专利名称：定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于免疫測定法，具体是ー种是以多孔酶标板做载体制备固相抗原，用于定量检测人血清促甲状腺素受体抗体(TRAb)特别是以甲状腺刺激阻断性抗体(TSBAb)为主的酶联免疫分析(ELISA)试剂盒及检测方法。
背景技术：
自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)是一组发病机制复杂的器官特异性自身免疫疾病，包括Graves病(Graves’ disease,⑶)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’ s thyroiditis, HT)等。人促甲状腺激素受体(hTSHR)是AITD的主要革巴抗原，在AITD的发病中起重要作用。hTSHR是存在人甲状腺滤泡上皮细胞(TEC)膜上的ー种 糖蛋白，它与促甲状腺素(TSH)结合后，调节TEC的生长、分化及其合成和释放甲状腺激素的功能。在环境和遗传因素基础上，机体免疫功能异常变化导致AITD，hTSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激机体产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)，该自身抗体属于异质性抗体，包括甲状腺阻断性抗体(TSBAb)和甲状腺刺激性抗体(TSAb)，前者与TSHR特异位点结合而阻止TSH与TSHR的结合及其生理作用的发挥，导致甲状腺萎縮和功能下降，表现为甲状腺功能減退(甲減)，多见于HT的后期；后者模拟TSH功能，长期持续地刺激甲状腺激素合成释放而导致GD，表现为甲状腺功能亢进。TRAb抗原决定簇主要贯穿于hTSHR膜外区(hTSHR-ecd)，是不连续的位点，相互穿插、重叠。TSBAb的抗原决定簇主要集中于hTSHR膜外区羧基端(C端)。TSBAb与Hashimoto’甲状腺炎(HT)甲状腺功能减退关系密切。患者血清中TSBAb与TSHR结合后阻断细胞内腺苷环化酶系统，通过影响第二信使环-磷酸腺苷(cAMP)的产生而引发自身免疫性甲状腺疾病的异常甲状腺功能(甲減)状态。另外，TSH可以下调Fas在甲状腺上皮细胞的表达，而TSBAb则通过抑制TSH的作用，增加TEC对Fas介导的凋亡的敏感性，造成HT时甲状腺组织的破坏及萎縮。TSBAb广泛存在自身免疫性甲减患者血清中。因此，检测人血清TSBAb对AITD特别是HT的诊断、疗效评价均有重要意义。此外，研究表明⑶患者体内既有TSAb，又有TSBAb，而最后的生物学效应取决于这两种抗体相对量及其与TSHR的亲和力，TSBAb的产生是GD甲亢向甲减自发性转化的可能因素，它可由TSAb生物活性转化而来，或与TSAb共存于甲减患者血清中。检测TSBAb对GD治疗方案的制定、指导治疗有重要的临床參考价值。目前，没有比较满意的国产TRAb检测技木。国外引进的相关技术有2种，⑴放射受体法(RRA) (2)酶免法，均不能区分TSBAb和TSAb，特别是RRA阳性检出率较低，而价格十分昂贵，至今在国内未能推广。国外还有ー种生物学分析法能区分TSBAb与TSAb，但方法烦琐，流程长且价格昂贵，只能用于科研，不宣常规使用。近年又有关于发光生物学分析法的报道，可用于检测TSBAb。其特点是利用分子生物学技术建立TSHR基因与荧光素酶报告基因共转染且能稳定表达的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，借光产量的測定检测TSBAb活性。该方法目前是初步研究，技术尚未成熟，还不能用于临床常规检測。

发明内容
本发明就是为了解决目前人血清TRAb特别是TSBAb的检测阳性检出率较低，抑或价格十分昂贵问题，而提供一种灵敏度高、特异性好、操作简便、一次可测定大量样品的定量人血清TRAb (以TSBAb为主)酶联免疫检测试剂盒及检测方法。本发明是基于免疫反应和酶促反应，能够检测人血清中TRAb(以TSBAb为主)含量，其測定原理是用重组人促甲状腺素受体膜外区羧基端片段融合蛋白(TrxFus-hTSHRc)做抗原包被96孔酶标板，用含I. 0%-5. 0%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐漂洗液(PBST)封闭，然后分别加入待测血清样品和标准液，其中TRAb特别是TSBAb与包被在固相载体上的抗原特异性结合，未结合成分经漂洗去除，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG第二抗 体，进行二次抗原抗体反应，经漂洗去除未结合成分后，加显色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在HRP催化下显色，最后加入終止液终止显色反应，显色深浅与样品中待测物含量成正比，在酶标仪上測定450纳米波长处的吸光度值(0D450nm)，通过标准曲线计算待测样品中的TRAb (以TSBAb为主)浓度。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。ー种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，该试剂盒内收容有预包被重组hTSHR膜外区羧基端片段融合蛋白抗原(TrxFus-hTSHRc)的96孔酶标板，以及瓶装的以下试剂磷酸盐漂洗液，封闭液，样品稀释液，促甲状腺素受体抗体标准液，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG第二抗体，显色底物四甲基联苯胺、反应终止液2M硫酸(H2SO4)和质控血清。
所述定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其96孔酶标板预包被抗原是重组的人促甲状腺激素受体膜外区羧基端片段融合蛋白，是经以下重量份数比的原料制成PH9. 6的碳酸盐缓冲液包被的，碳酸钠O. 79份、碳酸氢钠I. 47份、去离子水500份。所述定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其磷酸盐漂洗液是按以下重量份数比的原料制成PH7. 4的液体，磷酸ニ氢钾O. 3份、磷酸氢ニ钠3. 6份、氯化钠8. O份、氯化钾O. 2份、吐温-20 O. 5份和去离子水1000份配制成。
所述定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其封闭液是按重量百分比，含1.0-5.0%牛血清白蛋白的磷酸盐漂洗液。所述定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其样品稀释液是按以下重量份数比的原料制成PH7. 4液体，磷酸ニ氢钾O. 3份、磷酸氢ニ钠3. 6份、氯化钠8. O份、氯化钾O. 2份、吐温-20 O. 5份、牛血清白蛋白10-15份、去离子水1000份。所述ー种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其促甲状腺素受体抗体标准液是促甲状腺素受体抗体阳性血清用样品稀释液配制而成，浓度分别是200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，lOAU/ml。如权利要求I所述ー种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析的检测方法，其特征在于该试剂盒是按以下步骤检测的①取出已预包被抗原的96孔酶标板，待测血清用样品稀释液稀释100倍，每孔加稀释后的待测血清100 μ I ;标准曲线各孔分别加浓度为200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，10AU/ml的标准液100μ 1，37°C温育I小时；
②甩掉反应液，每孔用200-300μ I磷酸盐漂洗液洗3次，拍干；
③每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG第二抗体100μ1，37°C温育I小时；
④甩掉反应液，每孔用200-300μ I磷酸盐漂洗液洗6次，拍干；
⑤每孔加显色底物四甲基联苯胺100μ1，37°C温育15分钟；
⑥每孔加反应终止液2MH2SO4 50 μ 1，混匀后30分钟内在酶标仪上測定吸光度值；
⑦在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对 数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中TRAb且以TSBAb为主的浓度值。本发明的优点；
I、本发明试剂盒以TSBAb抗原决定簇相对集中的重组TrxFus-hTSHRc做包被抗原，检测的人血清TRAb是以TSBAb为主，对HT患者阳性检出率高。2、本发明试剂盒实现了人血清TRAb (以TSBAb为主)的定量測定，測定结果精确、客观。3、本发明试剂盒灵敏、稳定、方法简便，对AITD特别是HT的诊断、指导治疗及疗效评价有重要意义，对GD治疗方案的制定、方法的选择有重要的临床參考价值，且价格低廉，易于推广应用，解决了广大临床医师的迫切要求。


图I是检测人TRAb (以TSBAb为主)标准曲线 图2是TrxFus-hTSHRc与人TRAb、人甲状腺过氧化物酶抗体(hTP0_Ab))剂量一反应曲线图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。主要试剂及原料
1.重组hTSHR膜外区羧基端片段融合蛋白抗原(自行制备)
2.碳酸盐缓冲液(自行制备)
3.磷酸盐漂洗液(PBST)(自行制备)
4.封闭液(自行制备)
5.促甲状腺素受体抗体标准液(自行制备)
6.样品稀释液(自行制备)
7.HRP标记的羊抗人IgG第二抗体(市售)
8.显色底物四甲基联苯胺(TMB)(市售)
9.反应终止液2MH2SO4 (自行制备)
10.质控血清(自行制备)
一、重组hTSHR膜外区羧基端片段融合蛋白(TrxFus-hTSHRc)抗原的制备 UfhTSHRc基因构建到PET102/D质粒，转化到大肠杆菌(万.Cb7iBL21 Star (DE3))表达菌中，37°C异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，收集表达菌体。2、用裂解液和4°C超声破碎裂解包涵体，离心后保留上清液，Ni2 + -NTA亲和层析纯化。3、梯度透析复性、浓缩，得到纯度90%以上的重组TrxFus-hTSHRc融合蛋白抗原。ニ、包被多孔酶标板的制备
I、将重组TrxFus-hTSHRc融合蛋白抗原用抗原包被碳酸盐缓冲液(O. 79克碳酸钠、
I.47克碳酸氢钠、500毫升去离子水，ρΗ9· 6)稀释至100ng/100 μ I -2 μ g/100 μ I。2、每孔加稀释后的抗原液100 μ 1，4°C过夜包被。
3、甩掉包被液，用磷酸盐漂洗液(PBST) (O. 3克磷酸ニ氢钾、3. 6克磷酸氢ニ钠、
8.O克氯化钠、O. 2克氯化钾、O. 5毫升吐温-20、1000毫升去离子水，pH7. 4)漂洗3次，每次每孔加漂洗液200-300 μ 1，再按重量百分比，用含1.0-5. 0% BSA的PBST封闭液封闭，每孔加封闭液100μ 1，25-37°C温育I小时。4、甩掉封闭液，再用漂洗液漂洗3次，拍干后备用。
三、标准曲线的建立
取TRAb阳性血清，分装、冷冻干燥，-30°C避光保存，即标准品备用。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)和国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)推荐的“临床实验室物质特性和单位命名规则”(PROPERTIES AND UNITS IN THE CLINIC LABORATORY SCIENCES I. SYNTAXAND SEMANTIC RULES, IUPAC-IFCC Recommendations 1995)并结合临床实践确定标准曲线各点浓度分别为 200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，10AU/ml。(AU 为 Arbitrary Unit)。以TRAb标准品浓度为横坐标(对数坐标)，以其对应的0D450nm值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标轴上做图建立标准曲线。结果见图I所示。四、质控血清的制备
取30例以上HT患者血清，混匀，用所述定量检测人血清促甲状腺素受体抗体(以甲状腺刺激阻断性抗体为主)的酶联免疫分析试剂盒反复多次測定，定值后分装、冷冻干燥，_30°C避光保存，即为质控血清。五、用试剂盒检测人血清TRAb (以TSBAb为主)操作步骤
1、取出已预包被抗原的96孔酶标板，待测血清用磷酸盐样品稀释液(0.3克磷酸ニ氢钾、3. 6克磷酸氢ニ钠、8. O克氯化钠、0. 2克氯化钾、0. 5毫升吐温-20、10-15克BSAU000毫升去离子水，PH7. 4)稀释100倍，每孔加稀释后的待测血清100μ I ;标准曲线各孔分别加各浓度(200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，10AU/ml)标准液 100 μ 1，37°C温育 I 小时。
2、甩掉反应液，每孔用200-300μ I磷酸盐漂洗液洗3次，拍干。3、每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG ニ抗100 μ 1，37°C温育I小时。4、甩掉反应液，每孔用200-300 μ I磷酸盐漂洗液洗6次，拍干。5、每孔加显色底物四甲基联苯胺(TMB) 100μ 1，37°C温育15分钟。6、每孔加反应终止液2M H2SO4 50 μ 1，混匀后30分钟内在酶标仪上测定吸光度值(0D450nm)。7、在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中TRAb (以TSBAb为主)的浓度值。六、试剂盒性能指标I、灵敏度
重复测定20孔零标准品，计算出试剂盒检测灵敏度为5. 8AU/ml。
2、特异性
TRAb (以TSBAb为主)阳性血清和人甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)阳性血清分别稀释20倍、50倍、200倍、500倍后与TrxFus-hTSHRc进行结合反应。TRAb与抗原的剂量ー反应曲线显示随TRAb (以TSBAb为主)浓度增加，吸光度值逐渐升高且成直线关系，说明TrxFus-hTSHRc与人TRAb (以TSBAb为主)特异性结合；TP0_Ab与抗原的剂量一反应曲线显示随TPO-Ab浓度增加，吸光度值无明显变化且均为本底水平，说明TrxFus-hTSHRc与人TPO-Ab无特异性结合。结果见图2所示。
3、精密度 (I)批内变异一次实验中分别测定同一阳性质控血清和阴性质控血清各6样，计算批内变异(CV%)分别为3. 51%和4. 92%。(2)批间变异同一阳性质控血清和阴性质控血清，连续測定6次，计算批间CV%值分别为7. 57%和8. 02%。4、准确度
3份TRAb (以TSBAb为主)基质浓度均为9. 38AU/ml的样本分别加入35AU/ml、IOAU/ml、5AU/ml TRAb (以 TSBAb 为主)后，用本试剂盒实测浓度为 33. 9 AU/ml、9.8 AU/ml、5. 2AU/ml，计算回收率分别为96. 8%, 98. 0%、104. 0%，平均回收率99. 6%。七、本试剂盒临床检测结果
本试剂盒检测正常人TRAb (以TSBAb为主)浓度(i 土s)为10.70±1.61AU/ml，阳性
切点值为(i +2s)13. 93AU/ml，正常人阳性率2. 88%(6/208) ；Hashimoto甲状腺炎伴甲减患者 TRAb (以 TSBAb 为主)浓度(i 土s)为 25. 66± 10. 19AU/ml，阳性率 91. 92%(148/161);甲
亢患者 TRAb (以 TSBAb 为主)浓度(i 土s)为 13. 78±5. 71AU/ml，阳性率 31. 39%(27/86)。
Hashimoto甲状腺炎伴甲减患者TRAb (以TSBAb为主)浓度和阳性率均显著高于正常人和甲亢患者(P均〈O. 01);甲亢患者TRAb (以TSBAb为主)浓度与正常人无差异(p>0. 05)，但阳性率高于正常人(P〈0.01)。结果见表I所示。表I定量人血清TRAb (以TSBAb为主)ELISA临床检测结果
权利要求
1.一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于该试剂盒内收容有预包被重组人促甲状腺素受体膜外区羧基端片段融合蛋白抗原的96孔酶标板，以及瓶装的以下试剂磷酸盐漂洗液，封闭液，样品稀释液，促甲状腺素受体抗体标准液，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG第二抗体，显色底物四甲基联苯胺、反应终止液2M硫酸和质控血清。
2.如权利要求I所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于96孔酶标板预包被抗原是重组的人促甲状腺激素受体膜外区羧基端片段融合蛋白，是经以下重量份数比的原料制成PH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释后包被的，碳酸钠0.79份、碳酸氢钠I. 47份、去离子水500份。
3.如权利要求I所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于所述的磷酸盐漂洗液是按以下重量份数比的原料制成PH7. 4的液体，磷酸二氢钾0. 3份、磷酸氢二钠3. 6份、氯化钠8. 0份、氯化钾0. 2份、吐温-20 0. 5份和去离子水1000份配制成。
4.如权利要求I或3所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于封闭液是按重量百分比，含I. 0-5. 0%牛血清白蛋白的磷酸盐漂洗液。
5.如权利要求I所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于样品稀释液是按以下重量份数比的原料制成PH7. 4液体，磷酸二氢钾0. 3份、磷酸氢二钠3. 6份、氯化钠8. 0份、氯化钾0. 2份、吐温-20 0. 5份、牛血清白蛋白10-15份、去离子水1000份。
6.如权利要求I或5所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒，其特征在于促甲状腺素受体抗体标准液是促甲状腺素受体抗体阳性血清用样品稀释液配制而成，浓度分别是 200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，10AU/ml。
7.如权利要求I所述一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析的检测方法，其特征在于按以下步骤检测， ①取出已预包被抗原的96孔酶标板，待测血清用样品稀释液稀释100倍，每孔加稀释后的待测血清100 ill ;标准曲线各孔分别加浓度为200AU/ml，80AU/ml，40AU/ml，20AU/ml，10AU/ml的标准液100iU，37°C温育I小时； ②甩掉反应液，每孔用200-300u I磷酸盐漂洗液洗3次，拍干； ③每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG第二抗体100iil，37°C温育I小时； ④甩掉反应液，每孔用200-300u I磷酸盐漂洗液洗6次，拍干； ⑤每孔加显色底物四甲基联苯胺100iU，37°C温育15分钟； ⑥每孔加反应终止液2M硫酸50u 1，混匀后30分钟内在酶标仪上测定450纳米波长处的吸光度值； ⑦在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中人促甲状腺素受体抗体且以甲状腺刺激阻断性抗体为主的浓度值。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测人血清促甲状腺素受体抗体的酶联免疫分析试剂盒及检测方法。该试剂盒内有预包被重组人促甲状腺素受体膜外区羧基端片段融合蛋白抗原的96孔酶标板，以及瓶装的以下试剂磷酸盐漂洗液，封闭液，样品稀释液，促甲状腺素受体抗体标准液，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG第二抗体，显色底物四甲基联苯胺、反应终止液和质控血清。本发明检测的人血清促甲状腺素受体抗体是以甲状腺刺激阻断性抗体为主，对桥本甲状腺炎患者阳性检出率高，测定结果精确、客观、方法简便，易于推广应用。对自身免疫性甲状腺病的诊断、指导治疗及疗效评价有重要意义，对Graves病治疗方案的制定、方法的选择有重要的临床参考价值。
文档编号G01N33/68GK102735850SQ20121024400
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者方佩华, 李宁, 柴锦燕, 谭建, 陈慧 申请人:天津医科大学总医院