专利名称：前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及光激发偶联免疫检测技术，具体是一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
1971年，Hara等人首先发现前列腺特异抗原(prostate specific antigen ,PSA)，它由前列腺上皮细胞合成并分泌至精液中，是精浆的主要成分之一。前列腺特异抗原具有器官特异性，仅存在于前列腺上皮细胞、导管上皮细胞的胞质和黏液内，具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性。正常情况下，前列腺腺泡与淋巴系统之间存在由内皮层、基细胞层和基底膜构成的屏障相隔，外周血中不会出现前列腺特异抗原。当发生肿瘤或其它病变时，破坏前列腺和淋巴系统组织间屏障，富含前列腺特异抗原的腺泡内容物漏入淋巴系统，并相 继进入血液循环，使外周血中前列腺特异抗原升高。前列腺特异抗原是目前公认的唯一具有器官特异性的血清肿瘤标志物。血清前列腺特异抗原升高一般提示前列腺存在病变(前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺癌)。检测血清或血浆前列腺特异抗原含量，不仅可在高危人群中早期发现前列腺癌，同时也可用于前列腺癌患者治疗后的监控、手术治疗效果评估等方面。前列腺特异抗原具有良好的免疫原性，能制备特异性抗体并通过免疫化学原理进行测定。标记免疫分析根据标记物不同分为放射免疫分析、酶免疫分析和发光免疫分析，血 清前列腺特异抗原主要采用酶免疫分析和电化学发光免疫分析。无论采用何种分析方式，其检测原理基本相同，即采用双抗体夹心法测定未知前列腺特异抗原将其中一种抗体与固相载体连接作为捕获抗体，用于捕获待测标本中前列腺特异抗原；将另一种抗体与示踪物质(辣根过氧化物酶或三联吡啶钌)结合作为标记(检测)抗体，当标记抗体与前列腺特异抗原结合后，在固相载体表面形成捕获抗体-待测抗原-标记抗体复合物。将固相载体洗漆,去除过剩标记物或未参加反应的成分；酶免疫分析通过加入底物，通过酶促反应强度，对未知抗原进行定量分析。而电化学发光再加入三丙胺与电极表面发生氧化还原反应，通过光信号对未知抗原进行定量分析。
酶免疫分析检测前列腺特异抗原的主要优势表现在检测试剂已实现国产化、酶标仪普及程度高；因此，酶免疫分析具有较低检测成本，能够在基层医院开展工作。但是，由于采用辣根过氧化物酶作为示踪物质，稳定性较差且酶活性干扰因素较多，导致酶免疫分析的精密度不够理想。此外，酶免疫分析采用微孔反应板作为固相材料，由于包被抗体的限制，不能实现理想检测范围。电化学发光免疫分析是目前检测性能较高标记免疫分析技术，具有较高的自动化水平，较高的检测性能(敏感度、精密度、稳定性等方面)。但是，电化学发光检测仪昂贵，检测试剂依赖进口，从而使检测成本很高，且基础医疗单位很难开展。基于上述原因，酶免疫分析法主要用于前列腺癌高危人群的筛查，而电化学发光免疫分析主要用于前列腺癌患者确诊和手术治疗效果评估以及监测肿瘤复发等方面。
在标记免疫分析中，由于标记抗体(或抗原)在反应体系中是过量的，反应达到平衡后，体系中仍存在剩余的、未结合抗原的标记抗体。其中，非均相免疫分析采用固相吸附法分离结合标记物和游离标记物。固相吸附分离法是将抗原(抗体)吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质(抗体或抗原)、标记抗体(抗原)均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质(含游离标记物)存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。酶联免疫分析和电化学发光免疫分析检测血清中前列腺特异抗原，两种检测方法的从检测原理上均属于非均相免疫分析，酶免疫分析采用酶联免疫反应板作为固相材料，电化学发光免疫分析采用磁性微球作为固相材料。固相吸附分离方法有两个重要环节包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面
I.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被后固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。2. “洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。总之，就血清前列腺特异抗原检测项目而言，无论是采用酶免疫分析还是采用电化学发光免疫分析，二者均存在一些方法学上的缺陷。有的操作烦琐，有的实验条件要求过高；有的检验时间太长，有的耗材费用过高。这些不足之处不仅给患者增加就医成本，同时也限制该检测项目的普及应用，影响基层医疗单位的诊疗工作开展。

发明内容
本发明是为了解决的现有技术存在的上述问题，而提供一种对血清前列腺特异抗原含量能够进行方便、快速和准确检测的基于光激发偶联免疫分析原理的前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法。本发明是按以下技术方案实现的。一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，主要包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液，而该试剂盒还包括有生物素标记抗前列腺特异抗原抗体，抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液是按以下配比的原料制备的，
a.将欲标记的抗前列腺特异抗原抗体置于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，调整浓度至1_2晕克/晕升备用；
b.受体微球加入到0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，离心16000转/分洗涤微球，弃上清用上述溶液将微球浓度调整至10-20毫克/毫升；
c.按受体微球透析后抗前列腺特异抗原抗体为1:10的质量比混合于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，依次加入体积百分比为0. 6-0. 625%的10%吐温20溶液、4_5%新鲜配制的400 mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀，37°C反应48小时以上；
d.用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加体积百分比为5%的羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，37°C封闭反应I小时；
e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新悬浮微球、离心洗球，最终调整浓度至5-10微克/毫升备用。所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其生物素标记抗前列腺特异抗原抗体是按以下配比的原料制备的，
a.将纯化的抗前列腺特异抗原抗体调整为5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸盐缓冲液透析，过夜并于A28tol计算抗体总量为5. 35毫克； b.将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与纯化的抗前列腺特异抗原抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合，反应I小时；
c.将反应后的液体用0.OlM磷酸盐缓冲盐水于4°C透析24小时，即制成生物素标记抗前列腺特异抗原抗体。
一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测方法，其是按以下步骤进行的，
a.将分别瓶装的生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、前列腺特异抗原标准品、抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液、链霉亲和素标记供体微球溶液取出，至室温平衡20分钟；均相发光96孔测定板根据需要做好标记；
b.测定板微孔内依次加入25微升待测样本(或前列腺特异抗原标准品)、25微升生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、25微升抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，温育30分钟；
c.各孔再加入100微升链霉亲和素标记供体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，继续温育15分钟；
d.应用均相发光免疫分析仪测定各孔发光强度，激发波长采用680纳米，检测波长采用615纳米；
e.标准品测定结果，采用四参数拟合方式绘制标准曲线或获得数学函数，通过标准曲线或数学函数计算待测样品前列腺特异抗原浓度；
本发明集酶免疫分析和电化学发光免疫分析的优点于一体，并克服两种方法的缺点，准确测定血清中前列腺特异抗原水平。整个测定过程减少由于“洗涤”而造成的偏差；具有很强抗干扰能力，较低背景信号，使检测结果具有较高精度，特别是对待测物含量处于“灰区(临界点)”的标本，均相发光免疫分析具有很高的分辨率。同批试剂盒可共用一条标准曲线，每次测定不需单独定标。而只有发生抗原抗体特异性结合反应，受体微球和供体微球才能靠近，进而引发后续的级联放大反应，是一种“混合后即测定”模式。适用于前列腺癌高危人群筛查、辅助诊断和治疗效果评估，以及前列腺良性增生和恶性前列腺癌的鉴别诊断。


图I是本发明的检测原理示意 图2是本发明的操作流程示意图。
其中I :链霉亲和素标记供体微球2 :生物素标记抗前列腺特异抗原抗体
3 :抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球4 :待测前列腺特异抗原 5 :激发光源6 :突光检测系统。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。本实施例是基于光激发偶联免疫分析，对血清中前列腺特异抗原含量的双抗体检测。一.检测原理
光激发偶联免疫分析方法系统由两种100纳米的微球组成，利用作为供体和受体的微球来检测生物分子的相互作用，微球表面覆盖了一层水凝胶，作为生物连接的功能基团。当·生物分子存在相互作用时会将供体和受体微球拉近，从而激发级联放大的化学反应，产生数倍增强信号。具体来说，在激光(波长680纳米)的照射下，供体微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微球，与其表面的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体上的荧光基团，使之发出荧光，波长为520-620纳米。基于光激发偶联免疫分析对血清中前列腺特异抗原含量的均相发光免疫试剂盒的测定原理如图I所示。利用光激发偶联免疫分析方法，在受体微球(发光微球)表面包被抗前列腺特异抗原抗体(多克隆抗体)，将抗前列腺特异抗原抗体(单克隆抗体)标记生物素分子，制备生物素标记抗前列腺特异抗原抗体；同时，在供体微球(感光微球)表面已预先包被链霉亲和素。如反应体系中存在前列腺特异抗原(标准品或待测样品)，前列腺特异抗原同时与生物素标记抗前列腺特异抗原抗体和受体微球表面的抗前列腺特异抗原抗体同时发生特异性结合，于受体微球表面形成双抗体夹心复合物；此时，如加入链霉亲和素包被的供体微球，生物素与链霉亲和素结合而使得两个微球相互靠近，在激光光源￠80纳米)的激发下，供体微球表面的光敏剂将溶液中的常态氧分子转换成带一个电子的单线态氧。单线态的氧分子在溶液中扩散，在溶液中碰到受体微球后产生化学发光，从而更进一步的激发同一个微球上的荧光基团产生级联放大反应产生荧光(615纳米)。此时，待测前列腺特异抗原越多，相互靠近的供体-受体微球越多，则荧光强度越强。具体定量方法是，用已知的不同浓度的前列腺特异抗原为标准品，按上述模式反应、测定后即可获得一条剂量-反应曲线(或数学函数关系)；如将未知浓度待测标本进行同样操作，则可利用上述剂量反应曲线获得标本中待测前列腺特异抗原的浓度。二.试剂盒组分
前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒主要包括以下组分
1.生物素标记抗前列腺特异抗原抗体，
2.前列腺特异抗原标准品，
3.抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液，
4.链霉亲和素标记供体微球溶液，
5.均相发光96孔测定板。三.制备方法I.关键原料
①96孔发光免疫测定板，购自钼金-埃尔默公司，不同于酶免疫分析反应板，它只是反应容器，未包被抗原或抗体。②受体微球50 ill 20 mg/ml，购自钼金-埃尔默公司。③链霉亲和素标记供体微球200 ill 5 mg/ml，购自钼金-埃尔默公司。④生物素标记抗前列腺特异抗原抗体，自行制备。⑤抗前列腺特异抗原抗体，购自英国Abcam公司。⑥前列腺特异抗原纯品,购自美国Sigma公司。⑦活化的生物素(购自美国Sigma公司)。 2.试剂盒组分制备 ①前列腺特异抗原标准品
称取前列腺特异抗原纯品，用含20%灭活小牛血清的0. IM pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0、2、10、25、50、100纳克/毫升的系列标准品溶液，标准品须经国际质控血清校准。②抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液
a.预处理抗体和含量测定将欲标记的抗前列腺特异抗原抗体装入透析袋中，置于
0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，去除Tris、甘氨酸等含有氨基的成分。透析后的抗体溶液，用紫外分光光度计测定抗体含量，调整浓度至2毫克/毫升。b.洗涤微球取50微升(20毫克/毫升)受体微球置于I. 5毫升塑料离心管中，加入0. IM pH 8. 0磷酸盐缓冲盐水溶液，离心洗涤2次，每次16000XG 15分钟，吸干上清液待用。c.标记上述离心管内加入0. I毫克透析后抗前列腺特异抗原抗体，并用
0.IM pH 8. 0磷酸盐缓冲盐水溶液定容至200微升，再依次加入I. 25微升10%吐温20(Tween-20)溶液、10微升新鲜配制的400 mM氰基硼氢化钠(NaBH3CN)溶液，充分混匀置37°C温箱内反应48小时以上。d.封闭用SOOmM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液。加10微升羧甲氨基胺溶液与标记后的离心管内，置37°C温箱内反应I小时。e.洗球将离心管置于离心机内，16000XG离心15分钟；用移液管吸取上清溶液，再加入200微升IOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液，重新悬浮微球；重复离心，再次悬浮至50微升备用。③生物素标记抗前列腺特异抗原的抗体制备方法
a.将纯化的抗前列腺特异抗原抗体调整为5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸盐缓冲液透析，过夜并于A28tol计算抗体总量为5. 35毫克；
b.将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与抗前列腺特异抗原抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合，反应I小时。c.将反应后的液体用0. OlM磷酸盐缓冲盐水(PBS)于4°C透析24小时，即制成生物素标记抗前列腺特异抗原抗体。④配制受体微球溶液用pH 8. 0 0. I M Tris-HCl缓冲液将标记后受体微球稀释至20微克/毫升 (25微升/测试，0.5微克)。
⑤IOXTris-HCl 测定缓冲液配制IM Tris, 0.1% Tween-20, 0. 05%Proclin-300，使用时用蒸馏水稀释10倍。⑥配制供体微球溶液
用pH 8. 0 0. I M Tris-HCl缓冲液将标记后供体微球稀释至5微克/毫升(100微升/测试，0.5微克)。四.使用方法
基于光激发偶联免疫分析对血清中前列腺特异抗原含量的均相发光免疫试剂盒的测定原理如图2所示，检测步骤如下。I.将分别瓶装的生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、前列腺特异抗原标准品、抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液、链霉亲和素标记供体微球溶液取出，至室温平衡20分钟；均相发光96孔测定板根据需要做好标记；
2.测定板微孔内依次加入25微升待测样本(或前列腺特异抗原标准品)、25微升生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、25微升抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，温育30分钟；
3.各孔再加入100微升链霉亲和素标记供体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，继续温育15分钟。4.应用均相发光免疫分析仪测定各孔发光强度，激发波长采用680纳米，检测波长采用615纳米。5.标准品测定结果，采用四参数拟合方式绘制标准曲线或获得数学函数，通过标 准曲线或数学函数计算待测样品前列腺特异抗原浓度。
权利要求
1.一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，主要包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液，其特征在于该试剂盒还包括有生物素标记抗前列腺特异抗原抗体和抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。
2.根据权利要求I所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于 抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液是按以下配比的原料制备的， a.将欲标记的抗前列腺特异抗原抗体置于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，调整浓度至1_2晕克/晕升备用； b.受体微球加入到0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，离心16000转/分洗涤微球，弃上清，用上述溶液将微球浓度调整至10-20毫克/毫升； c.按受体微球透析后抗前列腺特异抗原抗体为1:10的质量比混合，于0.IM pH 8. 0磷酸盐缓冲盐水溶液中，依次加入体积百分比为0. 6-0. 625%的10%吐温20溶液、4_5%新鲜配制的400 mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀，37°C反应48小时以上； d.用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加体积百分比为4-5%的羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，37°C封闭反应I小时； e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新悬浮微球、离心洗球，最终调整浓度至5-10微克/毫升备用。
3.根据权利要求I所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于生物素标记抗前列腺特异抗原抗体是按以下配比的原料制备的， a.将纯化的抗前列腺特异抗原抗体调整为5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸盐缓冲液透析，过夜并于A28tol计算抗体总量为5. 35毫克； b.将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与纯化的抗前列腺特异抗原抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合，反应I小时； c.将反应后的液体用0.OlM磷酸盐缓冲盐水于4°C透析24小时，即制成生物素标记抗前列腺特异抗原抗体。
4.一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测方法，其是按以下步骤进行的， a.将分别瓶装的生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、前列腺特异抗原标准品、抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液、链霉亲和素标记供体微球溶液取出，至室温平衡20分钟；均相发光96孔测定板根据需要做好标记； b.测定板微孔内依次加入25微升待测样本、25微升生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、25微升抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，温育30分钟； c.各孔再加入100微升链霉亲和素标记供体微球溶液，混匀后置37°C温箱或水浴，继续温育15分钟； d.应用均相发光免疫分析仪测定各孔发光强度，激发波长采用680纳米，检测波长采用615纳米； e.标准品测定结果，采用四参数拟合方式绘制标准曲线或获得数学函数，通过标准曲线或数学函数计算待测样品前列腺特异抗原浓度。
全文摘要
本发明公开一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法。其包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液；该试剂盒还包括生物素标记抗前列腺特异抗原抗体和抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。检测时，测定板内依次加入待测样本、生物素标记抗体、特异性抗体包被受体微球，混匀后温育，加入链霉亲和素标记供体微球，继续温育；均相发光免疫分析仪测定各孔发光强度，四参数拟合方式绘制标准曲线，计算待测样品前列腺特异抗原浓度。成为混合后即测定模式，测定过程没有洗涤步骤。集酶免疫分析和电化学发光免疫分析之优点，成本低，适合基层医院推广应用，高通量适合用于大样本的筛查。
文档编号G01N33/574GK102721813SQ20121023537
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者于学林, 刘志永, 李会强, 李婵, 王辰, 蔡刚强, 邵新华, 靳宝英 申请人:沃克(天津)生物科技有限公司