专利名称：用于检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及ー种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体和一种用于检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法(ELISA)及试剂盒。
背景技术：
阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂属于有机胂类兽药，具有苯胂酸的基本结构，广谱抗菌，对多种肠道致病菌有较强的抑制和杀灭作用，同时对防止猪腹泻、鸡球虫、黑头病有良好的效果，在畜牧生产中广泛用作猪和鸡的饲料添加剤。有机胂类为ー种毒性很低的化合物，吸收率低，代谢和排泄快，组织中残留较少，毒副作用表现为食欲不振、体重减轻、神经麻痹、腹泻和共济失调，有时出现各种类型的皮 炎，甚至有可能使部分家畜死亡。由于该类药物在畜禽养殖中广泛使用，大量的含砷的化合物进入环境中，造成土壌和水体污染，含神化合物在环境中有较强的蓄积、迁移和转化能力，进入食物链后，直接或间接对人类健康造成的危害。鉴于此我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对有机胂药物在动物性食品中残留制定了最高残留限量。现有的阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留量的方法主要是仪器分析法，其中液相色谱法(HPLC)是可食性动物产品和饲料中有机胂残留检测应用最广泛的方法。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高；而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器，因此需要建立ー个从筛选到确证的检测体系。有关有机胂的残留确证方法已经相对完善，但可用于大批量样品初筛的检测方法研究较少，免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂在动物组织中的残留，ELISA方法更具优势。申请号为201010100397. 3的中国发明专利公开了ー种检测洛克沙胂残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法，该专利利用洛克沙胂重氮化后与人血清白蛋白(HSA)，卵清蛋白(OVA)偶联，制备人工抗原后通过单克隆抗体技术得到对洛克沙胂具有特异性的抗体，通过胶体金标记，制备免疫层析试纸条。该产品只能用于洛克沙胂的检测(500 y g/L消线)，不能对多种有机胂药物进行残留监控。

发明内容
本发明的目的为(I)提供一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体；(2)提供所述单克隆抗体在制备阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测酶联免疫试剂盒中的应用；
(3)提供ー种含有所述单克隆抗体的酶联免疫试剂盒；(4)提供所述酶联免疫试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用；(5)利用该单克隆抗体，建立一种能检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的ELISA方法；(6)提供一种所述的ELISA方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。上述目的是通过以下技术方案实现的一种鼠源单克隆抗体，能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂，其特征在于它是杂交瘤细胞株4F2所分泌的。所述的杂交瘤细胞株4F2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCN0:C201248o 所述的单克隆抗体，其特征在干，它是以阿散酸(ASA)与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物(DIA-ASA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的偶联物(DIA-ASA-BSA)作为免疫原制备得到的。所述的单克隆抗体在制备检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒中的应用。包含所述的单克隆抗体的试剂盒。所述的试剂盒是检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。一种检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原和抗体的制备，其步骤如下(I)将阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物(DIA-ASA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(DIA-ASA-BSA)；(2)将阿散酸在戊ニ醛(glutaraldehyde, GA)作用下与卵清蛋白(0VA)偶联得到包被原(ASA-GA-OVA)；(3)用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC N0:C201248的杂交瘤细胞株4F2 ；(4)用保藏号为CCTCC N0:C201248的杂交瘤细胞株4F2制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)样品前处理饲料样品粉碎后用饲料提取液温育，然后用稀释液稀释后检测；肌肉样品均质后用组织提取液提取，然后氮气吹干，最后用稀释液稀释，得待测物；( 7 )对步骤(6 )的待测物进行检测。其中，饲料提取液的组分及配比为量取200mL甲醇，缓慢倒入800mL的样品稀释液中，混匀。组织提取液的组分及配比为称取50mL20%三氯こ酸，加入至950mLこ腈中，混匀。样品稀释液的组分及配比为=NaCl8. 0g, KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g，KCl0. 2g,加双蒸水定容至1000mL。所述的酶联免疫方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。本发明的有益效果是
I、本发明在抗体制备时，采用阿散酸作为半抗原，该半抗原体现了有机胂所共有的化学结构苯胂酸，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂。2、本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂，一次測定即可检出阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂在动物饲料中含量或可食性动物组织中的残留，本发明的ELISA方法和试剂盒在检测药物的种类上具有明显的优势，可以节省对样品的分析次数，具有更好的经济价值。3、本发明的ELISA方法和试剂盒适用的检测样品包括动物饲料和动物肌肉，本发明涉及的样品处理方法简单，易操作，样品处理所用的主要有机试剂为こ腈和甲醇，对操作者身体健康危害相对较小。4、本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。


图I为本发明的单克隆抗体与阿散酸标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为阿散酸(ASA)标准溶液浓度对数值，Y轴为阿散酸标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步说明，但不限制本发明。实施例I免疫原和包被原的制备1.3重氮化的阿散酸-牛血清白蛋白偶联物(DIA-ASA-BSA)的制备 称取21. 7mg阿散酸溶解于ImL 0. Imol HCl中，调pH=l 2，4°C缓慢加入100mg/mLNaNO2溶液至淀粉碘化钾试纸变蓝，冰浴避光反应45min。反应结束用少量50mg/mL氨基磺酸氨中和过量的NaN02。取70mg BSA溶解于IOmL的碳酸盐缓冲液(准确称取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量去离子水溶解，定容至1000 mL。)，用IM NaOH调整PH=9 10，冰浴中缓慢滴加第一步反应液，并不断调整PH值8、，4°C反应过夜。反应完毕后，用4°C生理盐水透析3d，每天更换透析液2次，即得偶联物DIA-ASA-BSA。离心后取上清冷冻干燥，置_20°C保
存。反应式如下
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I / \ KMMmmm f / \ mm I / \u=.T—' き—き丨丨、ク—N-三、.................................BPP'" o=-'-zr—^ ク-~sa1.4阿散酸-戊ニ醛-卵清蛋白偶联物(ASA-GA-OVA)的制备取132mg OVA溶于15mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，为A液。阿散酸21.7mg溶于ImLN，N- ニ甲基甲酰胺中，为B液。室温条件下，将B液缓慢滴入A液中，然后缓缓加入0. ImL戊ニ醛溶液，室温反应6h。离心后取上清，4°C生理盐水中透析3d，每天更换透析液2次，即得偶联物ASA-GA-OVA。2000rpm离心后取上清冷冻干燥，置_20°C保存，作为包被原用。反
应式如下
权利要求
1.一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的单克隆抗体，其特征在于它是由杂交瘤细胞株4F2所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞株4F2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201248。
3.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，它是以阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物与牛血清白蛋白偶联后作为免疫原制备得到的。
4.权利要求I或3所述的单克隆抗体在制备检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒中的应用。
5.包含权利要求I或3所述的单克隆抗体的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，该试剂盒是检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫试剂盒。
7.权利要求5所述的试剂盒在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
8.—种检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法，其步骤如下 (1)将阿散酸与亚硝酸钠重氮化后的偶氮化合物与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； (2)将阿散酸在戊二醛作用下与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)用步骤(I)的免疫原制备得到保藏号为CCTCCN0:C201248的杂交瘤细胞株4F2 ； (4)用保藏号为CCTCCN0:C201248的杂交瘤细胞株4F2制备单克隆抗体； (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)样品前处理饲料样品粉碎后用饲料提取液温育，然后用稀释液稀释后检测；肌肉样品均质后用组织提取液提取，然后氮气吹干，最后用稀释液稀释，得待测物； (7)对步骤(6)的待测物进行检测， 其中， 饲料提取液的组分及配比为量取200mL甲醇，缓慢倒入SOOmL的样品稀释液中，混匀； 组织提取液的组分及配比为称取50mL20%三氯乙酸，加入至950mL乙腈中，混匀； 样品稀释液的组分及配比为=NaCl 8. 0g, KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4 12H20 2. 9g，KCl0.2g,加双蒸水定容至1000mL。
9.权利要求8所述的酶联免疫方法在阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂的特异性单克隆抗体, 它是由杂交瘤细胞株4F2所分泌的，所述的杂交瘤细胞株4F2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOC201248。本发明还公开了检测阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂残留的酶联免疫方法及其试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别阿散酸、硝苯胂酸和卡巴胂，本发明的酶联免疫方法和试剂盒一次测定即可检出动物饲料或可食性动物组织中的残留，具有简便、快速、灵敏、准确等优点，同时具有样品处理方法简单，易操作，对操作者身体健康危害小等优点。
文档编号G01N33/577GK102766211SQ20121017648
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者冯亮, 彭大鹏, 朱永利, 潘源虎, 王涓, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅 申请人:华中农业大学