专利名称：NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于临床医学诊断领域,具体涉及一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒。
背景技术：
心力衰竭是一种常见的临床综合征，由于其严重性和高额的治疗护理费用，该病症的早期诊断显然是十分必要的。人们一直致力于寻找预测心力衰竭症状发生前标志物。 目前研究表明心肌细胞产生并分泌具有排钠利尿活性的肽心房来源的肽，其为de Bold 等人在大鼠中发现的ANP (心房钠尿肽)(Life Science 1981，vol. 28 (I) :89-94)和专利 EP 418 308的发明者及Sudoh等人(1988)Nature 332:78-81在猪和人中发现的BNP (脑钠尿肽)。人类BNP基因片段位于I号染色体断臂，其上游与ANP基因片段相连，由1900个核苷酸组成。mRN A含900-1000个核苷酸。表达产物含信号肽。信号肽降解后的产物为前体BNP (pro-BNP)，含108个氨基酸
HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLR APR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108。它在其分泌过程之前和/或之中在氨基酸Arg76和Ser77之间进行切割，从而被切割成BNP，也被称为BNP (77-108)或BNP-32或BNP (1-32)，以及该激素原的N端部分， BNP (1-76)，也被称为proBNP的N端片段或NT-proBNP。目前，体外诊断市场中比较权威和常用的NT-proBNP测试为Roche诊断公司的全自动Elecsys NT-proBNP检测。该检测原理是夹心反应及电化学发光检测，设计用于大规模中心实验室，并且为了进行测试，除了精确计量的液体试剂外，还需要相对复杂的仪器来定量液体和检测发光信号，操作比较繁琐和复杂。该检测的多克隆抗体(PAB)是NT-proBNP 的一种非常特别的部分，能够识别包括1-21和39-50位氨基酸的NT-proBNP的表位。然而，研究表明这些多克隆抗体不适用于采用颗粒标记例如胶体金作为标记物的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ 快速检测，因为由于快速检测的组分之间的物理化学相互作用，这类抗体在信号产生方面显示出令人不满意的可变性。这导致在不同批次间测试效果具有相当大的波动性。中国专利200410095878. 4提供了一种采用特殊抗体组合的用于测定NT-proBNP 的免疫快速测试，虽然解决了 EleCSyS NT-proBNP检测操作繁琐的特点。然而，其所采用的最优抗体组合MAB18.4. 34(27-31)与PAB (39-50)在敏感度和实际临床测试方面不尽如人意。Hughes, D.等，Clin. Sci. 96 (1999) 373-380，报道了由 proBNP 氨基酸 37-49 相应肽所产生的并与之反应的抗体并不与完整的内源proBNP反应。根据这样的测定，无法区别患有左心室功能障碍的患者和正常对照。因此，关于心力衰竭的早期诊断，对于改善用检测N-末端proBNP的试剂盒方法总存在着需求。

发明内容
本发明的目的是提供一种敏感度更高、更适宜用于临床检测的试剂盒，用于快速测定 NT-proBNP ο本发明的目的可通过以下技术方案予以实现
一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆抗体-颗粒标记物的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有相互平行的包被鼠抗人IgG抗体的控制线和检测线，所述检测线包被有与待检抗原特异性结合的抗体。本发明中采用的术语PAB (X-Y)表示一种多克隆抗体，其靶向包括X到Y位的氨基酸的NT-proBNP表位。MAB (X-Y)为一种靶向包括X至Y位氨基酸的NT-proBNP表位的单克隆抗体。所述抗体-颗粒标记物，优选MAB (10-39)被固定于颗粒标记物。所述颗粒标记物为彩色的乳胶、金属溶胶标记物、聚合物标记物或半导体纳米微晶体，优选金 标记物。所述包被膜抗体，优选PAB (59-71)包被在包被膜上。所述PAB (59-71)来源于免疫哺乳动物，尤其是绵羊、山羊或兔子。所述MAB (10-39)购自南京强欣生物技术有限公司。所述PAB (59-71)的制备方法，步骤如下
1)克隆如SEQID NO: I所示的基因片段；
2)利用步骤I)所得的基因片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化， 得到重组人NT-proBNP蛋白；
3)以步骤2)所得的重组人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，所得血清即抗人NT-proBNP蛋白总多克隆抗体；
4)采用固相合成法合成如SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
5)将步骤4)所得的多肽偶联到NHS-4柱子上，制得亲和层析柱；
6)将步骤3)所得抗人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ蛋白总多克隆抗体加入步骤5)制备好的亲和层析柱上，纯化，即得PAB (59-71)。所述颗粒如金、生物素等来标记抗体的方法，采用本领域熟练技术人员已知的方法，例如在中国专利201110044877. 7中详细描述了采用金标记的过程。本发明有益效果
本发明采用抗体组合MAB(10-39)与ΡΑΒ(59-71)制得的NT-proBNP快速诊断试剂盒， 具有敏感度高、临床相关性好等优点。附图

图I PAB(59-71)亲和层析洗脱记录图2间接ELISA法测定PAB (59-71)效价图3 SDS-PAGE电泳检测亲和层析得到的PAB (59-71)电泳图。图4 NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒优选实施例。图5 NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒的抗体组合MAB (10-39) /PAB (59-71)与专利 200410095878. 4 中抗体组合 MAB18. 4. 34 (27-31) /PAB (39-50)的函数曲线。
图6显示采用抗体组合MAB(10-39)/PAB(59-71)的NT-proBNP诊断试剂盒与 Elecsys NT-proBNP测试试剂盒的相关性。其中，图I 中，M 为蛋白 Marker，HC-PAB (59-71)为 PAB (59-71)的重链，LC-PAB (59-71)为PAB(59-71)的轻链；图4中，I、底衬；2、样品垫；3、聚酯膜；4、包被膜；5、吸水纸；
6、检测线；7、控制线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。实施例I重组NT-proBNP (1-76)的制备方法 I.重组 NT-proBNP (1-76)的克隆 我们提供需要扩增ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的基因序列SEQ ID Ν01,委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成该基因的核苷酸序列。所述基因序列SEQ ID NOl的5'端和3'端分别有及丽Y I 酶切位点5' GGATCC 3'和I酶切位点5' GTCGAC 3'，并克隆连接在pUC57载体上。所述需要扩增的目的基因序列SEQ ID NOl
ggatcccacc cgctgggcag cccgggtagc gccagcgacc tggaaacgag cggcctgcag 60 gagcagcgca accatctgca gggcaaactg agcgagctgc aggtggagca gaccagcctg 120 gagccgctgc aggagagccc gcgtccgacc ggtgtctgga agagccgcga ggtggccacc 180 gagggcatcc gtggccaccg caaaatggtc ctgtacaccc tgcgcgcacc gcgctaagtc 240 gac
243
将连接有NT-proBNP基因的pUC57和载体pET_32a用BamH I和Sal I双酶切后，分别回收酶切产物。在T4 DNA连接酶作用下定向将NT-proBNP基因片段连接。连接反应PCR 产物 3μ1, pET-32a 空载体 I μ l，2Xligation buffer 5μ I, T4 ligase I μ I。混匀后 16°C连接过夜，即得表达质粒pET-32a-proBNP。2. NT-proBNP在大肠杆菌中表达及纯化
将上述表达质粒pET-32a-proBNP，采用CaCl2法转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取菌落接种于50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C，220r/min震荡培养过夜，用菌液做 PCR鉴定，阳性克隆送测序验证。将上述测序正确的表达质粒pET-32a-proBNP，采用CaCl2法转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞，复苏后转接到含50 μ g/mL氨苄青霉素LB培养基过夜培养，次日以 1:100转接到新鲜的含有50 μ g/mL氨苄青霉素的的LB培养基中，于37°C，220r/min震荡培养至A600=0. 4 0.6时，加入IPTG使其终浓度为lmmol/L的，37°C诱导表达4h。4°C， 10000r/min,离心3min，收集沉淀，用PBS重悬，用超声波裂解菌体，并高速离心分离细菌上清和沉淀，上清使用HisTrap HP层析柱纯化重组蛋白。将获得的纯化重组蛋白用HisTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割buffer (50mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)，按 EK 酶与蛋白 4 μ g/IU 加入 EK 酶，25°C低速摇床(60r/ min)切割6h左右。切割后用切割Buffer平衡柱子,再用His-Binding buffer稀释后His Trap HP纯化，收集重组NT-proBNP蛋白，SDS-PAGE电泳进行鉴定。
实施例2抗原表位的分析及多肽的合成
以DNAstar软件分析NT-proBNP蛋白的原始氨基酸序列(共76个氨基酸)的抗原表位。主要采用4个参数，即Hopp&ffoods亲水性(hydrophilicity)、Welling抗原性 (antigenicity)、可及性(accessibility)和抗原表位(epitope)进行分析,然后综合各参数预测的结果确定采用本发明所用的抗原表位，即第59-71位氨基酸。采用固相法合成多妝，所述多妝序列 SEQ ID N02:Glu Gly He Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr0实施例3抗NT-proBNP的总多克隆抗体的制备
用重组ΝΤ-ρι·οΒΝΡ (参见实施例I)以及完全弗氏佐剂免疫绵羊。剂量为每只动物
O.Img0在10个月内，按4周的间隔重复免疫。第一次免疫后6周和其后每月一次,获取血清样品，测定其敏感性和效价。实施例4亲和层析法制备PAB (59-71)
I.亲和层析住的制备
O将合成的多肽(59-71)溶于偶联缓冲液(pH 8. 3、0· 2Μ NaHC03、0· 5M NaCl)；
2)使用前用10-15柱体积预冷的ImMHCL洗NHS-4 ；
3)用偶联缓冲液洗柱，使NHS-4达到最佳的结合环境；
4)将处理好的填料与溶解好的多肽混合均匀(填料与溶解好的多肽体积比为O.5:1)， 在室温下结合2 4h或者4°C过夜；
5)封闭用pH8. 5,0. IM的Tris-HCL缓冲液封闭，室温2 4h，或者4°C过夜；
6)酸碱缓冲液交替洗柱以pH8.5,0. IM的Tris-HCL缓冲液和pH 4.0,0. IM的醋酸盐、0. 5M的NaCl缓冲液交替洗柱，3个柱体积，3-6次；
7)20%的乙醇保存。2. PAB (59-71)的纯化
将抗 NT-proBNP 血清用结合缓冲液 IOmM PBS (2. 9g Na2HPCM ·12Η20、0· 2g KH2PO4,8. Og NaCl、0. 2g KC1、1000ml水)稀释10倍，缓缓加入上述制备好的亲和层析住。洗脱前，再用 10 15柱体积的结合缓冲液洗去不吸附的杂蛋白和非特异性结合的蛋白。然后用pH 2. 5、
0.IM的Gly-HCl洗脱缓冲液洗脱，同时收集样品洗脱液。将收集的样品洗脱液用pH9. O、 IM Tris-HCl中和至中性，最后将中和的样品洗脱液用IOmM的PBS透析。将含目的蛋白的洗脱液分部收集并进行SDS-PAGE检测。3.效价测定
将纯化的PAB (59-71)进行倍比稀释，用间接ELISA测定效价，方法同血清抗体效价测定。PAB (59-71)抗体效价均达到IO6。实施例5
如图4所示，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ双抗夹心快速诊断试剂盒，包括底衬1，以及底衬I上顺次相互搭接粘贴的样品垫2、涂覆有金标抗体的聚酯膜3、包被膜4及吸水纸5，包被膜4上包被有检测线6和控制线7，包被膜4中部平行设有一条包被PAB (59-71)的检测线6和一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线7，金标抗体为胶体金颗粒标记的MAB (10-39)。双抗夹心快速诊断试剂盒具体制作方法
I.包被I吴制备
I)包被缓冲液的制备将0. 025Μ、ρΗ7. 4的PBS，用0. 22 μ膜过滤，置于4°C备用，有效期7天；
2)封闭液的制备将含1%BSA,1%蔗糖，O. 025M、ρΗ7· 5的PBS，用O. 22 μ膜过滤，置于 4°C备用，有效期3天；
3)PAB (59-71)检测线的制备将上述亲和层析制得的PAB (59-71)按2mg/ml的浓度， 螺动泵授液量O. 4ml/min,划线速度50m/20min,在干燥箱内20°C鼓风干燥12小时；
4)控制线的制备将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度,螺动泵授液量O.4ml/min,划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测线平行，放入干燥箱内20°C鼓风干燥 12小时；
5)用上述封闭液将含有检测线和控制线的硝酸纤维素膜于37°C封闭60分钟，取出后置37 °C下烘干处理两个小 时，封袋备用。2.涂覆金标抗体的聚酯膜制备
1)金标抗体保存液配制将15g的蔗糖，20μ I的叠氮化钠，在IOOml的pH 7. 4、1%BSA 溶解，用0.22μ膜过滤，置于4°C备用，有效期7天；
2)胶体金颗粒的制备用三蒸水将1%氯金酸稀释成O.01%，置于95°C反应10分钟，力口入Iml的1%柠檬酸三钠溶液，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入2ml的1%碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物；
3)金标抗体的制备用1%碳酸钾溶液调节胶体金pH值至7.5，按照IOyg链亲和素溶液/ml胶体金的量加入链亲和素溶液充分混匀，置于25°C水浴30分钟后再加入5%BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度1%，4°C保存备用。按50 μ g单抗-生物素 /ml胶体金的量将MAB (10-39)-生物素加入胶体金中，37°C搅拌反应40分钟，加入5%BSA, 封闭搅拌20分钟,6000r/min离心20分钟,弃上清,沉淀以金标抗体保存液恢复体积,4°C保存；
4)将混合好的胶体金均匀的铺在聚酯膜上，干燥，封袋，备用。3.胶体金试纸条组装
底衬I、样品垫2、吸水纸5、涂覆金标抗体的聚酯膜3、包被膜4按本领域技术人员通用做法将其粘贴在试纸板，最后将试纸板切割成相应宽度的试纸条即可。实施例6
按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，将含有NT-proBNP 的血清等分，取120 μ I的样品加样至试纸条上，并利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测。从同一等分样品离心获得血浆，通过中国专利200410095878. 4中抗体组合 ΜΑΒ18. 4. 34 (27-31)/PAB (39-50)制得的夹心试纸条，利用 CADRIAC Reader (Roche 诊断公司)检测。通过这种方式获得的两种测试试纸条的函数曲线于图5中。其中本发明系统 MAB(10-39)/PAB(59-71)具有相当陡峭的标准曲线，因此测试更加灵敏。实施例7
按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，将含有NT-proBNP的血清等分，取120 μ I的样品加样至试纸条上，并利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测。 从同一等分样品离心获得血衆，并采用Elecsys NT_proBNP试剂盒(Roche诊断公司)在 Elecsys 1010分析系统进行检测。采用这种方式制备了 46份样品并采用两个系统检测。图 6显示了两个系统的测量值，其相关性很好r=0. 9832，P>0. 05，两种方法间无统计学差异。
实施例8
临床选取阳性样本31例，阴性样本69例。按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测，并与Elecsys NT-proBNP试剂盒(Roche诊断公司)在Elecsys 1010分析系统进行检测结果对照。表I显示了本发明试剂盒良好的临床诊断符合率。表I
权利要求
1.一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，其特征在于它采用如下的抗体组合 MAB (10-39)与 PAB(59-71)。
2.根据权利要求I所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒,其特征在于所述的抗体之一以抗体-颗粒标记物的形式存在。
3.根据权利要求I所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒,其特征在于所述的抗体之一以抗体-金标记物的形式存在。
4.根据权利要求I所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，其特征在于所述 PAB(59-71)的制备方法，包括如下步骤1)克隆如SEQID NO: I所示的基因片段；2)利用步骤I)所得的基因片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化， 得到重组人NT-proBNP蛋白；3)以步骤2)所得的重组人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，所得血清即抗人NT-proBNP蛋白总多克隆抗体；4)采用固相合成法合成如SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽；5)将步骤4)所得的多肽偶联到NHS-4柱子上，制得亲和层析柱；6)将步骤3)所得抗人ΝΤ-ρι·οΒΝΡ蛋白总多克隆抗体加入步骤5)制备好的亲和层析柱上，纯化，即得。
5.权利要求I所述的NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒在检测人NT-proBNP中的应用。
全文摘要
本发明涉及采用特殊抗体组合测定NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，所述抗体组合为MAB(10-39)与PAB(59-71)。本发明双抗夹心快速检测试剂盒具有敏感度高、临床相关性好等优点。
文档编号G01N33/68GK102692512SQ20121021207
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者严行波, 王勇, 苏恩本, 许行尚, 陈玲, 颜彬, 黄力 申请人:南京基蛋生物科技有限公司