专利名称：一种多重点样、双层电泳检测微卫星dna的琼脂糖凝胶电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法。
背景技术：
在许多研究领域，包括遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位、基因图位克隆、系统演化、分子进化、分子标记辅助育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等，都涉及大量的分子标记分析，这往往是一个实验室无力而且也不可能独立承担的。因此，要求发展高通量的分子标记。高通量分子标记是指在单位时间和处理中能提供大量遗传信息的分子标记。而自动化分析是高通量分子标记技术发展的基础，多重点样就是将多个聚合酶链式反应产物上样同一电泳道来增加信息量，是自动化分析的重要方面。 目前，广泛用于植物分子标记检测的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳，他们通过比较目标分子标记PCR扩增条带在凝胶上的迁移距离，获得不同个体(不同基因池)间在目标分子标记座位上的长度多态性。聚丙烯酰胺凝胶电泳虽然分辨率较琼脂糖凝胶电泳高一些，但需要进行玻璃板的清洗、晾干(吹干)、凝胶配置、灌胶、凝固、电泳、染色、显色等多个步骤，整个过程约需要4飞小时。即使研究者在不断改进聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，但仍然存在制胶难度大、步骤多、时间长、体力投入大等缺点。琼脂糖凝胶的亲水性强、理化性质稳定且制备非常简单(配制时只需称取一定量的琼脂糖粉，再加入一定量的电泳缓冲液，在微波炉中加热充分溶解后冷却至5(Γ60度，力口入溴化乙锭染色剂混匀，灌入凝胶模具，很快凝固即可电泳)成为分离、鉴定、纯化DNA片段最为简单和重用的方法之一。琼脂糖凝胶制作简单，在实验室中，通常一次点样电泳结束、凝胶成像系统记录电泳结果后就被丢弃了。这种做法一方面造成了琼脂糖粉末和电泳缓冲液的大量浪费，显著增加了分析测试的成本。另一方面，凝胶制备中用的EB是一种强致癌物质，一次点样并不能充分利用凝胶中的ΕΒ，造成了 EB不必要的向环境中释放。因此，提高单位面积上EB的利用率，减少制胶量，优化琼脂糖凝胶电泳方法是一个值得关注的问题。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有微卫星DNA电泳检测时造成琼脂糖粉和电泳缓冲液大量浪费，以及EB的利用率低的问题，而提供了一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法。本发明的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，是按照以下步骤进行的一、利用微卫星分子标记对不同群体或群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，得待检测扩增产物；二、制备同样面积的两块3%的琼脂糖凝胶，取其中一块3%的琼脂糖凝胶作为下层琼脂糖凝胶，另一块3%的琼脂糖凝胶平行放置在下层琼脂糖凝胶上，作为上层琼脂糖凝胶，将下层琼脂糖凝胶与上层琼脂糖凝胶放入电泳缓冲液中，备用；三、取步骤一中待检测扩增产物在下层琼脂糖凝胶上样后，进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳；四、在下层琼脂糖凝胶的凝胶孔继续上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f2cm时，切断电源，停止电泳；然后在上层琼脂糖凝胶上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为广2cm时，切断电源，停止电泳；五、重复步骤四的操作，直至待检测的扩增产物跑到凝胶底部时，切断电源，停止电泳；六、采用紫外凝胶成像系统对电泳结果进行检测，即完成多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳。
本发明包含以下有益效果本发明快速、高效的琼脂糖电泳方法主要内容包括琼脂糖凝胶制备、双层电泳、分次成像，本发明是利用琼脂糖凝胶的亲水性、理化结构的稳定性、分辨率高而形成的一种新的电泳检测方法，对植物并无特异性，可以分离任何植物的目标分子标记，具有广泛的适用性。I、本发明克服了国内实验室琼脂糖凝胶电泳中，单次点样造成的试剂药品过度浪费、染色剂对人体的危害、及凝胶和电泳缓冲液等废弃物对环境造成极大污染的缺点，极大提高了琼脂糖凝胶和电泳缓冲液的利用率，节约了人力和成本。本发明通过对PCR产物片段大小、EB浓度及多重点样间隔距离等重要环节的摸索实现了多重点样，与单次点样比较，不需要重新制备凝胶，IOcm长的一块凝胶可重复点样8次，节省成本8倍以上。2、检测快速，用200个SSR标记分析一个包括180个家系的植物分离群体的遗传变异仅需I个月的时间。本发明采用多重点样的方法大大减少了凝胶制作的时间，同时结合双层电泳技术，一个电泳槽中可同时进行2层凝胶电泳，大大缩短了电泳时间，提高了实验效率，广泛适用于植物遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位、基因图位克隆、系统演化、分子进化、分子标记辅助育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等领域的SSR分子标记检测。3、本发明通过电泳液预冷和电泳电压的调试实现了双层电泳，提高了凝胶和EB的利用率，缩短了电泳时间，从而实现了快速、高效检测植物SSR标记位点遗传变异。由于多重点样较单重点样电泳时间要长，再加上双层凝胶放在一起不易散热，会使电泳液温度升高，容易出现泳道上电泳条带弥散的现象，预先将电泳液预冷可避免这种现象。4、本发明最适合进行分子标记中引物的群体检测，一块胶上点同一引物的PCR产物，多重点样时样品间不会发生污染。


图I为本发明所述琼脂糖电泳用于植物SSR标记检测时的流程图；图2为显示一重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果；图3为显示二重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果；图4为显示三重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果；图5为显示四重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果；图6为显示五重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果；
图7为显示八重点样引物对在10厘米长琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，是按照以下步骤进行的一、利用微卫星分子标记对不同群体或群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，得待检测扩增产物；二、制备同样面积的两块3%的琼脂糖凝胶，取其中一块3%的琼脂糖凝胶作为下层琼脂糖凝胶，另一块3%的琼脂糖凝胶平行放置在下层琼脂糖凝胶上，作为上层琼脂糖凝 胶，将下层琼脂糖凝胶与上层琼脂糖凝胶放入电泳缓冲液中，备用；三、取步骤一中待检测扩增产物在下层琼脂糖凝胶上样后，进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳；四、在下层琼脂糖凝胶的凝胶孔继续上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f2cm时，切断电源，停止电泳；然后在上层琼脂糖凝胶上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳；五、重复步骤四的操作，直至待检测的扩增产物跑到凝胶底部时，切断电源，停止电泳；六、采用紫外凝胶成像系统对电泳结果进行检测，即完成多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳。本实施方式包含以下有益效果本实施方式快速、高效的琼脂糖电泳方法主要内容包括琼脂糖凝胶制备、双层电泳、分次成像，本实施方式是利用琼脂糖凝胶的亲水性、理化结构的稳定性、分辨率高而形成的一种新的电泳检测方法，对植物并无特异性，可以分离任何植物的目标分子标记，具有广泛的适用性。I、本实施方式克服了国内实验室琼脂糖凝胶电泳中，单次点样造成的试剂药品过度浪费、染色剂对人体的危害、及凝胶和电泳缓冲液等废弃物对环境造成极大污染的缺点，极大提高了琼脂糖凝胶和电泳缓冲液的利用率，节约了人力和成本。本发明通过对PCR产物片段大小、EB浓度及多重点样间隔距离等重要环节的摸索实现了多重点样，与单次点样比较，不需要重新制备凝胶，IOcm长的一块凝胶可重复点样8次，节省成本8倍以上。2、检测快速，用200个SSR标记分析一个包括180个家系的植物分离群体的遗传变异仅需I个月的时间。本实施方式采用多重点样的方法大大减少了凝胶制作的时间，同时结合双层电泳技术，一个电泳槽中可同时进行2层凝胶电泳，大大缩短了电泳时间，提高了实验效率，广泛适用于植物遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位、基因图位克隆、系统演化、分子进化、分子标记辅助育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等领域的SSR分子标记检测。3、本实施方式通过电泳液预冷和电泳电压的调试实现了双层电泳，提高了凝胶和EB的利用率，缩短了电泳时间，从而实现了快速、高效检测植物SSR标记位点遗传变异。
4、本实施方式适合进行分子标记中引物的群体检测，一块胶上点同一引物的PCR产物，多重点样时样品间不会发生污染。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一至步骤五中电泳的电压为疒8V/cm。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中所述的电泳缓冲液温度为0 4°C。其它与具体实施方式
一或二相同。为了充分公开本发明多重点样快速、高效琼脂糖凝胶电泳方法，通过以下试验对本发明作进一步详细说明本试验的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法是按照以下步骤进行的—、植物DNA样品的提取 以引自美国的全雌系厚皮甜瓜“WI998”为母本，东北农业大学西甜瓜育种实验室的雌雄异花同株薄皮甜瓜“3-2-2”为父本，采用单粒传的方法获得甜瓜重组自交系群体，用CTAB法提取重组自交系群体各家系叶片的总DNA ；二、PCR 反应a、PCR 反应体系 20 μ L :反应液组成为IOXBuffer (含 Mg2+15mmol/L) 2 μ L，dNTPs (10mmol/L) O. 3 μ L，模板 DNA (30ng/y I) I μ L，甜瓜 SSR 正反向引物(2pM)各 I μ L，TaqDNA 聚合酶(2U/μ I)O. 2yL (购买自上海生工公司)，无菌去离子水15. 5yL;b、PCR反应条件SSR 标记 PCR 扩增程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 Imin ;55°C退火 30s ；72°C延伸90s ；37个循环；最后72°C延伸IOmin ;4°C保存。三、PCR产物的检测I)制胶将凝胶模具放在水平的超净工作台上，凝胶托盘的规格25 X 20cm，在中间插一个隔板，并在边缘和中间各插入一排梳子，称取7. 5g的Metaphor或Invitrigen琼脂糖粉末至500mL的三角瓶中，加入250mL的I X TAE电泳缓冲液中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全融化，冷却至60°C以下，再在瓶中加入IOOyL的EB (浓度为I μ g/mL)充分混匀，混和时注意不要用力过猛，防止凝胶中混入气泡，将溶胶倒入模具，由于凝胶浓度高，倒胶时要迅速，防止凝胶凝结厚度不均匀，凝固后，即成为凝胶；2)多重点样和双层电泳拔出凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入IXTAE电泳缓冲液(预先4度冷却)至液面能覆盖2层凝胶f 2mm，用8道或12道移液器吸取4. 5 μ L的含上样缓冲液的PCR产物加入凝胶孔中，待此层凝胶(下层凝胶)上样完成后，接通电源，调节电压至4 5V/cm，待上样缓冲液跑出点样孔Icm (时，切断电源，在此层凝胶上再放一层凝胶(上层凝胶)，同样的上样方法给上层凝胶上样完成后，通电电泳，待上样缓冲液跑出点样孔Icm后，切断电源，在下层凝胶的点样孔二次点样，点样结束后开始电泳，同理依次对下层凝胶点样、电泳，然后对上层凝胶点样、电泳，按照此方法，进行点样、电泳，直至第八次点样、电泳结束为止；
3)分次检测将步骤2)电泳完毕的凝胶至于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的DNA条带，在电脑中观察并保存图像，若有样品在电泳中还没有分开，可将凝胶放入电泳缓冲液中继续电泳，再次检测，再在电脑中观察并保存图像。结果显示如图2至图7所示，图2显示单次点样的电泳结果，图3飞显示了 2次、3 次、4次和5次点样和双层电泳后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图7为5次点样和双层电泳后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，经验证，一块凝胶可以至少3重点样并结合双层电泳，依然能保证电泳条带清晰、分辨率高、重复性好。
权利要求
1.一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，其特征在于多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法是按照以下步骤进行的 一、利用微卫星分子标记对不同群体或群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，得待检测扩增产物； 二、制备同样面积的两块3%的琼脂糖凝胶，取其中一块3%的琼脂糖凝胶作为下层琼脂糖凝胶，另一块3%的琼脂糖凝胶平行放置在下层琼脂糖凝胶上，作为上层琼脂糖凝胶，将下层琼脂糖凝胶与上层琼脂糖凝胶放入电泳缓冲液中，备用； 三、取步骤一中待检测扩增产物在下层琼脂糖凝胶上样后，进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳； 四、在下层琼脂糖凝胶的凝胶孔继续上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳；然后在上层琼脂糖凝胶上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为f 2cm时，切断电源，停止电泳； 五、重复步骤四的操作，直至待检测的扩增产物跑到凝胶底部时，切断电源，停止电泳； 六、采用紫外凝胶成像系统对电泳结果进行检测，即完成多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳。
2.根据权利要求I所述的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，其特征在于步骤一至步骤五中电泳的电压为7 8V/cm。
3.根据权利要求I所述的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，其特征在于步骤二中所述的电泳缓冲液温度为(T4°C。
全文摘要
一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，它涉及一种检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，本发明要解决现有微卫星DNA电泳检测时造成琼脂糖粉和电泳缓冲液大量浪费，以及EB的利用率低的问题。本发明的方法为将同样面积的两块琼脂糖凝胶，平行放置在上下两层；依次对下层和上层凝胶点样、电泳，直至检测的扩增产物跑到凝胶底部时，停止电泳，然后进行凝胶成像检测。本发明的方法极大提高了琼脂糖凝胶和电泳缓冲液的利用率，节约了人力和成本。与单次点样比较，不需要重新制备凝胶，10cm长的一块凝胶可重复点样8次，节省成本8倍以上。从而实现了快速、高效检测植物SSR标记位点遗传变异。
文档编号G01N27/447GK102967644SQ201210490639
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者高美玲, 袁成志, 王世发, 王芳, 赵芳芳 申请人:齐齐哈尔大学