专利名称：一种无流式细胞盒的流式细胞仪装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗检测仪器类流式细胞仪装置和方法，特别涉及一种无流式细胞盒的流式细胞仪装置和方法。
背景技术：
1、流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)和流式细胞仪流式细胞术(FCM)是在显微镜技术、染色化学、电子学技术和计算机等领域的综和进步的结合下得以发展起来的对处于快速直线流动中的单细胞的特性及其成分，或其他各种微小颗粒(如细菌)及其负载物进行多参数分析和分选的技术，它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析。在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、遗传学临床检验学、分子生物学、细胞动力学、环境微生物分析等学科中有着广泛的应用。流式细胞仪是集流体力学、光学和激光技术、电子工程学、生物信息学、生物物理学、荧光化学、标记技术、计算机等学科为一体的新型高科技仪器；用于对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定、分析和分选。细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分或某种变化都可以用流式细胞仪进行检测。其特点是检测速度快、测量参数多、采集信息量大、分析全面、方法灵活，还能分选出特定细胞群进行深入研究。2、流式细胞仪发展简史从1930年瑞典科学家Caspersson和Thorell用显微镜研究染色细胞的结构开始，到现今日益完善的大型分析型和台式临床型的各式流式细胞仪的整个进程，充满了半个多世纪来无数的精心研究和辛苦劳动。1934年，加拿大人Andrew Moldavan是首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，将静態顯微鏡(static microscopy)轉換成流式系統(flowingsystem),从此，迈出了从显微镜观察静止细胞向流式细胞术发展的第一步。1936年，Caspersson等引入显微光度术。1940年,美国人Albert Coons提出用结合突光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白。1949年,美国人Walance H. Coulter提交了发明专利，并在1953年获得了此项专利 U. S. Pat. No. 2656508，“MEANS FOR COUNTING PARTICLES SUSPENDEDIN FLUID”( “悬浮在液体中的粒子计数方法“)。1958年，Walance H. Coulter和他的弟弟Joseph Coulter, Jr.共同创建了”库尔特电子公司”,开始销售库尔特血细胞计数仪。从此开启了血细胞计数和分析自动化的新纪元。1959年，B型Coulter Counter问世，它就是今日流式細胞仪的前身，因為它具备流式細胞仪的所有特性能使單一細胞一个接一个的快速通過孔洞、能以电子信号來偵测細胞及具有信号分析的自动化。1953年Crosland-Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究,设计了一个流体系统使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过而其外层则包裹着鞘液，细胞悬液和鞘液都保持着高速层流运动状态，使細胞能在液柱的中央内一个接一个地流动，并依此原理设计出了红细胞光学自动计数器，奠定了现代流式细胞术中流体聚焦技术的基础。1965年，Kamemtsky等提出两个设想，即用分光光度计定量细胞成分和结合测量值对细胞进行分类。1967年，Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法。Fulwyler結合了 Coulter technology及RG Sweet給电脑噴噴墨打印机使用的噴墨技术(ink jet technology)而发展出第一台具有筛筛选(sorting)功能的流式細胞筛选仪，即现在的cellsorter的前身。噴墨技术的基本原理即是利用高频率振證的噴嘴(vibrationof nozzle),将液柱(stream)分裂成液滴(drop)並使打算筛选的液滴带上电荷,再利用高压电场使液滴産生偏折而被导入收集管中。後來Fulwyler再加以改進,依照Coulter仪器测量到的电子信号‘coulter volume’來決定給予含有特定細胞大小的液滴带相应的电荷，然后利用电场使之偏折，如此即可分离出特定的細胞种类。1969年，Van Dilla发明第一台荧光检测细胞计。此仪器利用argon laser取代传統的显微鏡灯源以激發荧光物质，並結合hydrodynamic focusing及Fulwyler’ s sorter的技术，发展了今日流式細胞仪 FACS (fluorescence activated cell sorter)的前身。不久，以 Stanford 大学Herzenberg教授為首的团队发展出类似的仪器,除了上述特点外,还結合mult1-parameterfluorescence、light scatter>coulter volume 及 cell sorting 的功倉石角立了现在广为使用的FACS的架构。当今兩大FACS cytometer的制造厂商,总部位於美國東岸的Coulter公司(Beckman Coulter)、西岸的 Becton Dickinson(BD),即分别由 Coulter Technology及与Stanford大学研究的技术结合所衍生出來的。1980年代第一台双激光四色荧光流式细胞仪和第一台商业化分选型流式细胞仪问世。2000年高精度数字化颜色补偿技术ADC (Advanced Digital Compensation)应用于流式平台。单激光五色流式细胞仪FC500/MCL和具有EV参数、同时进行绝对计数和精确测定细胞体积的流式细胞仪Quanta SC于2003年以后相继问世。贝克曼库尔特公司将临床实验室仪器自动化的理念引入流式细胞仪推出了流式细胞仪自动进样(multiple PlateLoading, MPL)，实现了 24孔、96孔普通和深孔板，24和40支试管自动进样。Dako公司创建的Moflo和Cyan，能高速、精确分析和分选目标蛋白和细胞。2009年第一台三激光十色荧光的分析型流式细胞仪Gallios/Navios，问世，次年又有了带温控和远程维修系统的Gallios0 BD推出的高速分选型流式细胞仪FACSAria III，使用6个不同波长的激发激光，可同时探测18色荧光。3、库尔特原理(Coulter Principle)<D (参见图1)一个容器中的微孔池(1-1)被微孔管(1-2)分成两个部分，两个部分仅由一个微孔(1-5)相通连结。两个电极(1-6)、(1-7)分别置于容器的两个部分，于是微孔电流就在通路中形成(1-8)。当悬浮在弱电解质溶液中的一个粒子，如血细胞(1-4)通过微孔时，由于粒子的阻抗比电解质溶液的阻抗大，在微孔(1-5)两端就有一个瞬时的阻抗增加。微孔阻抗改变的区域形成了一个"敏感区"。阻抗的瞬间变化产生一个电脉冲，通常被称为直流(Direct Current)脉冲,简称DC脉冲。这一 DC脉冲的幅度与通过微孔(1_5)的粒子的体积成正比。这就是库尔特原理。利用库尔特原理就可以对通过微孔的粒子进行计数并分析粒子的大小，这种方法也被称为直流阻抗法或库尔特阻抗法。库尔特原理可以对各种不同的粒子进行分析，不仅适用于血细胞，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业等，航空航天工业中同样也用来检测燃料的纯度。库尔特原理和库尔特阻抗法是血细胞计数及分析的最为经典的原理和方法，自发明一直沿用至今，是任何一台血液分析仪和流使细胞仪所必不可少的组成部分，而其原理和方法几十年来基本上没有什么根本的改变。4、血液成分<2>(参见图2)血液由血浆(2-1)( 58%)和有形细胞成分(2-2)( 42%)组成。有形分成主要包括红细胞(2-4)(每微升4-5百万个，RBC为红细胞Red Blood Cell的简称)、白细胞(2-5)(每微升5 9千个，WBC为白细胞White Blood Cell的简称)和血小板(2-3)(每微升20-40万个，PLT为其Platelet的简称)三大类。白细胞(2-5)可以粗分为粒性白细胞(Granulocyte)，淋巴细胞(2-9)(Lymphocytes)和单核细胞(2_10) (Monocyte)。粒性白细胞包括嗜碱粒细胞(2_8)(Basophil),嗜酸粒细胞(2-7) (Eosinophil)和中性粒细胞(2-6) (Neutrophil)。所以白细胞可以细分为五个亚细胞群，即淋巴细胞(2-9)、单核细胞(2-10)、中性细胞(2-6)、嗜酸细胞(2-7)、嗜碱细胞(2-8)。5、三分类和五分类血细胞分析仪由于库尔特原理是以粒子通过微孔时电阻抗的变化产生的DC脉冲的幅度来鉴别不同体积的血细胞，而白细胞中的中性、嗜酸、嗜碱三种细胞的体积很接近，所以仅用库尔特原理制成的血细胞分析仪只能将白细胞分为三类，故称为三分类仪器，即中性粒细胞(GRN)，淋巴细胞(LYM)，和中间细胞群(MID，包括嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞)。能鉴别区分出白细胞中的五种组分(即淋巴、单核、中性、嗜酸、嗜碱细胞)并分类计数的血细胞分析仪就是通常所称的五分类血细胞分析仪。为了达到五分类的目的，90年代，激光光散射、射频、化学染色计数等方法相继被应用于对细胞特性的分析，出现了五分类血液分析仪。6、基于流式细胞仪原理的激光光散射方法为利用激光光散射，90年代开始出现基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪，其基本原理可用图3来说明。核心部分是通称为流式细胞盒(3-1) (Flow Cell)的提供液体和粒子通道的小盒，如图4所示。在一个约4毫米x4毫米x8毫米的石英长方柱体沿长轴在中心以某种方法(譬如激光)钻出一条直径约50微米的直通微孔，然后从直通孔的两端磨出相对对准的两个圆锥(4-3)，直至在方柱体的中心留有约70微米长的微孔，称为微通孔(道)(4-4) (Orifice)，这就是流式细胞盒。激光束(4_1)从水平方向射入并聚焦在微通孔(4-4)的中心，当粒子沿垂直方向通过微通孔(4-4)的中心时，就会和激光相互作用，产生前向、侧向和后向等各个方向的光散射(Light Scattering,缩写为LS),即前向光散射(forward light scatter,缩写为 FLS),侧向或 90° 光散射(side light scatter,缩写为SLS)，和后向光散射(back light scatter，缩写为BLS)，以及荧光信号。侧向或90°光散射可由90°光散射或突光探测装置(3-9)来检测,而前后向光散射和轴向光损失可由前后向光散射和轴向光损失检测装置(3-10)来检测(在参见图3)。(4-2)表示鞘套流束，(4-5)表示样本(粒子)流束。在图3所示的仪器中，照明方式是激光光源(3-7)的光束转播方向(图中是水平方向)与粒子的流动方向(图中是垂直方向)相互正交，这里我们称之为垂直照明方式，以便与本发明的共轴缩写为LS照明方式加以区别。现今世界上所有基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪都是用这种垂直照明方式。为了能使粒子一个一个相继的通过微通孔的中心，除了适当的稀释悬浮粒子的溶液浓度外，还需用鞘流束流体包围含有被测粒子的样本(粒子)流束，通称为流体聚焦法(Hydrodynamic Focusing)。在上下两个圆锥内各安装一个电极(3-3)，当粒子通过微(通)孔(3-2)时，就会产生前述的微孔电流(3-4)的变化，即库尔特直流脉冲(DC)。这样，当每一个粒子通过微通孔(3-2)时，就可以同时得到几个信号，如DC、FLS、SLS、BLS及荧光信号。如在上述的两个电极上再加上高频电源，就可以同时多得到一个信号，这也是库尔特先生的另一个重大发明，(US Patent 3502974)称为射频法，简称为(RF)，即Radio Frequency的缩写。图3中，(3-1)是流式细胞盒；(3-5)是鞘套流束；(3-6)是样本(粒子)流束；(3-8)是表示聚焦透镜；(3-9)90°光散射或荧光探测装置；(3-10)是前向光散射及轴向光损失检测装置。
对粒子内部组成成分和结构敏感的测试方法有90度光散射(SLS)，射频法(RF)，荧光染色技术，后向光散射(BLS)等。其中又以后向光散射最为敏感，只是由于技术上的瓶颈目前还没有解决，至今在市场上的高端血液分析仪器及流式细胞仪，没有一款能探测后向光散射的。它们只利用了其它几种方法，如Coulter MAXM、STKS等用VCS技术，SPVolume (DC)，Conductivity (RF/DC)，和 Scattering (FLS)。Sysmex SE-9000、XE-2100 等则用了 DC、LS和荧光染色技术，ABBOTT则有90度光散射的专利，它的仪器一般用DC、FLS和SLS。本发明的无流式细胞盒的流式细胞仪则用DC、FLS和BLS及标记荧光素的特征荧光，是迄今世界上第一次把后向光散射应用于商业化的实用流式细胞仪中。7、后向光散射在激光散射粒子分析技术中，相对于其它方向的散射，后向散射对粒子的内部结构具有更高的敏感性。1979年，Kerker M，<3>等指出，只有后向光散射对细胞内部形态和结构最有敏感性，1982年Kerker从对弹性光散射理论基础的回顾进一步指出<4>，有关细胞的形状和内部结构的信息可以最好的从后向的光散射信号来获得。1986年，Sloot和Figdor<5>，在其理论文章中指出，为了最优化的探测混杂在一起的有核血细胞中不同的细胞类型，需要同时探测前向、侧向和后向的散射光。文中的计算表明，后向散射光的强度取决于细胞核对细胞质的比例及细胞核和细胞质的光学密度的变化。文中的分析特别强调了后向散射光的强度与细胞核的透明度之间的直接相关性。2004年Dakota Watson<6>等也对各个方向的光散射强度与细胞形态的关系作了较详细的论述，并作了相应的实验。在以上这些工作的基础上，近年也有一些关于后向光散射的美国专利，如US Patent 6743634B2 (Kramer, June 1,2004)和 US Patent 6869569B2 (Kramer,March 22,2005) 这些专利所给出的方法，都是用多根光纤和多个光电倍增管作后向散射光信号的探测，其结构和成本都与实用的商业仪器的要求相距甚远，只能在实验室中做基础研究。8、现有主流流式细胞仪结构图5是BD FACSVantage SE分选型流式细胞仪的光路图。(5-1)是流式细胞盒，(5 = 2)是分选用偏转板及收集管等分选收集系统，(5-3)是流体监视摄像机，(5-4)是收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜，(5-5)是三台激光器，(5-6)是8个改变光路方向的光学棱镜，(5-7)是接收前向散射光的光电二极管，(5-8)是接收侧向散射光的光电倍增管，(5-9-1)到(5-9-8)是接收荧光信号的8个光电倍增管，(5-10)是其余的分光镜、滤光片、透镜等。可以注意到，不同波长的荧光信号从收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜(5-4)出来时是混合在同一光路中的，凡要分出单一波长的荧光信号，就必须要用至少一个分光镜，一个滤光片(有时还要用多个)，图5中就有共10个这类镜片，不仅结构复杂，光路难调，而且损耗大。本发明的装置只用单个分光色散元件，在结构、损耗和性能上有无可比拟的优越件。

发明内容
本发明是我的另一发明中国专利“全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法及其分析仪器“<7> 及美国” Coaxial Illumination Of Coulter Aperture In FullFunction Hematology Analyzer“<8>的延伸和扩展。本发明将库尔特微孔的共轴方照明应用于流式细胞仪中，可以将世界上现有的占流式细胞仪市场主导地位的主流流式细胞仪中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统彻底抛弃，使对粒子内部组成成分和结构特别敏感的后向光散射探测及后向荧光信号的探测首次应用到商业流式细胞仪中，从而极大的提高了仪器的鉴别能力。由于这种独特照明方式的应用，使仪器的灵敏度提高一个数量级以上，使本发明的仪器成为一台高灵敏度、高鉴别力、低成本、结构简单、操作简便的高性价比实用型流式细胞仪，不仅可以打破中国流式细胞仪市场被外国公司垄断几十年的被动局面，而且由于其低价位，可以将目前国内流式细胞仪主要用于科研和学术领域，推广到医院的临床检验应用，大大提高了普通医院的临床检验能力，并开拓了流式细胞仪市场的新前景。本发明所的照明方式，即对经典的库尔特微孔直接的共轴平行照明，共轴平行照明的意思就是光束传播的方向的光轴与库尔特微孔轴重合(同轴)的照明。这种照明方式的采用，可以彻底摒弃现有的流式细胞仪中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，使对粒子内部组成成分和结构特别敏感的后向光散射探测首次应用到商业流式细胞仪中，从而极大的提高了仪器的鉴别能力。本发明的流式细胞仪装置，可以探测的信号包括库尔特直流脉冲信号(DC)，前向光散射信号(FLS)和后向光散射信号(BLS),前向和后向突光信号。是迄今世界上第一次把后向光散射和后向荧光信号用于商业化的实用流式细胞仪中。为了实现上述目的，本发明首次把库尔特微孔的共轴平行照明方法应用于流式细胞仪中，它使光散射法和荧光探测法可以直接应用于传统的库尔特微孔，其特征在于，将照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴。另外，为使库尔特原理的微孔池(图1) (. 1-1)中的库尔特微孔(图1) (. 1-5)能成为激发激光光束、散射光信号、荧光信号的光路的一部分，特殊设计的微孔池相对库尔特微孔的前后开有两个光学窗口。进一步所述微孔池相对微孔的前后的两个光学窗口，每一所述光学窗口可以是一光学平板、一对透镜、光纤束、光导管(light guide)等或其它光学元件。本发明也提供了一种无流式细胞盒的流式细胞仪装置，它包括照明光学系统(包括多波长激光的混合光学系统)、安装有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信号和突光信号分光系统和探测光学系统。其特征在于，所述激发照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，多波长激光混合光学系统和散射光信号及荧光信号分光系统，都采用单一的光学兀件。本发明的优点及达到的技术效果表现在以下几个方面I)如背景技术6中所述，现今世界上所有流式细胞仪都是用的垂直照明方式。本发明由于激发照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，即共轴平行照明方式，这样光束与粒子相互作用的区域就为整个库尔特微孔，光束与粒子相互作用的区域和时间，都比垂直照明方式提高一个数量级以上。在垂直照明方式中，见图6(6-7)，当粒子开始进入激光光束并开始产生散射光或荧光时，光电探测器开始产生电脉冲，如图6 (6-1)。当粒子处于激光光束中心时，散射光或突光达到最大值，如图6(6-2)。相应的电脉冲也达到峰值，当粒子离开激光光束时，电脉冲回到噪音水平，如图6(6-3)。整个 脉冲的时间宽度是粒子通过激光光束的时间，而激光光束在粒子行进方向只有20 μ m 25 μ m。而在平行照明中，当粒子开始进入库尔特微孔时(特殊的光学和光电设计使探测器只对空间特点区域的信号产生相应，见下述2)，粒子与激光光束作用并开始产生探测器能感应的散射光或荧光，光电探测器开始产生电脉冲，如图6(6-4)。由于照明光束在库尔特微孔内光强为均匀分布(特殊的光学设计达到这一目的，见下述3)，粒子一旦进入库尔特微孔，其发出的信号即达到最大值，并一直维持到粒子离开库尔特微孔，光电脉冲的波型如图6(6-12)。图6(6-4)、(6-5)、(6-6)分别为粒子刚进入库尔特微孔、粒子在库尔特微孔内、粒子刚离开库尔特微孔，相应的光电脉冲的波型如图6(6-12)。因为光信号的时间宽度相应的增宽，就对探测器的时间响应的要求相应的下降，从而可以使用较大面积的光电探测器，及增加接收角度范围的选择性。图6(6-8)为平行照明中激光的光轴，也是库尔特微孔中心轴。图6(6-9)为平行照明中的激光光束。图6(6-10)为细胞粒子，图6(6-11)为库尔特微孔片的厚度(300 μ m)，也是库尔特微孔的长度。图6中库尔特微孔的直径是70 μ m。2)本发明使用了特殊设计的光学系统和光电设计，使探测器只对空间特点区域的信号产生响应，即只对图7中的探测敏感区(7-3)中的粒子(图中血细胞B)产生的光散射信号和荧光信号有响应，对探测敏感区外的粒子(图中血细胞A、C、D)，即使处于照明光束中，其所发出的光散射信号和荧光信号也不能到达光电探测器。至于从微孔池壁上的光学窗口，如图8(8-1)的窗口玻璃片反射的构成后向的背景噪音更无法进入光电探测器。图8(8-2)是库尔特微孔，图8 (8-3)是安装库尔特微孔的圆盘。特殊设计的光学系统使本发明的仪器特别在后向仅有极低的噪音，后向散射光和后向突光信号的信号对噪音比(S/N)甚至高于DC的(S/N)，如图13所示3)由于微孔池壁上的光学窗口离库尔特微孔中心(聚焦激光光腰)的离较远，光学窗口上的激光强度远小于光腰处的激光强度，使从光学窗口上反射的光强度大为降低，从而大为降低了后向散射光探测时的噪音背景。这也是基于流式细胞仪原理的血液分析仪器和现有流式细胞仪中探测后向散射光时不可克服的技术瓶颈<9>。如图4所示，在探测后向散射光时，聚焦激光束要先照到长方柱体的表面(距库尔特微孔中心约2mm)，然后再照到库尔特微孔的园柱形表面(距库尔特微孔中心约25微米)，因为这里的聚焦激光束强度很大，反射的光强度相应也较大，使原本强度就很弱的后向散射光(比前向散射光强度小约3个数量级)的探测因器壁反射产生的噪音背景太大而无法达到可接受的信噪比要求。而本发明的照明方法正可克服这一后向散射光探测的技术瓶颈。4)定义整个库尔特微孔区为探测敏感区，探测敏感区可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的几个部分的组合。以上共轴平行照明方式的优点，可使光束与粒子相互作用的区域就为整个库尔特微孔，光束与粒子相互作用的区域和时间，都比垂直照明方式数量级提高一个数量级以上，散射光信号和荧光信号得到相应的数量级的提高。强度至少增加5倍，结合上述的只对空间某特定区域敏感的信号探测光学系统，可以使后向散射光信号和荧光信号的信号对噪音比(S/N)大为提高，从而大为提高了仪器的灵敏度和对不同种类细胞的鉴别能力。5)本发明使用了对库尔特微孔直接共轴平行照明，因而彻底摈弃了现有的流式血细胞仪中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，所以有“简单的结构、低故障、低成本、易操作“等一系列优点。



图1 :库尔特原理1-1微孔池1-1微孔管1-3血细胞悬浮液1-4血细胞1-5库尔特微孔1-6外电极1-7内电极1-8微孔电流1-9真空(6 “Hg)图2 :血液的组成成分2-1血漿2-2血液的有形成分2-3血小板2-4红血球2-5白血球2-6中性粒细胞2-7嗜酸粒细胞2-8嗜碱粒细胞2-9淋巴细胞2-10 单核细胞图3 :基于流式细胞仪的光散射血分析仪的基本原理3-1流式细胞盒3-2库尔特微孔3-3电极3-4微孔电流
3-5鞘套流束3-6样本(粒子)流束3-7激光光源3-8聚焦透镜3-990°光散射或萤光探测3-10 前向光散射及轴向光损失图4:流式细胞盒 4-1激光束4-2鞘套流束4-3园锥4-4微通道(Orifice)4-5样本(粒子)流束图5 BD FACSVatage SE流式细胞仪光路图5-1流式细胞盒5-2分选用偏转板及收集管等分选收集系统5-3流体监视摄像机5-4收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜5-5三台激光器5-68个改变光路方向的光学棱镜5-7接收前向散射光的光电二极管5-8接收侧向散射光的光电倍增管5-9(5-9-1)到(5-9-8)是接收荧光信号的8个光电倍增管5-10 其余的分光镜、滤光片、透镜等(共10个这类镜片)图6 BD垂直照明和平行照明中粒子与激光的相互作用6-1垂直照明中粒子开始进入激光光束时光电探测器开始产生电脉冲6-2垂直照明中粒子处于激光光束中心时，相应的电脉冲达到峰值6-3垂直照明中粒子离开激光光束时，电脉冲回到噪音水平6-4平行照明中粒子刚进入库尔特微孔6-5平行照明中粒子在库尔特微孔内6-6平行照明中粒子刚离开库尔特微孔6-7垂直照明方式6-8平行照明中激光的光轴,也是库尔特微孔中心轴6-9平行照明中的激光光束6-10 细胞粒子6-11库尔特微孔片的厚度(300 μ m)6-12 平行照明中粒子通过库尔特微孔时电脉冲波形图7 :光散射和荧光信号敏感区7-1直径50微米的库尔特微孔7-2激光束
7-3敏感区7-4敏感区后部7-4敏感区中部7-6敏感区前部7-7细胞 A、B、C、D7-8激光束光轴与库尔特微孔轴(同轴)7-9前向光散射和前向突光信号7-10后向光散射和后向突光信号 7-11300微米厚园片库尔特微孔板图8 :带有光学窗口的微孔池8-1光学窗口8-2库尔特微孔片8-3安装库尔特微孔的圆盘图9 :库尔特微孔的同轴平行照明中聚焦激光束的光腰充满库尔特微孔9-1聚焦激光束的光腰9-2库尔特微孔图10 :共轴平行照明的具体实施方法之一10-1微孔电流10-2电极10-3库尔特微孔10-4血细胞10-5血细胞悬浮液10-6光学窗口10-7聚焦激光束10-8照明光学系统10-9照明激光强度的实时监测光学系统10-10后向散射和后向突光接收光学系统10-11分光板10-12光纤10-13激光器10-14前向散射和前向荧光接收光学系统图11 :共轴平行照明的具体实施方法之二11-1微孔电流11-2电极11-3库尔特微孔11-4血细胞11-5血细胞悬浮液11-6光学窗口11-7聚焦激光束
11-8 照明光学系统11-9 照明激光强度的实时监测光学系统11-10 后向散射和后向突光接收光学系统11-11 分光板11-12 光纤11-13 激光器11-14 前向散射和前向荧光接收光学系统图12 :标准粒子的前向散射光和直流脉冲信号的示波器记录绿色轨迹(下)为直流脉冲(DC)信号，红色轨迹(上)为前向散射光(FLS)信号。前向的直流背景920毫伏。图13 :标准粒子的后向散射光和直流脉冲信号的示波器记录红色轨迹(下)为直流脉冲(DC)信号，绿色轨迹(上)为后向散射光(BLS)信号。后向的直流背景9. 60毫伏。图14 :质控血样的后向散射光和直流脉冲信号的示波器记录红色轨迹(下)为直流脉冲(DC)信号，绿色轨迹(上)为后向散射光(BLS)信号。蓝色轨迹(中)为后向散射光(BLS)经滤波后的信号。后向的直流背景24毫伏。图15 :无流式细胞盒桌上型流式细胞仪实验原型的部分光学系统的三维具体实施方法下面结合附图及其实施例，对本发明作详细描述。本发明的实施主要是用安装有通光窗口的微孔池替代现有流式细胞仪中的流式细胞盒，并把照明光学系统、前向和后向散射光信号和荧光信号探测光学系统等直接涉及本发明的核心分系统，按仪器设计要求适当合理的整合起来，从而成为一台无流式细胞盒的桌上型流式细胞仪。本发明的区别特征在于所述照明光束传播方向与微孔池中库尔特微孔的轴线一致。参见图9,在本发明中，照明激光光束(9-5)的传播方向的光轴与库尔特微(9-1)的轴线(9-1-1)同轴，它使光散射法和荧光检测法可以直接应用于经典的库尔特微孔。在一片几毫米直径、厚300微米的红宝石圆片(9-2)的中心打一个50 80微米直径的通孔(9-1)，就成了一个经典的库尔特微孔。把沿库尔特微孔轴(9-1-1)传播的激光(9-5)聚焦到微孔(9-1)的中心。这种照明方式在库尔特原理发明至今60多年的世界血液分析仪器历史上尚属首创。其优越性在本说明书的其余部分将得到充分的阐述。血细胞(9-4)可以通过微孔(9-1)。当然，上述圆片(9-2)的材料和尺寸、微孔的直径可根据具体要求设定。由于照明光(9-5)的传播方向的光轴与库尔特微孔(9-1)的轴线(9-1-1)同轴，所以图中轴线(9-3)既是照明光束(9-5)转播方向的光轴，也是空心圆柱型的库尔特微孔(9-1)的圆柱的中心轴。上述方法使用的照明光源，可以是激光器(气体激光器，如He-Ne激光器，Ar离子激光器，半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器等)，也可以是发光二极管(LED)，气体放电光源、自灼光源等。
上述使用的光源的波长范围，根据不同的应用，可以从紫外、可见到红外波段中的一种或几种。当照明光束沿库尔特微孔轴传播时，应使用适当的光学系统把光束聚焦到均匀地充满整个库尔特微孔。当使用的光源为激光器时，应使聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于库尔特微孔的直径，而其瑞利范围(Rayleigh Range)则大于几个库尔特微孔的长度。图10是根据库尔特原理(参见图1)的微孔池能，它形成光束的通道以照明库尔特微孔壁和接收散射光及荧光信号。将图1的微孔管(1-2)改制成把微孔池(ll-ι)分隔为两部分的微孔板(10-2),并在微孔池(10-1)相对微孔(10-5)的前后开两个光学窗口(10-7)，如图10所示，窗口(10-7)可以是如图10所示的一对光学平板(10-7)，也可以是如图11所示一对透镜或其它光学元件(11-7)。该光学元件可将光源的光束聚光到微孔(10-5)、(11-5)中。由此可见，本发明的微孔池(10-1)、(11-1)可以在常用的库尔特原理微孔池上稍加改进。在图10、图11中，(10-3)、，(11-3)表示血细胞悬浮液，(10-4)、(11-4)代表血细胞，(10-6)、(11-6)代表内外电极，(10-8)、(11-8)是产生的微孔电流。微孔池右部的真空(10-9)、(11-9)(例如，真空度可为6”Hg)，真空可使粒子从微孔池左部通过微孔进入微孔池右部。由此可见，由于上述微孔池壁上的光学窗口(10-7)、(11-7)离库尔特微孔(10-5)、(11-5)的中心(聚焦激光束的光腰)的距离较远，光学窗口(10-7)、(11-7)上的激光强度远小于光腰处的激光强度，使从光学窗口(10-7)、(11-7)上反射的光强度大为降低，从而大为降低了后向散射光和后向荧光信号探测时的噪音背景。这也是基于流式细胞仪原理的现有的血液分析仪器和现有流式细胞仪中探测后向散射光时不可克服的技术瓶颈<8>。再如图4所示，在现有技术的情况，在探测后向散射光后向荧光信号时，聚焦激光束要先照到长方柱体的表面(距库尔特微孔中心约2mm)，然后再照到库尔特微孔的园柱形表面(距库尔特微孔中心约25微米)，因为这里的聚焦激光束强度很大，反射的光强度相应也较大，使原本强度就很弱的后向散射光(比前向散射光强度小约3个数量级)的探测因器壁反射产生的噪音背景太大而无法达到可接受的信噪比要求。而本发明的照明方法和微孔池和光学窗口的设计正可克服这一后向散射光探测的技术瓶颈和技术缺陷。大为降低了后向散射光后向荧光信号探测时的噪音背景。如图7所示，本发明的整个库尔特微孔区可以定义为探测敏感区(7-3)，可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部(7-5)、微孔的前部(7-6)、微孔的后部(7-4)，或微孔的几个部分的组合。它的光源可采用激光束(7-2)。从而可产生的前向光散射信号(7_、后向光散射信号后向突光信号(7-10)。激光束(7-2)的光轴与库尔特微孔的轴为同轴(7-8)。当然，本文中所谓的“共轴”或“同轴”实际上是表明方向上的一致，都是在一定的加工和调校的精度下所能实际达到的限度内而言的，不可能是几何上、理论上的100%的共轴或同轴。本实施例中，圆片(7-11)是采用300微米厚园片库尔特微孔板。当然，上述圆片的材料和尺寸、微孔的直径可根据具体要求设定。由于激光光束的传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，所以图中轴线(7-8)既是激光光束转播方向的光轴，也是空心圆柱型的库尔特微孔的圆柱的中心轴。本发明的信号探测系统具有只对某特定空间区域敏感的特点，即只对图7中的探测敏感区中的粒子产生的光散射信号和荧光信号有响应，对探测敏感区外的粒子，即使处于照明光束中，其所发出的光散射信号和荧光信号也不能到达光电探测器。本发明的只对某特定空间区域敏感的信号探测系统包括，但不限于，光学的、机械的、电子学的、光-电的、光-机的、及以上几种结合的方法，或其它可以这到对某特定空间区域敏感的任何方法加以实现。本发明所用的光学探测接收系统，具有对空间特定区域选择性接受散射光信号和荧光信号的特点，从而实现了后向光散射信号和荧光信号的成功探测。对前向、后向散射光信号信号和荧光信号的探测，可以是对不同角度区间，或几个不同角度区间的组合的探测。·
前向的光信号包括前向散射光、轴向光损失(Axial Light Loss，简称ALL)和荧光
信号等信号。对前向、后向散射光信号和荧光信号的探测，可以是单波长的探测，也可以是多波长光谱仪分光探测。也可以在前向、后向进行单色或多色的荧光信号探测，或非弹性光散射信号，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信号探测。现今世界上所有流式细胞仪都是用的垂直照明方式。本发明由于激发照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，即共轴平行照明方式，这样光束与粒子相互作用的区域就为整个库尔特微孔，光束与粒子相互作用的区域和时间，都比垂直照明方式提高一个数量级以上。在垂直照明方式中，见图6(6-7)，当粒子开始进入激光光束并开始产生散射光或荧光时，光电探测器开始产生电脉冲，如图6(6-1)。当粒子处于激光光束中心时，散射光或荧光达到最大值，如图6(6-2)。相应的电脉冲也达到峰值，当粒子离开激光光束时，电脉冲回到噪音水平,如图6 (6-3)。整个脉冲的时间宽度是粒子通过激光光束的时间，而激光光束在粒子行进方向只有20 μ m 25 μ m。而在平行照明中，当粒子开始进入库尔特微孔时(特殊的光学和光电设计使探测器只对空间特点区域的信号产生相应，)，粒子与激光光束作用并开始产生探测器能感应的散射光或荧光，光电探测器开始产生电脉冲，如图6出-4)。由于照明光束在库尔特微孔内光强为均匀分布(特殊的光学设计达到这一目的)，粒子一旦进入库尔特微孔，其发出的信号即达到最大值，并一直维持到粒子离开库尔特微孔，光电脉冲的波型如图6(6-12)。图6(6-4)、(6-5)、(6-6)分别为粒子刚进入库尔特微孔、粒子在、粒子刚离开库尔特微孔，相应的光电脉冲的波型如图6(6-12)。因为光信号的时间宽度相应的增宽，就对探测器的时间响应的要求相应的下降，从而可以使用较大面积的光电探测器，及增加接收角度范围的选择性。图6(6-8)为平行照明中激库尔特微孔中心光的光轴，也是库尔特微孔中心轴。图6(6-9)为平行照明中的激光光束。图6(6-10)为细胞粒子，图6 (6-11)为库尔特微孔片的厚度(300 μ m)，也是库尔特微孔的长度。图6中库尔特微孔的直径是70 μ m。图9中，(9-1)表示共轴平行照明方式中聚焦激光束光腰。其瑞利范围(RayleighRange)大于几个库尔特微孔的长度，聚焦激光束光腰充满整个库尔特微孔(9_2)。图10、图11是本发明提供的两个具体实施例的示意图，它们是在图3或图4的微孔池的基础上，采用本发明的共轴照明方式的检测系统的实施例的示意图。该实施例仅是举例说明，但实际应用可不限于这些实施例。具体如下
实施例1):参见图10，激光器(10-13)，例如光纤藕合激光器，的输出经光纤(10-12)输出的光经分光板(10-11)进入照明光学系统(10-8)，聚焦光束(10-7)经微孔池光学窗口(10-6)(图中右边的)聚焦到微孔中心的血细胞(10-4)上。照射光与血细胞相互作用产生的前向散射光(FLS)或轴向光损失(ALL)及前向荧光信号经微孔池光学窗口(10-6)(图中左边的)进入前向接收光学系统(10-14)。照射光与血细胞(10-4)相互作用产生的后向散射光(BLS)及后向荧光信号经微孔池窗口(10-6)(图中左边的)返回进入后向光接收光学系统(包括照明光学系统(10-8)、分光板(10-11)和后向光接收光学系统(10-10)，照明激光强度的实时监测光学系统(10-9)用于实时监测照明激光的强度变化。于是，每个血细胞通过微孔时，就可以同时得到多个有关血细胞信息的信号(DC、FLS、BLS、ALL，及前、后向荧光信号)，这些信号即以其高鉴别力用于血细胞的五分类和其他多项参数的测量。图中，(10-5)是血细胞悬浮液。(10-1)是微孔池产生的微孔电流。图中，A、B为库尔特微孔池被库尔特微孔板分隔成的两个部分。实施例2):参见图11，本实施方法与具体实施方法I)的不同在于照明光学系统和后向光接收光学系统没有共用的部分，微孔池的设计也不同于上述实施方法I)。光纤藕合激光器(11-13)的输出经光纤(11-12)先进入照明光学系统(11-8)，然后经分光板(11-11)后变成聚焦光束(11-7)经微孔池的光学窗口(11-6)(图中右边的)聚焦到微孔中心的血细胞(11-4)上。照射光与血细胞相互作用产生的前向散射光(FLS)或轴向光损失(ALL)及前向荧光信号经微孔池光学窗口(11-6)(图中左边的)进入前向光接收光学系统(11-14)。照射光与血细胞(11-4)相互作用产生的后向散射光(BLS)及后向荧光信号经微孔池窗口(11-6)(图中右边的)返回，由分光板(11-11)反射进入后向光接收光学系统(11-10)。照明激光强度的实时监测光学系统(11-9)用于实时监测照明激光的强度变化。于是，每个血细胞通过微孔时，就可以同时得到多个有关血细胞信息的信号(DC、FLS、BLS、ALL，及前、后向荧光信号)，这些信号即以其高鉴别力用于血细胞的五分类和其他多项参数的测量。部分实验结果示例:I)直径7微米的标准粒子的库尔特直流脉冲信号(DC，下轨迹)与前向散射光信号(FLS，上轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，见图12。注意前向光散射信号的直流背景为920毫伏。2)直径7微米的标准粒子的库尔特直流脉冲信号(DC，下轨迹)与后向散射光信号(BLS，上轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，参见图13。3)质控血样的库尔特直流脉冲信号(DC,下轨迹)与后向散射光信号(BLS,下轨迹，经滤波后的BLS，中轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，参见图14。注意后向光散射信号的直流背景仅为24毫伏。对比前向光散射信号的直流背景920毫伏，降低了 34倍。后向光散射信号的信号噪音比(S/N)甚至比直流脉冲的(S/N)还高，这充分说明本发明的照明方式和后向光学探测系统的设计的无比优越性。图15是无流式细胞盒桌上型流式细胞仪实验原型中部分光学系统的三维设计图。上述示波器信号图即在此上实验原型得到。通过上述实施例，可以看出，本发明是对库尔特微孔直接照明，因而彻底摈弃了现有的流式细胞仪和基于流式细胞仪原理的血细胞分析仪器中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，所以有“简单的结构、低故障、低成本、易操作”等一系列优点。
权利要求
1.在流式细胞仪中，使用对库尔特微孔的共轴平行照明方法，从而彻底摒弃了世界上现有主流流式细胞仪中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，它使光散射和荧光的探测可以直接应用于经典的库尔特微孔，其特征在于，将照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴。
2.根据权利要求1所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，所述照明光束的照明光源，可以是下列任一种或几种激光器、发光二极管(LED)，气体放电光源、自灼光源；所述激光器可以是下列任一种或几种气体激光器，如He-Ne激光器，Ar离子激光器， 半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器。
3.根据权利要求1所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，所述照明光束的照明光源的波长范围，根据不同的应用，可以从紫外、可见到红外波段中的一种或几种。
4.根据权利要求1到3任一所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，当照明光束沿库尔特微孔轴传播时，光束聚焦到均匀地充满整个库尔特微孔。
5.根据权利要求1到3任一所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，当使用的光源为激光器时，聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于库尔特微孔的直径，而其瑞利范围(Rayleigh Range)则大于几个库尔特微孔的长度。
6.根据权利要求1所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，为使库尔特原理的微孔池能形成光束的通道以照明库尔特微孔和探测光信号，微孔管改造成把微孔池分隔为两部分的微孔板，并在微孔池相对微孔的前后开两个光学窗口。
7.根据权利要求6所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，所述微孔池相对微孔的前后的两个光学窗口，每一对所述光学窗口可以是一对光学平板、一对透镜或其它光学兀件。
8.根据权利要求1、4和5所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，整个库尔特微孔区为探测敏感区，探测敏感区可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的几个部分的组合。
9.根据权利要求1和8所述的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，信号探测系统具有只对某特定空间区域敏感，即只对探测敏感区中的粒子产生的光散射信号有响应，对探测敏感区外的粒子，即使处于照明光束中，其所发出的光散射和荧光信号也不能到达光电探测器。
10.根据权利要求9的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，只对某特定空间区域敏感的信号探测系统可以是光学的、机械的、电子学的、光-电的、光-机的、及以上几种的结合的方法，或其它可以达到对某特定空间区域敏感的任何方法加以实现。
11.根据权利要求9的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，具有对空间特定区域选择性接受散射光和荧光信号的特点，从而实现了后向光散射信号和后向荧光信号的成功探测。
12.根据权利要求9和11的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，对前向、后向散射光信号和荧光信号的探测，可以是对不同角度区间，或几个不同角度区间的组合的探测。
13.根据权利要求9、11、12的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，前向的光信号包括前向散射光、轴向光损失(Axial Light Loss,简称ALL)和前向突光等信号。
14.根据权利要求9、11、12、13的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，对前向、后向散射光和荧光信号的探测，可以是单波长的探测，也可以是多波长光谱仪分光探测。
15.根据权利要求9、11、12、13的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，其特征在于，也可以在前向、后向进行单色或多色的荧光信号探测，或非弹性光散射信号，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信号探测。
16.一种库尔特微孔的共轴平行照明流式细胞仪，它包括照明光学系统、有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光和突光信号探测光学系统，其特征在于，在微孔池中所述照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线一致。
17.—种库尔特微孔的共轴平行照明的应用，所述照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，它不仅可以用于流式细胞仪中，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，及对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业的检测以及航空航天工业中可用来检测燃料的纯度等。
18.根据权利要求1、3、13、14、15的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法， 多波长的激发光源(如多个不同波长的激光)的光束组合器(beam combiner)，采用了单一的色散元件，包括，但不限于，平面和凹面反射光栅、平面和凹面透射光栅、多模光纤束，导光管(Lightpipr)、光波导(Lightguide)等单一元件的波长混合器。
19.根据权利要求1、3、13、14、15的流式细胞仪中库尔特微孔的共轴平行照明方法，多波长的荧光信号的波长分离，改变了现有流式细胞仪中常用的分光镜、滤光片、二色镜等的多个元件的复杂组合，采用了单一的色散元件，包括，但不限于，平面和凹面反射光栅、平面和凹面透射光栅等单一元件的色散元件。
全文摘要
本说明书披露了一种世界首创无流式细胞盒流式细胞仪装置和方法。新装置采用独特的库尔特微孔直接同轴照明方法，彻底摒弃了世界上现有主流流式细胞仪中必不可少的昂贵流式细胞盒和复杂流体聚焦，简化了结构，降低了成本，且使细胞与激发激光相互作用时间增加十几倍，数量级地提高了仪器的灵敏度，其独特的结构使对细胞内部结构、组分最敏感的后向散射光首次成功应用到实际商业流式细胞仪中，提高了仪器对不同细胞亚群的鉴别能力。新装置的多波长激发激光组合器和多波长荧光探测系统中，都采用了单个色散元件，使仪器的损耗降低到最低程，且减少了波长的交叠。与世界上现有占市场主导地位的流式细胞仪相比，具有明显的性价比和市场优势。
文档编号G01N15/14GK102998239SQ20121019544
公开日2013年3月27日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者龚维燕 申请人:龚维燕