专利名称：动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统及方法
技术领域：
本发明涉及研究和分析与伤口愈合相关的细胞与分子机理的领域，尤其涉及一种动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统及方法。
背景技术：
伤口愈合实验已经在组织培养和组织工程中开展了很多年，主要被用于监测和研究各种细胞，如肿瘤细胞、上皮细胞、肝细胞等的行为，以评价在不同细胞培养条件下的细胞增殖和迁移能力，还是一种研究和评价药物、生化试剂或生物分子作用效果或作用机理的重要手段。现有的常规的技术方法是使用动物模型开展实验，实验人员在活体动物的表皮制造伤口，然后包覆药物，经过几次反复换药和观察，从而得到结论。此类方法的缺点是实验过程麻烦，所需试剂量大，并且由于是活体动物实验，结果的一致性和重复性难以保证。利用成像的方法开展伤口愈合实验，现有的突出的技术手段包括光学成像和生物电子学成像。光学成像的方法最常见的是用光学显微镜拍摄图像或者影像记录伤口愈合的整个过程中的变化。它虽然是一种简便易行的方法，但是只能用作定性地观察和粗略地估算，而不能定量地观察单个细胞的贴附、迁移等状态和行为。生物电子学是涉及生物材料和电子装置的交叉领域，已成功应用于细胞和生物分子的分析和检测。一种生物电子学的用于监测伤口愈合的技术方法是将细胞培养在微电极上，通过测量细胞在微电极上贴附和迁移时导致的电极间的阻抗的改变来实时监测伤口愈合过程。这类方法的不足是实验结果的好坏依赖于微电极的结构和布局的设计，并且加工成本较高；同时，细胞在微电极表面的分布情况也限制了使用该类装置和方法检测的一致性和重复性。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够同时定性和定量地动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统及方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统，它包括光学显微镜、CCD相机、传感器单兀、加热片、电动载物台、光导管、激光聚焦物镜、激光二极管控制器、载物台控制器、温控仪、锁相放大器和恒压仪等；其中，所述光学显微镜的上部具有一个观察物镜；观察物镜的镜头朝下，用于对进入CCD相机的光束进行聚焦；CCD相机装配在光学显微镜的上方，用于拍摄图像或者影像；传感器单元由环氧树脂胶结剂固定在加热片的上表面，用于测量细胞阻抗；加热片放置在电动载物台的上表面， 并由电动载物台上的玻片夹固定，用于给传感器单元加热，加热片的中心具有一方形通光孔；电动载物台装配在光学显微镜的中部，正面朝上，用于承载传感器单元和加热片，电动载物台的中心具有一方形通光孔；光导管装配在光学显微镜的下部基座上，用于向上传导激光束；激光聚焦物镜装配在光导管上方，镜头朝上，用于聚焦激光束；激光二极管控制器与光导管相连；载物台控制器与电动载物台相连；温控仪与加热片相连，用于控制加热片发热，维持传感器单元的温度恒定；锁相放大器与传感器单元相连，用于给传感器单元施加激励信号，同时检测响应信号；恒压仪与传感器单元相连，用于给传感器单元施加恒定电压信号。进一步地，所述传感器单元包括钼丝电极、Ag/AgCl电极和电解液-绝缘层-半导体结构的半导体芯片；该芯片的结构又包括绝缘层、掺杂杂质的硅片层、欧姆接触层等；钼丝电极与锁相放大器相连，Ag/AgCl电极与恒压仪相连，样品细胞和细胞培养液置于绝缘层上，钼丝电极和Ag/AgCl电极均插入细胞培养液中，分别用作细胞阻抗测量时的对电极和参考电极；掺杂杂质的硅片层通过杂质掺杂成为P型或N型半导体；绝缘层通过热氧化生长在掺杂杂质的硅片层的上表面；欧姆接触层20通过溅射沉积在掺杂杂质的硅片层的下表面。—种应用上述系统对伤口愈合进行动态细胞阻抗成像的方法，该方法包括以下步骤
(1)将样品细胞种植到传感器单元的上表面，即绝缘层的上表面，并培养2-4天；
(2)使用医用移液枪或者手术刀或者其它尖端尺寸微小并且较硬的无细胞毒性的工具，在传感器单元上表面刮擦取走一部分细胞，形成伤口 ；
(3)激光二极管控制器发射的激光束由光导管传导至激光聚焦物镜，并由激光聚焦物镜聚焦后照射到传感器单元的下表面；
(4)载物台控制器控制电动载物台连同固定在其上的加热片和传感器单元一起水平移动至激光照射的位置上没有样品细胞贴附的位置，锁相放大器对此位置进行测量，计算得到的阻抗值作为基准阻抗值，记作Ztl ；
(5)载物台控制器控制电动载物台连同固定在其上的加热片和传感器单元一起在水平平面内自动移动，形成一系列激光照射位置，每次移动的距离小于单个细胞尺度；
(6)锁相放大器对上述每一激光照射位置进行测量，计算得到这些点的细胞阻抗值Zp
(7)将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如测量的第一个像素点的数值为(Z1- Z0)/ Ztl，再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；
(8)重复上述步骤4，此时得到的基准阻抗值为Ztl’；
(9)计算细胞阻抗补偿因子f=Z0’ / Z0，用以补偿由于样品细胞的总数目或者贴附情况等随时间发生变化引入的单个像素点测量时相比于第一幅细胞阻抗图像中该像素点的
误差;
(10)重复上述步骤5-6，此时得到的细胞阻抗值为Z/、Z2’、Z3,、I、Z5’、……；
(11)重复上述步骤7，将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值后再乘以细胞阻抗补偿因子f，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如此时得到的第一个像素点的数值将为f (Z/ - Zc/)/ Ztl'再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；
(12)顺序循环重复上述步骤8-11，直至步骤2中形成的人为伤口愈合完成后停止，从而得到一系列反应伤口愈合过程的时间上连续的细胞阻抗图像及其对照图像。
本发明的有益效果是
I、本发明的系统及其方法可以对伤口愈合的过程以数值作为像素点内容成像，从而能够定量反映伤口的大小，伤口愈合的速度、方向和质量。2、本发明的系统及方法可用于动态监测群细胞的贴附、增殖和伸展形成致密连接的行为过程，亦可用于动态监测单个细胞的贴附和迁移运动。3、本发明的系统及方法还可用于动态监测药物、生化试剂或生物分子作用下的伤口愈合状况，从而鉴别、分析和评价这些物质的作用效果和作用机理。


图I是本发明的系统结构图2是本发明传感器单元的阻抗检测原理图3是本发明伤口愈合的细胞阻抗成像方法图中，光学显微镜I、观察物镜2、CCD相机3、传感器单元4、加热片5、电动载物台6、光导管7、激光聚焦物镜8、激光二极管控制器9、载物台控制器10、温控仪11、锁相放大器12、 恒压仪13、钼丝电极14、Ag/AgCl电极15、细胞培养液16、样品细胞17、绝缘层18、半导体 19、欧姆接触20、细胞贴附轮廓21、人为伤口 22。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
进一步详细描述本发明。如图I所示，本发明动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统包括光学显微镜I、 CCD相机3、传感器单元4、加热片5、电动载物台6、光导管7、激光聚焦物镜8、激光二极管控制器9、载物台控制器10、温控仪11、锁相放大器12、恒压仪13。其中，光学显微镜I的上部具有一个观察物镜2 ;观察物镜2的镜头朝下，用于对进入CCD相机3的光束进行聚焦；CCD 相机3装配在光学显微镜I的上方，用于拍摄图像或者影像；传感器单元4由环氧树脂胶结剂固定在加热片5的上表面，用于测量细胞阻抗；加热片5放置在电动载物台6的上表面， 并由电动载物台6上的玻片夹固定，用于给传感器单元4加热，加热片5的中心具有一方形通光孔；电动载物台6装配在光学显微镜I的中部，正面朝上，用于承载传感器单元4和加热片5，并且能够在其内部的步进电机的驱动下在水平平面内精细位移，电动载物台6的中心具有一方形通光孔；光导管7装配在光学显微镜I的下部基座上，用于向上传导激光束； 激光聚焦物镜8装配在光导管7上方，镜头朝上，用于聚焦激光束，聚焦后的激光束穿过电动载物台6中心的通光孔和加热片5中心的通光孔照射到传感器单元4的下表面；激光二极管控制器9与光导管7相连，用于产生激光和调制激光的强度；载物台控制器10与电动载物台6相连，用于接收用户的编程命令，之后控制电动载物台6按照编程命令设定的路径水平移动；温控仪11通过与加热片5相连，用于控制加热片5发热，维持传感器单元4的温度恒定；锁相放大器12与传感器单元4相连，用于给传感器单元4施加激励信号，同时检测响应信号；恒压仪13与传感器单元4相连，用于给传感器单元4施加恒定电压信号。如图2所示，传感器单元4包括钼丝电极14、Ag/AgCl电极15、电解液-绝缘层-半导体(EIS)结构的半导体芯片，该芯片的结构又包括绝缘层18、掺杂杂质的硅片层 19、欧姆接触层20。钼丝电极14与锁相放大器12相连，Ag/AgCl电极15与恒压仪13相连，样品细胞17和细胞培养液16置于绝缘层18上，钼丝电极14和Ag/AgCl电极15均插入细胞培养液16中，分别用作细胞阻抗测量时的对电极和参考电极。样品细胞17，典型的如肿瘤细胞、上皮细胞、肝细胞以及能发生贴附生长和迁移运动的其它细胞。半导体芯片采用微机电加工工艺制造而成，具体地说，绝缘层18通过热氧化生长在掺杂杂质的硅片层19的上表面；掺杂杂质的硅片层19通过杂质掺杂成为P型或N型半导体；欧姆接触层20为强导电性的金属材料，如金属铝，通过溅射沉积在掺杂杂质的硅片层19的下表面。本发明利用了上述半导体芯片的内光电效应，即当半导体受到一定波长的光照射时，半导体吸收光子， 发生禁带到导带的跃迁，产生了电子空穴对。当在半导体芯片的上下表面施加偏置电压时， 掺杂杂质的娃片层19中产生耗尽层，电子和空穴被耗尽层的内电场分离，同时耗尽层外的电子空穴对中的一部分总能在未重新复合前扩散进入耗尽层，此过程中电子空穴对的移动形成光生电流。具体地说，锁相放大器12通过位于其上的对电极信号端子CE施加交流电压小信号到钼丝电极14上，同时它的工作电极信号端子WE与欧姆接触层20相连，能够检测半导体芯片的响应电流信号，根据这一电流信号大小就能换算得到上述回路中的阻抗大小；恒压仪13通过位于其上的参考电极信号端子RE施加直流偏置电压信号到Ag/AgCl电极15上，使半导体内部产生耗尽层；经过激光聚焦物镜8聚焦后的激光束照射到半导体芯片的下表面，使得该照射位置的局部光生电流变大。当样品细胞17在半导体芯片上表面贴附、伸展形成致密连接时，会阻碍检测回路和激光照射区域的电流信号通过，使得测量得到的回路阻抗值变大。反之当样品细胞17从半导体芯片上表面脱附或迁移到别处时，原激光照射位置的阻抗值将变小。将激光照射在没有细胞贴附的位置时测得的阻抗值记作基准阻抗值，将激光照射在有细胞贴附的位置时测得的阻抗值记作细胞阻抗值，利用本发明的系统及方法就可以实现对单个细胞的贴附和迁移行为的动态监测。如图3所示，本发明提供了利用本发明的系统对伤口愈合进行动态细胞阻抗成像的方法。该方法的具体实施步骤包括
1、将样品细胞17种植到传感器单元4的上表面，即绝缘层18的上表面，并培养2-4
天;
2、使用医用移液枪或者手术刀或者其它尖端尺寸微小并且较硬的无细胞毒性的工具， 在传感器单元4上表面刮擦取走一部分细胞，形成伤口 22 ；
3、激光二极管控制器9发射的激光束由光导管7传导至激光聚焦物镜8，并由激光聚焦物镜8聚焦后照射到传感器单元4的下表面；
4、载物台控制器10控制电动载物台6连同固定在其上的加热片5和传感器单元4一起水平移动至激光照射的位置上没有样品细胞17贴附的位置，锁相放大器12对此位置进行测量，计算得到的阻抗值作为基准阻抗值，记作Ztl ；
5、载物台控制器10控制电动载物台6连同固定在其上的加热片5和传感器单元4一起在水平平面内自动移动，形成一系列激光照射位置，每次移动的距离小于单个细胞尺度；
6、锁相放大器12对上述每一激光照射位置进行测量，计算得到这些点的细胞阻抗值 Z1-, Z2 > Z3 > Z4 > Z5-,......；
7、将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如测量的第一个像素点的数值为( - Z0)/ Ztl，再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机3拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；
8、重复上述步骤4，此时得到的基准阻抗值为Ztl’；
9、计算细胞阻抗补偿因子f=Zc// Ztl，用以补偿由于样品细胞17的总数目或者贴附情况等随时间发生变化引入的单个像素点测量时相比于第一幅细胞阻抗图像中该像素点的误差；
10、重复上述步骤5-6，此时得到的细胞阻抗值为Z/、z2’、Z/、τ:、τ、……；
11、重复上述步骤7，将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值后再乘以细胞阻抗补偿因子f，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如此时得到的第一个像素点的数值将为(Z/ - Zc/)/ Ztl'再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机3拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；
12、顺序循环重复上述步骤8-11，直至步骤2中形成的人为伤口22愈合完成后停止，从而得到一系列反应伤口愈合过程的时间上连续的细胞阻抗图像及其对照图像。从图3所示的其中一幅典型细胞阻抗图像示意图中可以看出，细胞阻抗图像可以直观地描绘出细胞贴附的全貌，包括细胞贴附的轮廓和伤口的形态以及大小。由于进行了连续地绘图，本发明的系统还能够监测伤口愈合的动态参数，包括伤口愈合的速度、愈合的方向；进一步的，本发明的系统还能够定性和定量地评价伤口愈合的好坏；能够评价和分析药物、生化试剂或生物分子对伤口愈合的作用效果和作用机理。本发明所述系统及其方法并不限于上述具体实施方式
中的实施方案，根据本发明的技术方案得到的其它实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。
权利要求
1.一种动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统，其特征在于，它包括光学显微镜(I)、 C⑶相机(3)、传感器单元(4)、加热片(5)、电动载物台(6)、光导管(7)、激光聚焦物镜(8)、 激光二极管控制器(9)、载物台控制器(10)、温控仪(11)、锁相放大器(12)和恒压仪(13) 等；其中，所述光学显微镜(I)的上部具有一个观察物镜(2);观察物镜(2)的镜头朝下，用于对进入(XD相机(3)的光束进行聚焦；(XD相机(3)装配在光学显微镜(I)的上方,用于拍摄图像或者影像；传感器单元(4)由环氧树脂胶结剂固定在加热片(5)的上表面，用于测量细胞阻抗；加热片(5)放置在电动载物台(6)的上表面，并由电动载物台(6)上的玻片夹固定，用于给传感器单元(4)加热，加热片(5)的中心具有一方形通光孔；电动载物台(6)装配在光学显微镜(I)的中部，正面朝上，用于承载传感器单元(4)和加热片(5)，电动载物台(6)的中心具有一方形通光孔；光导管(7)装配在光学显微镜(I)的下部基座上，用于向上传导激光束；激光聚焦物镜(8)装配在光导管(7)上方，镜头朝上，用于聚焦激光束；激光二极管控制器(9)与光导管(7)相连；载物台控制器(10)与电动载物台(6)相连；温控仪(11) 与加热片(5)相连，用于控制加热片(5)发热，维持传感器单元(4)的温度恒定；锁相放大器 (12)与传感器单元(4)相连，用于给传感器单元(4)施加激励信号，同时检测响应信号；恒压仪(13 )与传感器单元(4 )相连，用于给传感器单元(4 )施加恒定电压信号。
2.根据权利要求I所述动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统，其特征在于，所述传感器单元(4)包括钼丝电极(14)、Ag/AgCl电极(15)和电解液-绝缘层-半导体结构的半导体芯片；该芯片的结构又包括绝缘层(18)、掺杂杂质的硅片层(19)、欧姆接触层(20) 等；钼丝电极(14)与锁相放大器(12)相连，Ag/AgCl电极(15)与恒压仪(13)相连，样品细胞(17)和细胞培养液(16)置于绝缘层(18)上，钼丝电极(14)和Ag/AgCl电极(15)均插入细胞培养液(16)中，分别用作细胞阻抗测量时的对电极和参考电极；掺杂杂质的硅片层 (19)通过杂质掺杂成为P型或N型半导体；绝缘层(18)通过热氧化生长在掺杂杂质的硅片层(19)的上表面；欧姆接触层(20)通过溅射沉积在掺杂杂质的硅片层(19)的下表面。
3.一种应用权利要求I所述系统对伤口愈合进行动态细胞阻抗成像的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)将样品细胞(17)种植到传感器单元(4)的上表面，即绝缘层(18)的上表面，并培养2-4天；(2)使用医用移液枪或者手术刀或者其它尖端尺寸微小并且较硬的无细胞毒性的工具，在传感器单元(4)上表面刮擦取走一部分细胞，形成伤口(22)；(3)激光二极管控制器(9)发射的激光束由光导管(7)传导至激光聚焦物镜(8)，并由激光聚焦物镜(8)聚焦后照射到传感器单元(4)的下表面；(4)载物台控制器(10)控制电动载物台(6)连同固定在其上的加热片(5)和传感器单元(4) 一起水平移动至激光照射的位置上没有样品细胞(17)贴附的位置，锁相放大器(12) 对此位置进行测量，计算得到的阻抗值作为基准阻抗值，记作Ztl ；(5)载物台控制器(10)控制电动载物台(6)连同固定在其上的加热片(5)和传感器单元(4) 一起在水平平面内自动移动，形成一系列激光照射位置，每次移动的距离小于单个细胞尺度；(6)锁相放大器(12)对上述每一激光照射位置进行测量，计算得到这些点的细胞阻抗(7)将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如测量的第一个像素点的数值为(Z1- Z0)/ Ztl，再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机(3)拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；(8)重复上述步骤4，此时得到的基准阻抗值为Ztl’；(9)计算细胞阻抗补偿因子f=Z0V Ztl，用以补偿由于样品细胞(17)的总数目或者贴附情况等随时间发生变化引入的单个像素点测量时相比于第一幅细胞阻抗图像中该像素点的误差；(10)重复上述步骤5-6，此时得到的细胞阻抗值为Z/、Z2’、Z3,、I、Z5’、……；(11)重复上述步骤7，将每一位置点的细胞阻抗值与基准阻抗值作差再除以基准阻抗值后再乘以细胞阻抗补偿因子f，作为细胞阻抗图像的一个像素点的数值，如此时得到的第一个像素点的数值将为f (Z/- Z0O/ Ztl'再将所有像素点按照相互间的实际位置关系组合成为一幅细胞阻抗图像；CCD相机(3)拍照记录下此时的细胞分布形态，作为对照图像；(12)顺序循环重复上述步骤8-11，直至步骤2中形成的人为伤口(22)愈合完成后停止，从而得到一系列反应伤口愈合过程的时间上连续的细胞阻抗图像及其对照图像。
全文摘要
本发明公开了动态监测伤口愈合的细胞阻抗成像系统及方法，所述伤口愈合包括伤口形成后细胞脱离其原先贴附的位置发生迁移运动，在新的位置重新贴附并和周围细胞形成致密连接，最终完成伤口愈合的整个动态过程。利用本发明可以测量得到以细胞阻抗值相对基准阻抗值的变化率作为像素点内容的一系列高分辨率数值图像，从而研究、分析与伤口愈合相关的细胞和分子机理。
文档编号G01N21/84GK102586092SQ20121002954
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者吴成雄, 周洁, 哈达, 王平, 胡宁 申请人:浙江大学