通过使用抗游离轻链抗体的免疫测定确定所述总FLC。
8.权利要求1-7的方法，其中所述抗体为抗游离κ轻链抗体和抗游离λ轻链抗体的混合物。
9.权利要求1-8的方法，其中所述方法包括通过散射比浊法或透射比浊法检测FLC的量。
10.用于权利要求1-9的方法的测定试剂盒，其额外包含用于所述方法的说明书。
11.权利要求10的测定试剂盒，其额外包含正常值，针对该正常值，使用所述测定试剂盒获得的FLC浓度表明对象增加的存活。
12.用于权利要求1-11的方法的测定试剂盒，其包括一或多种抗FLC抗体和一或多种用于其它肾功能标记物(例如血清肌酐、尿素或胱抑素C)的测定物和/或用于测定尿中的肾功能标记物(例如白蛋白或尿游离轻链)的试剂。
全文摘要
本发明提供了预测对象具有肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有更高肾功能缺失风险和/或鉴定对象具有肾衰竭/终末期肾病风险的方法，所述方法包括检测来自对象的样品中游离轻链(FLC)的量，其中更高的FLC量与增加的肾功能缺失风险和/或增加的肾衰竭/终末期肾病风险相关。本发明另一方面提供了监测肾损伤的方法，其包括检测来自具肾损伤的对象的样品中游离轻链(FLC)的量并将该样品中FLC的量与以前从所述对象获得的样品中检测到的FLC的量进行比较，其中与以前的样品相比检测到的FLC的量增加表明所述对象肾功能缺失的风险增加，而FLC的量降低表明该对象肾功能缺失的风险降低。
文档编号G01N33/68GK102959399SQ201180018924
公开日2013年3月6日 申请日期2011年3月3日 优先权日2010年3月2日
发明者A·布拉德韦尔 申请人:结合点集团有限公司