专利名称：纯化多肽的方法
技术领域：
本发明提供用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，及包含通过该方法纯化的多肽的制剂。
背景技术：
多肽的大规模、经济纯化是生物技术产业越来越重要的问题。通常，使用哺乳动物细胞系或细菌细胞系，通过细胞培养来产生多肽，该细胞系通过插入包含该多肽的基因的 重组质粒改造为产生目的多肽。由于所使用的细胞系是活生物，必须用包含糖类、氨基酸和生长因子(通常从动物血清的制剂供给)的复合生长培养基饲养它们。希望从饲喂给细胞的化合物的混合物及从细胞自身的副产物分离目的多肽。通常尝试用不同层析技术的组合来从细胞产生的其他产物分离目的多肽。这些技术根据它们的电荷、疏水性程度、大小或目的多肽与固定化捕获剂之间的特异性相互作用来分开多肽的混合物。对于这些技术中的每一种，可获得几种不同的层析树脂，允许根据所涉及的具体多肽精确调整纯化方案。这些分离方法中的每一种的本质是，可以使多肽或者以不同的速率沿长柱向下移动，达到随着它们进一步沿柱下移而提高的物理分离，或者选择性黏附于分离介质，然后通过不同溶剂差异洗脱。在一些情况下，在杂质特异性黏附于柱而目的多肽不黏附于柱时，从杂质分离目的多肽，即，目的多肽存在于“流穿液(flow-through) ” 中。大规模、低成本纯化多肽至足以用作人用药物的纯度仍是巨大挑战。发明概述本文提供用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，其中，该方法包括(i)或(ii) (i) (a)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将该组合物加样至阳离子交换材料上和(b)将从该阳离子交换材料回收的组合物加样至混合型材料上的顺次步骤；或(ii) (a)将该组合物加样至混合型材料上和(b)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将从混合型材料回收的组合物加样至阳离子交换材料上的顺次步骤。在该方法中任一种的一些实施方案中，该多肽具有约6和约10之间的pi。在一些实施方案中，该多肽具有约7和约9之间的pi。在该方法中任一种的一些实施方案中，该多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，该多肽是免疫黏附素。在一些实施方案中，该多肽是抗体。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是IgG单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。在该方法中任一种的一些实施方案中，该至少一种污染物是中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出(leached)的A蛋白、DNA、聚集蛋白质、细胞培养基成分、庆大霉素和病毒污染物中的任意一种或多种在该方法中任一种的一些实施方案中，(i)和/或(ii)中的顺次步骤是连续的。在该方法中任一种的一些实施方案中，(i)和/或(ii)中的顺次步骤是不连续的。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法是(i)。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法是(ii)。在该方法中任一种的一些实施方案中，该加样密度在约150g/L和约2000g/L之间。在一些实施方案中，该密度在约150g/L和约1000g/L之间。在一些实施方案中，该密度在约500g/L和约700g/L之间。
在该方法中任一种的一些实施方案中，该阳离子交换材料包含羧酸官能团或磺酸官能团。在一些实施方案中，该官能团是磺丙基、磺乙基、磺异丁基或羧基。在一些实施方案中，该阳离子交换材料是膜、monolith或树脂颗粒。在一些实施方案中，该阳离子交换材料是树脂。在一些实施方案中，该阳离子交换材料是Mustang S、Sartobind S、S03 Monolith、SCeramic HyperD、Poros HS50、Poros HS20、横丙基-Sepharose FastFlow (SPSFF) > SP-Sepharose XL (SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、CaptoS、Fractogel SeHiCap、Fractogel S03或Fractogel COO。在一些实施方案中，该阳离子交换材料是PorosHS50。在该方法中任一种的一些实施方案中，该混合型材料包含能够进行阴离子交换和疏水作用的官能团。在一些实施方案中，该混合型材料是Capto-Adhere树脂、MEP HyperCel树脂、HEA HyperCel树脂、PPAHyperCeI树脂或ChromaSorb膜。在一些实施方案中，该混合型材料是Capto-Adhere树脂。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法包括随同该阳离子交换材料和/或阴离子交换材料使用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液，且该平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的电导率在约2mS/cm至约25mS/cm之间。在一些实施方案中，该平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的电导率在约3mS/cm至约8mS/cm之间。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法包括随同该阳离子交换材料和/或阴离子交换材料使用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液，且该平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的PH在约4. 5和约6. 5之间。在该方法中任一种的一些实施方案中，随同该阳离子交换材料和/或阴离子交换材料的平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液是相同的。在该方法中任一种的一些实施方案中，随同该阳离子交换材料和/或阴离子交换材料的平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液是不同的。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括使包含该多肽的组合物在步骤(a)和(b)之前或之后经受一个或多个其他纯化步骤。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括回收该纯化的多肽。在该方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括将该纯化的多肽与可药用载体组合。附图简述
图 IA-D 显示用 Poros HS50、SPSFF, S03Monolith 和 Mustang S 纯化抗-CDlla 抗体的层析谱。图2 显示用 SPSFF、Poros HS50、Mustang S 和 S03monolith 收集不同量的包含抗-CDlla抗体的产物(g/L CV或MV)的C/CQ (Mab ( “单体抗体”)浓度)和C/C。(中国仓鼠卵巢蛋白质(“CHOP”)浓度)。C是所收集的级分中Mab或CHOP的浓度，C0是加样物(load)中Mab或CHOP的浓度。图3 显示用 S03monolith、Mustang S、SPSFF 和 Poros HS50 收集不同量的包含抗-CDlla抗体的产物(g/L CV或MV)的C/CQ(Mab浓度)和C/CQ(高分子量(“HMW”)浓度)。C是所收集的级分中Mab或HMW的百分比，C0是加样物中Mab或HMW的百分比。图4A-D 显示用 S03monolith、Mustang S、SPSFF 和 Poros HS50 收集不同量的包含抗-CDl Ia抗体的产物(g/L CV或MV)的C/Q (Mab浓度)、C/C0 (HMW1浓度)和C/Q (HMW2浓度)。
图5A显示用Poros HS50加样的包含抗-⑶Ila抗体的产物中HMW和Mab的层析谱；图5B显示使用Poros HS50的洗脱混合物(pool)中HMW和Mab的层析谱(内部图显示峰的扩大部分)；图5C显示用Poros HS50收集不同量的包含抗-⑶Ila抗体的产物(g/L CV)的流穿(“FT”)混合物中的累积HMW^^PFT级分中的HMW%。图6A显示用SPSFF柱收集不同量的包含抗-⑶Ila抗体的产物的FT混合物的层析谱；图6B显示用SPSFF收集不同量的包含抗-⑶Ila抗体的产物(mg/mL CV)的FT混合物中的累积_%和FT级分中的HMW% ;图6C显示用SPSFF收集不同量的包含抗-⑶Ila抗体的产物(mg/mL)的HMW%。图 7A-D 显示用 Poros HS50、SPSFF、S03Monolith 和 Mustang S 纯化抗-VEGF 抗体的层析谱。图8 显示用 Poros HS50、Mustang S、S03 monolith 和 SPSFF 加样不同量的产物(g/L CV或MV)的抗-VEGF抗体的C/CQ (Mab浓度)。图 9 显不用 SPSFF、Sartobind S> Poros HS50> Mustang S 和 SO3Iiionolith 收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/L CV或MV)的C/C^CHOP浓度)。

图10 显示用 SPSFF、Poros HS50、Mustang S 和 S03monolith 收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/L CV或MV)的DNA的量(pg/mg)。图 11 显示用 SPSFF、Sartobind S、具有稀释 Mab 的 Poros HS50、Poros HS50、MustangS和S03monolith收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/L CV或MV)的C/C。(HMW 浓度)。图12 显示用 SPSFF、具有稀释 Mab 的 Poros HS50、Poros HS50、Mustang S 和S03monoIith收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/LCV或MV)的C/Q (HMW1浓度)和C/QXHMW2 浓度)。图13A-E显示在多种pH和盐浓度下使用包含抗-⑶20抗体的产物的结合于树脂(Poros HS50.SE HiCap、SPSFF、SPXL 和 Capto S)的％ HMW。图14A-E显示在多种pH和盐浓度下使用包含抗-⑶20抗体的产物的结合于树脂(Poros HS50.SE HiCap、SPSFF、SPXL 和 Capto S)的％ CHOP。图15显示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗体的产物(g/L CV)的 C/CQ(HMW 浓度 ％ )。图16显示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗体的产物(g/L CV)的累积 HMW(% )。图17显示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗体的产物(g/L CV)的 C/C^CHOP 浓度)。图18显示用Poros HS50和Capto S收集不同量的包含抗-CD20抗体的产物(g/L CV)的累积 CHOP (ppm)。图19A-B显示在多种流速下用SPSFF纯化抗-VEGF抗体的在280nm获得的UV迹线对运行时间(图19A)和对产物加样体积(图19B)作图的层析谱。图20显示在多种流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(mg/mLCV)的 C/CQ (Mab 浓度)和 C/CQ (CHOP 浓度)。 图21显示在多种流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/mLCV)的 DNA 的量(pg/mg)。图22显示在多种流速下用SPSFF收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/LCV)的 C/C^HMW 浓度)。图23显示在多种流速下用Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(g/L CV)的 C/C0 (HMW 浓度(％ ))、C/C0 (CHOP 浓度(ppm))和 DNA 的量(pg/mg)。图24显示在多种加样电导率下用Poros HS50纯化抗-VEGF抗体的层析谱。图25A-B显不使用在多种加样电导率下加样包含抗-VEGF抗体的产物的PorosHS50的来自洗脱的洗脱物(Pl峰)和来自清洗的洗脱物(P2峰)的层析谱。图26显示在多种加样电导率下用Poros HS50纯化抗-VEGF抗体的加样不同量的CHOP (ug/mL CV)的级分中 CHOP 的量(ppm)。图27显示在多种加样电导率下用Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(mg/mL CV)的 C/CQ (HMW 浓度)。图28A-B显示在多种加样电导率和多种流速下收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物((g/L CV)的DNA的量(pg/ml)(不同加样电导率的加样物中不同量的DNA(pg/mg))。图29显示用线性盐梯度洗脱物洗脱的Poros HS50收集不同量的包含抗-VEGF抗体的产物(mg/mL CV)的DNA的量(pg/mL)和抗体浓度。图30显示用柱床高度为4. 6cm或14. 2cm的Poros HS50的加样不同量的包含抗-VEGF 抗体的产物(g/L CV)的 C/C0 (HMW 浓度(％ ))、C/C0 (CHOP 浓度(ppm))和 DNA 的量(pg/mg)。图31A-F显示在多种pH和电导率(用NaAC或甘氨酸HCl作为缓冲盐)下使用Capto Adhere树脂的抗-VEGF抗体(FT级分中)、抗-⑶Ila抗体和抗-⑶20抗体的％ Mab回收。图32A-F显示在多种pH和电导率(用NaAC或甘氨酸HCl作为缓冲盐)下将CaptoAdhere树脂用于抗-VEGF抗体、抗-⑶IIa抗体和抗-⑶20抗体的％ HMW结合。图33A-F显示在多种pH和电导率(用NaAC或甘氨酸HCl作为缓冲盐)下将CaptoAdhere树脂用于抗-VEGF抗体、抗-⑶IIa抗体和抗-⑶20抗体的％ CHOP结合。图34显示用偶联的Capto Adhere柱和Poros HS50柱纯化抗-QHla抗体的层析P曰。发明详述I.定义术语“多肽”或“蛋白质”意指氨基酸的序列，其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构。因此，蛋白质区别于“肽”，肽也 是基于氨基酸的分子，但不具有这种结构。通常，本文使用的蛋白质将具有至少约5-20kD、备选地至少约15-20kD、优选至少约20kD的分子量。“肽”意指氨基酸的序列，其通常不显示更高水平的三级和/或四级结构。肽通常具有小于约5kD的分子量。包含于本文的定义之内的多肽的实例包括哺乳动物蛋白质，如，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；月旨蛋白；α -I-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VII 1C、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C ;心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和;脑啡月太酶；RANTES(regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如内酰胺酶；DNA酶；IgE ;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或D ;类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6 (NT_3、NT_4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-b ;血小板衍生生长因子(TOGF);成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β I、丁6卩-3 2、16卩-3 3、16卩-3 4或了6卩-3 5;胰岛素样生长因子-1和-11(16卩-1和IGF-II);消(1-3)-IGF-I (脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、⑶19和⑶20 ;促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素，如干扰素-a、- β和-Y ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白细胞介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如⑶11a、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ;肿瘤相关抗原，如 CA125 (卵巢癌抗原)或 HER2、HER3或HER4受体；免疫黏附素；上列蛋白质中任一种的片段和/或变体；以及与包括例如上列蛋白质中任一种的蛋白质结合的抗体，包括抗体片段。“纯化的”多肽(例如抗体)意指多肽的纯度已提高，使得它以比它在自然环境中存在和/或最初在实验室条件下合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对值，并非必然意指绝对纯度。在本文中使用时，术语“表位标记的”指包含与“标记多肽”融合的多肽的嵌合多肽。标记多肽具有足够的残基来提供可以针对其制备抗体的表位，但也足够短，使得它不干扰与之融合的多肽的活性。还优选标记多肽相当独特，使得该抗体基本上不与其他表位交叉反应。适宜的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基，且通常在约8个和50个氨基酸残基之间(优选地，在约10个和20个氨基酸残基之间)。
为了本文的目的，“活性的”或“活性”指多肽的一种或多种形式，其保持天然或天然存在的多肽的生物学和/或免疫学活性，其中，“生物学”活性指由天然或天然存在的多肽引起的生物学功能(抑制或刺激)，其不同于诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力，“免疫学”活性指诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力。术语“拮抗剂”以最广泛的含义使用，且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物学活性的任意分子。类似地，术语“激动剂”以最广泛的含义使用，且包括模拟天然多肽的生物学活性的任意分子。适宜的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并测量通常与该多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测的变化。“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指分子在补体的存在下裂解靶标的能力。通过补·体系统的第一成分(Clq)与复合关联抗原的分子(例如多肽(例如抗体))的结合来起始补体激活途径。为了评估补体激活，可以进行例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods202 :163(1996)中所述的CDC测定。“结合”目的抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标)的多肽是这样的多肽，其以足够的亲和力结合该抗原，使得该多肽可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断剂和/或治疗剂，且不显著与其他多肽交叉反应。在这类实施方案中，如通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定，该多肽与“非靶标”多肽的结合程度小于该多肽与它的具体靶标多肽的结合的约10%。对于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异”意指显著不同于非特异性相互作用的结合。可以例如与对照分子的结合比较，通过测定分子的结合来测量特异性结合，该对照分子通常是不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的非标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果过量的未标记靶标竞争性抑制标记靶标与探针的结合，则指示特异性结合。“抑制肿瘤细胞生长”的多肽或“生长抑制性”多肽是导致癌细胞的可测量的生长抑制的多肽。在一个实施方案中，在细胞培养物中约O. I至约30μ g/ml或约O. 5nM至约200nM的多肽浓度下测量生长抑制，其中，在肿瘤细胞暴露于该多肽1-10天后测定该生长抑制。如果按约I μ g/kg至约100mg/kg体重施用多肽导致肿瘤大小或肿瘤细胞增殖在首次施用该多肽后约5天至约3个月内、优选约5天至约30天内降低，则该多肽在体内是生长抑制性的。“诱导凋亡”的多肽是诱导通过膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞皱缩、内质网的膨胀、细胞破碎和/或膜小泡(称为凋亡小体)的形成测定的程序性细胞死亡的多肽。优选地，该细胞是肿瘤细胞，例如前列腺细胞、乳腺细胞、卵巢细胞、胃细胞、子宫内膜细胞、肺细胞、肾细胞、结肠细胞、膀胱细胞。可用多种方法来评价与凋亡相关的细胞事件。例如，可以通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可以通过DNA断裂成梯来评价DNA断裂；可以通过亚二倍体细胞的任意增加来评价核/染色质凝聚以及DNA断裂。优选地，诱导凋亡的多肽是这样的多肽，在膜联蛋白结合测定中，相对于未处理的细胞，该多肽导致约2至约50倍、优选约5至约50倍和最优选约10至约50倍的膜联蛋白结合的诱导。“诱导细胞死亡”的多肽是使活细胞变得不能存活的多肽。优选地，该细胞是癌细胞，例如乳腺细胞、卵巢细胞、胃细胞、子宫内膜细胞、唾液腺细胞、肺细胞、肾细胞、结肠细胞、甲状腺细胞、胰腺细胞或膀胱细胞。可以在缺乏补体和免疫效应细胞的情况下测定体外细胞死亡来区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或依赖补体的细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，可以用热失活的血清(即，在缺乏补体的情况下)在缺乏免疫效应细胞的情况下进行细胞死亡的测定。为了确定多肽是否能够诱导细胞死亡，可以相对于未处理的细胞评估通过碘化丙碇(PI)、台盼蓝(见Moore等Cytotechnology 17 1-11(1995))或7AAD的摄取评价的膜完整性的丧失。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，且明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、形成自至少两种完整抗体的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的生物学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可以与抗体互换使用。 抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有全都基于免疫球蛋白折叠的不同结构。例如，IgG抗体具有通过二硫键结合形成功能性抗体的两条“重”链和两条“轻”链。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持，并在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中发挥作用。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性并非在可变结构域的110个氨基酸的跨度内均匀分布。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的序列组成，该序列由长度各为9-12个氨基酸的称为“高变区”的极端可变的较短区域分隔开。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β_折叠结构的环，且在一些情况下形成β_折叠结构的部分。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自其他链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(见Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版 Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda,Md. (1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的参与。每个V区通常包含3个互补决定区(“⑶R”，其中每个⑶R包含“高变环”)和4个构架区。因此，抗体结合部位(以实质性亲和力结合具体希望的抗原所需的最小结构单位)通常将包含3个CDR及散布其间来支持并以适当的构象呈递CDR的至少3个、优选4个构架区。经典的四链抗体具有通过相互协作的V1^P'结构域定义的抗原结合部位。某些抗体(如骆驼抗体和鲨鱼抗体)缺乏轻链，依赖于仅由重链形成的结合部位。可以制备单结构域改造免疫球蛋白，其中，在缺乏Vh和\间协作的情况下由重链或轻链单独形成结合部位。术语“可变的”指这样的事实，可变结构域的某些部分的序列在抗体间广泛不同，且用于各具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。但是，可变性并非在抗体的整个可变结构域内均匀分布。它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域二者中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β -折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构的环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自其他链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(见Kabat等，Sequences of Proteins oflmmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutesof Health, Bethesda,MD. (1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的参与。在本文中使用时，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(例如，\中的约残基24-34 (LI)、50-56 (L2)和 89-97 (L3), Vh 中的约 31-35B (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3) (Kabat 等，Sequences of Proteins oflmmunological Interest,第 5 版 Public Health Service,National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991)))和 / 或来自“高变环”的那些残基(例如 Vl 中的残基 26-32 (LI)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)，Vh 中的 26-32 (HI)、52A-55 (H2)和 96-101 (H3)(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987)))。“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和形成自抗体片段的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各具有单个抗原结合部位)和残余的“Fe”片段(其名称反映了它易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合部位，且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。各可变结构域的三个高变区正是在此构型中相互作用来定义Vh-Vl 二聚体表面上的抗原结合部位。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原特异的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结合部位。Fab片段还包含轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CHl结构域的羧基端加入了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个自由巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配至称为K和λ的两个明显不同的类型之一。取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分配至不同种类。存在五个主要种类的完整抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、Y和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中，这些结构域存在于单条多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在V1^P'结构域之间包含多肽接头，该多肽接头使scFv能够形成希望的结构用于抗原结合。scFv的综述见Pliickthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编辑，Springer-Verlag,纽约，269-315 页(1994)。术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与轻链可变结构域(\)连接的重链可变结构域(Vh) (Vh-Vl) 0通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。双抗体更充分地描述于例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;和Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中。本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，S卩，除了可以在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆体的优势在于它们未受其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆的”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生抗体。例如，待按照本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等，Nature256 =495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(见例如美国专利号 4,816,567)。还可以用例如 Clackson 等，Nature 352:624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol.Biol. 222 :581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中，部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性(美国专利号 4，816，567 ;Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，其包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴，如狒狒、猕猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5，693，780)。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，用来自具有希望的特异性、亲和力和容量的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种(供体抗体)的高变区的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。产生这些修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个(且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中，全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而除上文指出的一个或多个FR取代外，全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详情见Jones等，Nature321 :522-525 (1986) ； Riechmann等，Nature 332 :323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)。为了本文的的目的，“完整抗体”是包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及Fe区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重⑶链组成的约150，OOO道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(Vh)，随后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(')，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域匹配(align)，轻链可变结构域与重链的可变结构域匹配。认为特定氨基酸残基形成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。“裸抗体”是未与异源分子(如毒性部分或放射性标记)缀合的抗体(如本文所定义)。在一些实施方案中，抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)且随抗体同种型而变的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中，表达Fe受 体(FcR)的非特异性毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起该靶细胞的裂解。用于介导ADCC的初级细胞(NK细胞)仅表达 Fe Y RIII，而单核细胞表达 Fe YRI、FcyRII FcyRIII0 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9 :457-92 (1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5，500, 362或5，821，337中所述的ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以例如在动物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95 652-656 (1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，该细胞至少表达Fe Y RIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。用术语“Fe受体”或“FcR”来描述与抗体的Fe区结合的受体。在一些实施方案中，该FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR( Y受体)，且包括FcyRI, Fe Y RII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。Fe YRII受体包括Fe Y RIIA (“活化受体”)和Fe Y RIIB (“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。活化受体Fe Y RIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见Dagron，Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997))。FcR 综述于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92 (1991) ；Capel 等，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41 (1995)中。本文的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括有待在将来鉴定的那些。该术语还包含负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn (Guyer等，J. Immunol. 117 :587 (1976);和Kim等，J. Immunol. 24 :249(1994))。本文所用的术语“顺次的”指在该方法的步骤(a)和(b)之间没有层析步骤。本文所用的术语“连续的”指将阳离子交换材料和混合型材料直接连接，或以允许在阳离子交换材料和混合型材料间连续流动的某种其他机制连接。“污染物”指不同于希望的多肽产物的物质。污染物包括但不限于宿主细胞物质，如CHOP ;浸出的A蛋白；核酸；希望的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分等。本文提到的“约”某个值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的变动。例如，提到“约X”的描述包括了 “X”的描述。除非文中清楚地另有说明，本文及所附权利要求中使用的单数形式“一”、“或”和“该”包括复数指代物。应理解，本文描述的本发明的方面和变通形式包括由该方面和变通形式组成和/或基本上由该方面和变通形式组成。II.纯化方法
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本文提供用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法。具体而言，该方法包括使用过载的阳离子交换材料。例如，该方法包括按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度加样至阳离子交换材料上。本文提供的纯化方法可以进一步包括加样至混合型材料上。例如，在一些实施方案中，该方法包括(a)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将该组合物加样至阳离子交换材料上和(b)将从该阳离子交换材料回收的组合物加样至混合型材料上的顺次步骤。在另一实例中，在一些实施方案中，该方法包括(a)将该组合物加样至混合型材料上和(b)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将从该混合型材料回收的组合物加样至阳离子交换材料上的顺次步骤。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该顺次步骤是连续的。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该顺次步骤是不连续的。在一些实施方案中，该连续纯化利用相同的流速、电导率和/或pH。上述方法可以进一步包括加样至A蛋白亲和层析材料上的步骤。加样至A蛋白亲和层析材料上的步骤通常(但并非必然)在一个或多个其他层析步骤之前进行。在一些实施方案中，加样至A蛋白亲和层析材料上的步骤可以与任意顺序的过载阳离子交换层析和混合型层析的顺次步骤组合。在一些实施方案中，该顺次步骤是连续的。在一些实施方案中，该连续纯化利用相同的流速、电导率和/或pH。阳离子交换材料是固相，其带负电荷，且具有用于与流经或流过该固相的水溶液中的阳离子交换的自由阳离子。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该阳离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在优选实施方案中，该阳离子交换材料可以是树脂。该阳离子交换材料可以包含羧酸官能团或磺酸官能团，如，但不限于磺酸盐、羧酸、羧甲基磺酸、磺异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺氧乙基或正磷酸盐。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该阳离子交换材料可以利用常规层析材料或对流层析材料。该常规层析材料包括例如灌流材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂)和扩散材料(例如交联琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，该聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂可以是Poros HS树脂。该PorosHS树脂可以是Poros HS 50 μ m或PorosHS 20 μ m颗粒。在一些实施方案中，该交联琼脂糖树脂可以是磺丙基-Sepharose FastFlow( “SPSFF”)树脂。该对流层析材料可以是膜(例如聚醚砜)或monolith材料(例如交联聚合物)。该聚醚砜膜可以是Mustang S。该交联聚合物monolith材料可以是交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-Co-二甲基丙烯酸乙二醇酯)，例如monolith S03。
本领域已知的阳离子交换材料的实例包括但不限于Mustang S、Sartobind
S、S03Monolith> S Ceramic HyperD> Poros HS50、Poros HS20、SPSFF、SP-SepharoseXL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S> Fractogel Se HiCap、Fractogel S03 或Fractogel COO。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该阳离子交换材料是PorosHS50。在一些实施方案中，该Poros HS树脂可以是Poros HS 50 μ m或Poros HS 20 μ m颗粒。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该混合型材料包含能够执行一种或多种以下功能性的官能团阴离子交换、形成氢键和疏水作用。在一些实施方案中，该混合性材料包含能够进行阴离子交换和疏水作用的官能团。该混合型材料可以包含N-苄基-N-甲基乙醇胺、4-巯基-乙基-吡啶、己胺或苯丙胺作为配体，或包含交联的聚烯丙胺。该混合型材料的实例包括 Capto_Adhere、MEP HyperCeI>HEA HyperCel 或 PPA HyperCel 树月旨,或ChromaSorb膜。在一些实施方案中，该混合型材料是Capto-Adhere树脂。
在一些实施方案中，本文提供用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，其中该方法包括⑴或(ii)⑴(a)按高于约150g/L树脂的加样密度将该组合物加样至Poros HS50上和(b)将从PorosHS50回收的组合物加样至Capto-Adhere上的顺次步骤；或(ii) (a)将该组合物加样至Capto-Adhere上和(b)按高于约150g/L树脂的加样密度将从Capto-Adhere回收的组合物加样至Poros HS50上的顺次步骤。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，按高于约150g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、550g/L、600g/L、650g/L、700g/L、800g/L、900g/L 或 1000g/L 阳离子交换材料中任一个的加样密度将该组合物加样至阳离子交换材料上。可以按约150g/L至2000g/L、150g/L 至 1500g/L、150g/L 至 1000g/L、200g/L 至 1500g/L、300g/L 至 1500g/L、400g/L 至1000g/L或500g/L至1000g/L阳离子交换材料中任一个的加样密度将该组合物加样至阳离子交换材料上。在一些实施方案中，按约150g/L、300g/L、500g/L、550g/L、600g/L、650g/L、700g/L、800g/L、850g/L、900g/L、1000g/L、1500g/L 或 2000g/L 阳离子交换材料中任一个的加样密度将该组合物加样至阳离子交换材料上。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，按高于约25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、150g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L 或 550g/L 混合型材料中任一个的加样密度将该组合物加样至混合型材料上。按约25g/L至1000g/L、25g/L至700g/L或25g/L至500g/L混合型材料中任一个的加样密度将该组合物加样至混合型材料上。可以利用的多种缓冲液取决于，例如，希望的缓冲液pH、希望的缓冲液电导率、目的蛋白质的特征和纯化方法。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该方法包括使用缓冲液。该缓冲液可以是加样缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，力口样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在一些实施方案中，力口样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该缓冲液包含盐。该缓冲液可以包含氯化钠、醋酸钠或其混合物。在一些实施方案中，该缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，该缓冲液是醋酸钠缓冲液。本文所用的加样物是加样至层析材料上的组合物。加样缓冲液是用来将包含目的多肽的组合物加样至层析材料上的缓冲液。在加样待纯化的组合物之前，可以用平衡缓冲液平衡层析材料。在将组合物加样至层析材料上之后，用洗涤缓冲液来从固相洗脱目的多肽。电导率指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转移流动。因此，随着存在于水溶液中的离子量增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的基本测量单位是Siemen (或mho)、mho (mS/cm),且可以用电导率计(如多种型号的Orion电导率计)测量。由于电介质电导率是溶液中的离子携带电流的能力，因此可以通过改变其中的离子浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中的缓冲剂浓度和/或盐浓度(例如氯化钠、醋酸钠或氯化钾)来达到希望的电导率。优选地，改 变多种缓冲液的盐浓度来达到希望的电导率。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该电导率具有高于约2mS/cm、5mS/cm、7. 5mS/cm或10mS/cm中任一个的电导率。该电导率可以是约2mS/cm至25mS/cm、2mS/cm 至 IOmS/cm、3mS/cm 至 8mS/cm、2mS/cm 至 6mS/cm、4mS/cm 至 6mS/cm 或 2mS/cm 至 4mS/cm中的任一个。在一些实施方案中，该电导率可以是约2mS/cm、3mS/cm、4mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、8mS/cm或10mS/cm中的任一个。在一方面，该电导率是加样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，加样缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率是相同的。在一些实施方案中，加样缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该缓冲液具有低于约10、9、8、7或6中任一个的pH。该缓冲液可以具有约3至10、4至8、4至6或5至6中任一个的pH。在一些实施方案中，该pH是约4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5或8中的任一个。该pH可以是加样缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液的pH。在一些实施方案中，加样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的PH是相同的。在一些实施方案中，加样缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，流速低于约50CV/小时、40CV/小时或30CV/小时中的任一个。流速可以是约5CV/小时至50CV/小时、IOCV/小时至40CV/小时或18CV/小时至36CV/小时中的任一个。在一些实施方案中，流速是约9CV/小时、18CV/小时、25CV/小时、30CV/小时、36CV/小时或40CV/小时中的任一个。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，流速低于约IOOcm/小时、75cm/小时或50cm/小时中的任一个。流速可以是约25cm/小时至150cm/小时、25cm/小时至IOOcm/小时、50cm/小时至IOOcm/小时或65cm/小时至85cm/小时中的任一个。流速可以是阳离子交换材料上的流速或混合型材料上的流速。在一些实施方案中，阳离子交换材料上的流速与混合型材料上的流速相同。在一些实施方案中，阳离子交换材料上的流速不同于混合型材料上的流速。柱床高度是所使用的层析材料的高度。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，柱床高度高于约3cm、10cm或15cm中的任一个。柱床高度可以是约3cm至35cm、5cm至15cm、3cm至IOcm或5cm至8cm中的任一个。在一些实施方案中，柱床高度是3cm、5cm、IOcm或15cm中的任一个。在一些实施方案中，阳离子交换材料的柱床高度与混合型材料的柱床高度相同。在一些实施方案中，阳离子交换材料的柱床高度不同于混合型材料的柱床高度。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该至少一种污染物是CHOP、浸出的A蛋白、DNA、聚集蛋白质、细胞培养基成分、庆大霉素和病毒污染物中的任意一种或多种。CHOP是来自宿主细胞的蛋白质，S卩，中国仓鼠卵巢蛋白质。可以通过酶联免疫吸附测定(“ELISA”)或Meso Scale Discovery ( “MSO”)来测量CHOP的量。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，CHOP的量降低了高于10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一个。CHOP的量可以降低约10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一个。在一些实施方案中，CHOP 的量降低了约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中CHOP的量与该一个或多个纯化步骤之前的组合物中CHOP的量相比较来测定该降低。聚集多肽可以是高分子量(HMW)蛋白质。在一些实施方案中，聚集蛋白质是目的多肽的多聚体。HMW可以是目的多肽的二聚体、至多Sx单体或更大。测量聚集蛋白质(例如HMW)的方法为本领域已知，并描述于实施例部分中。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，聚集蛋白质的量降低了高于约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一个。聚集蛋白质的量可以降低约10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一个。聚集蛋白质的量可以降低约 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% 中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中聚集蛋白质(例如·HMW)的量与该一个或多个纯化步骤之前的组合物中聚集蛋白质(例如HMW)的量相比较来测定该降低。浸出的A蛋白是从其所结合的固相解吸或洗涤出的A蛋白。例如，浸出的A蛋白可以从A蛋白层析柱浸出。可以例如通过ELISA来测量A蛋白的量。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，浸出的A蛋白的量降低了高于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70 %、80 %或90 %中的任一个。浸出的A蛋白的量可以降低约10 %至99 %、30 %至95 %、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中的任一个。在一些实施方案中，浸出的A蛋白的量可以降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90 %或95 %中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中浸出的A蛋白的量与该一个或多个纯化步骤之前的组合物中浸出的A蛋白的量相比较来测定该降低。测量DNA(如CHO细胞DNA)的方法为本领域已知，并描述于实施例部分中。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，DNA的量降低了高于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中的任一个。DNA的量可以降低约10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至 99% 中的任一个。DNA 的量可以降低约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 99% 中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中DNA的量与该一个或多个纯化步骤之前的组合物中DNA的量相比较来测定该降低。细胞培养基成分指存在于细胞培养基中的成分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，该细胞培养基成分是庆大霉素。可以通过ELISA来测量庆大霉素的量。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，细胞培养基成分的量降低了高于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中的任一个。细胞培养基成分的量可以降低约10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99 %或85 %至99 %中的任一个。在一些实施方案中，细胞培养基成分的量可以降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 98% 中的任一个。在一些实施
方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中细胞培养基成分的量与该一个或多个纯化步骤之前的组合物中细胞培养基成分的量相比较来测定该降低。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该方法可以进一步在本文所述层析步骤中任一个之前或之后包括一个或多个纯化步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(a)和(b)之前或之后使包含多肽的组合物经受一个或多个其他纯化步骤。其他纯化方法包括，例如，羟基磷灰石层析；凝胶过滤层析；亲和层析；凝胶电泳；透析；乙醇沉淀；反相HPLC ;硅石上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸铵沉淀；及金属螯合柱结合表位标记形式的多肽。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括回收该纯化的多肽。在一些实施方案中，从本文所述纯化步骤中的任一个回收该纯化的多肽。该层析步骤可以是阳离子交换层析、混合型层析或A蛋白层析。
在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该方法进一步包括将该纯化方法的纯化的多肽与可药用载体组合。III.多肽提供用于纯化多肽的任意方法及包含通过本文所述方法纯化的多肽的制剂中的多肽。在一些实施方案中，该多肽是治疗性多肽。该治疗性多肽可以抑制肿瘤细胞的生长、诱导凋亡和/或诱导细胞死亡。在一些实施方案中，该多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，该多肽是激动剂。在一些实施方案中，该多肽是抗体。在一些实施方案中，该多肽具有高于约5，000道尔顿、10，000道尔顿、15，000道尔顿、25，000道尔顿、50，000道尔顿、75，000道尔顿、100，000道尔顿、125，000道尔顿或150, 000道尔顿中任一个的分子量。该多肽可以具有约50，000道尔顿至200，000道尔顿或100，000道尔顿至200，000道尔顿中任一个的分子量。备选地，用于本文的多肽可以具有约120，000道尔顿或约25，000道尔顿的分子量。pi是等电点，且是特定分子或表面不携带净电荷的pH。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，多肽的Pl可以是约6至10、7至9或8至9中的任一个。在一些实施方案中，多肽具有约6、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或10中任一个的pi。通常用重组技术来产生待用本文所述方法纯化的多肽。用于产生重组蛋白质的方法描述于例如美国专利号5，534，615和4，816，567中，该专利在此明确引入作为参考。在一些实施方案中，在CHO细胞中产生目的蛋白质(见例如WO 94/11026)。在使用重组技术时，多肽可以在胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌进入培养基中。可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收多肽。可以通过多种物理或化学手段来破碎用于表达多肽的细胞，如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。如果多肽在胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤来去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter 等,Bio/Technology 10 :163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌(E. coli)周质间隙的多肽的方法。简言之，在醋酸钠(pH 3. 5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌进入培养基中时，通常先用市售多肽浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含诸如PMSF的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白质水解，且可以包含抗生素来防止外来污染物的生长。⑷抗体在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，用于纯化多肽的任意方法和包含通过本文所述方法纯化的多肽的制剂中的多肽是抗体。抗体的分子靶标包括⑶蛋白质及其配体，如，但不限于(i)⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、CDlla、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79a(CD79a)和 CD79 β (CD79b) ; (ii)ErbB 受体家族的成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞黏附分子，如LFA-U MacU pl50，95、VLA-4、ICAM-I、VCAM和v/3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CDlla、抗-CD18或抗-CDllb抗体)；(iv)生长因子，如VEGF ；IgE ;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4 ;蛋白C、BR3、c-met、组织因子7等；及(V)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，如美国专利号7，521，541中所述的那些。
其他示例性抗体非限制性地包括选自抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗_p53抗体、抗-HER-2/neu抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗_Bcl_2抗体、抗-E-钙黏蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB_2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-成视网膜细胞瘤蛋白质抗体、抗-ras癌蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-0)3抗体、抗-0)4抗体、抗-0)5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CDlO抗体、抗-CDlla抗体、抗-CDllc抗体、抗-⑶13抗体、抗-⑶14抗体、抗-⑶15抗体、抗-⑶19抗体、抗-⑶20抗体、抗-⑶22抗体、抗-⑶23抗体、抗-⑶30抗体、抗-⑶31抗体、抗-⑶33抗体、抗-⑶34抗体、抗-⑶35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45R0抗体、抗-CD45RA抗体、抗-⑶39抗体、抗-⑶100抗体、抗-⑶95/Fas抗体、抗-⑶99抗体、抗-⑶106抗体、抗-泛素抗体、抗-CD71抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗_波形蛋白抗体、抗-HPV蛋白质抗体、抗-K轻链抗体、抗_λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-S-100抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn抗原抗体。⑴多克隆抗体在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。优选通过多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中产生多克隆抗体。用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的多肽(例如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可以是有用的。通过将例如100 μ g或5 μ g的多肽或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射来用弗氏完全佐剂中的初始量的1/5至1/10的肽或缀合物加强免疫动物。7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物，直至效价平台期。在一些实施方案中，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原与不同的多肽缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为多肽融合物在重组细胞培养物中制备。另外，适宜地用诸如明矾的聚集剂来增强免疫应答。(iii)单克隆抗体在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上同质的抗体的群体，即，除在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位。因此，修饰词“单克隆的”指抗体不是离散抗体或多克隆抗体的混合物的特征。例如,单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature 256 :495 (1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(美国专利号4，816，567)。在杂交瘤法中，按本文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物(如仓鼠)来引发淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的多肽的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies !Principles and Practice, 59-103 页(Academic Press,1986))。将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止缺乏HGPRT的细胞生长。在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞是高效融合、通过所选择的产抗体细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些。在这些中，在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, California USA 获得的衍生自 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤的那些，及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection), Rockville,MarylandUSA获得的SP_2或X63_Ag8_653细胞。还针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor, J. Immunol. 133 :3001 (1984)；Brodeur Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications 51-63 页(Marcel Dekker, Inc.，纽约，1987))。针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。在一些实施方案中，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤产生的单克隆抗体的结合特异性。可以例如通过Munson 等，Anal. Biochem. 107 :220(1980)的 Scatchard 分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。鉴定出产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice 59-103 页(Academic Press, 1986))。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在动物中作为腹水肿瘤体内培养该杂交瘤细胞。通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如多肽A-S印harose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)适宜地从培养基、腹水或血清分离该亚克隆分泌的单克隆抗体。编码该单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，该杂交瘤细胞可作为这种DNA的来源。一旦分离，即可以将该DNA放入表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等，Curr. Opinion inTmmunol. 5 :256-262 (1993)和 Pliickthun, Immunol. Revs.，130 :151-188 (1992)。在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty等，Nature348 =552-554(1990)中的技术产生的抗体卩遼菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352 624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等，Bio/Technology 10 :779-783 (1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse 等，Nuc. Acids. Res. 21 :2265-2266 (1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行的选择。还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国 专利号 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. NatlAcad. Sci. USA 81 :6851 (1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接来修饰DNA。通常，这类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定区，或者它们取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域来产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合部位和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，该抗体是IgG单克隆抗体。(iv)人源化抗体在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。本领域中已描述了用于人源化非人抗体的方法。在一些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。基本上可以按照 Winter 及其同事的方法(Jones 等,Nature 321 :522-525(1986) ;Riechmann 等,Nature332 :323-327(1988) ;Verhoeyen 等，Science 239 :1534-1536 (1988))，通过用高变区序列取代对应的人抗体序列来进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中，用对应的来自非人物种的序列取代了基本上不再完整的人可变结构域。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中，用来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代了一些高变区残基，且可能取代一些FR残基。用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对降低抗原性非常重要。按照所谓的“最佳适合”法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后接受最接近于啮齿动物序列的人序列作为该人源化抗体的人构架区(FR) (Sims 等，J. Immunol. 151 :2296(1993) ;Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 901 (1987))。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。同一构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immnol. 151 :2623 (1993))。保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性来人源化抗体也很重要。为了达到此目的，在该方法的一些实施方案中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可得，并为本领域技术人员所熟悉。说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可得的。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得达到希望的抗体特征，如增加的对一种或多种靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。(V)人抗体在一些实施方案中，该抗体是人抗体。作为人源化之外的选择，可以产生人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转入这类种系突变体小鼠将导致在抗原攻击时产生人抗体。见例如Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) Jakobovits 等，Nature 362:255-258(1993)； Bruggermann 等，Year in Tmmunο. 7 33 (1993);及美国专利号 5，591，669、5，589，369 和5，545，807。备选地，可以用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348 :552-553(1990))来在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库(gene repertoires)产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外被多肽基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；它们的综述见例如Johnson, Kevin S.和Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology3 :564-571 (1993)。可以将 V基因区段的几个来源用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分离了一系列多样化的抗-5恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，且可以基本上按照Marks等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)或Griffith等，EMBO J. 12 =725-734(1993)所述的技术分离抗一系列多样化抗原(包括自身抗原)的抗体。还见美国专利号5，565，332和5，573，905。还可以通过体外活化B细胞来产生人抗体(见美国专利号5，567，610和5，229，275)。(vi)抗体片段在一些实施方案中，该抗体是抗体片段。已发展了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(见例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24 :107-117 (1992)和 Brennan 等，Science 229 81 (1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并化学偶联来形成 F(ab’ )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对本领域的从业者而言显而易见。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见TO 93/16185 ;美国专利号5，571，894 ;及美国专利号5，587，458。抗体片段还可以是描述于例如美国专利号5，641，870中的“线性抗体”。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。在一些实施方案中，提供本文所述的抗体片 段。在一些实施方案中，该抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’ )2片段、scFv、Fv和双抗体。(vii)双特异性抗体在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合两个不同表位。备选地，双特异性抗体结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的 Fe 受体(Fe Y R)，如 Fe Y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16))的臂组合，以将细胞防御机制集中于该细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)制备。用于产生双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中，两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的可能的混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。WO93/08829 和 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655-3659(1991)中公开了类似的方法。根据不同的方法，将具有希望的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在一些实施方案中，该融合是与包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在一些实施方案中，包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CHl)存在于该融合的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在将不等比例的三条多肽链用于构建提供最佳产率时，这为在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，在表达等比例的至少两种多肽链导致高产率时，或在该比例无特殊意义时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。在此方法的一些实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于W094/04690中。产生双特异性抗体的进一步详情见例如Suresh等，MethodsinEnzymology 121:210(1986)。根据美国专利号5，731，168中所述的另一种方法，可以改造抗体分子对间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。在一些实施方案中，该界面包含抗体恒定结构域的至少部分G3结构域。在此方法中，用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链。通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生与一个或多个大的侧链相同或相似大小的补偿“空洞”。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如同二聚体)的机制。双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(美国专利号4，676，980)，并用于治疗HIV感染(W0 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。可以用任意方便的交联方法产生异缀合物抗体。适宜的交联剂为本领域公知，并连同许多交联技术一起公开于美国专利号4，676，980中。还已在文献中描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229 =81(1985)描述了蛋白酶解切割完整抗体来产生F(ab’)2片段的方法。在二巯基络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二巯基并防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原来将Fab’-TNB衍生物之一再转化为Fab’-巯基，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合来形成双特异性抗体。可以将产生的双特异·性抗体用作(用于)选择性固定酶的物质。还已描述了用于直接从重组细胞培养物产生和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等，J. Immunol. 148 (5)1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。在铰链区还原抗体同二聚体形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。还可以利用此方法来产生抗体同二聚体。Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)所述的“双抗体”技术提供了用于产生双特异性抗体片段的备选机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(')连接的重链可变结构域(Vh)，该接头太短而不允许同一条链上的两个结构域间配对。因此，迫使一个片段的Vh和\结构域与另一片段的互补的'和Vh结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。还已报道了通过使用单链Fv(sFv) 二聚体来产生双特异性抗体片段的另一策略。见Gruber等，J. Immunol. 152 :5368(1994)。考虑超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J. Immunol. 147 :60(1991)。(viii)多价抗体在一些实施方案中，该抗体是多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快地被表达该抗体所结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本文提供的抗体可以是(除IgM种类外的)具有三个或多个抗原结合部位的多价抗体(例如四价抗体)，其可以容易地通过重组表达编码该抗体的多肽链的核酸来制备。该多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或多个抗原结合部位。优选的二聚化结构域包含Fe区或铰链区(或由Fe区或铰链区组成)。在这种情况下，该抗体将包含Fe区及Fe区氨基端的三个或多个抗原结合部位。本文优选的多价抗体包含三个至约八个，但优选四个抗原结合部位(或由三个至约八个，但优选四个抗原结合部位组成)。该多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中该一条或多条多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，该一条或多条多肽链可以包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中，VDl是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fe是Fe区的一条多肽连，Xl和X2代表氨基酸或多肽，η是O或I。例如，该一条或多条多肽链可以包含VH-CH1-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CHI-VH-CHI-Fe区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变结构域多肽。例如，本文的多价抗体可以包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且可选地进一步包含CL结构域。(ix)其他抗体修饰可以希望就效应子功能修饰本文提供的抗体，例如，以增强该抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(antigen-dependent cel 1-mediatedcyotoxicity, ADCC)和 / 或依赖补体的细胞毒作用(CDC)。这可以通过在该抗体的Fe区中引入一个或多个氨基酸取代来达到。备选地或此外，可以在Fe区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域中形成链间二硫键。这样产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。见Caron等，J. Exp Med. 176 1191-1195(1992)和 Shopes, B.J.，Immunol. 148 :2918-2922(1992)。还可以用 Wolff等，Cancer Research 53 :2560-2565 (1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造抗体，使其具有双Fe区，从而可以具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3 ·219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以按US 2006/0067930中所述在抗体中产生氨基酸改变，该专利在此以其整体引入作为参考。(B)多肽变体和修饰本文所述的多肽(包括抗体)的一个或多个氨基酸序列修饰可以用于本文所述的纯化多肽(例如抗体)的方法。⑴变体多肽本文定义的“多肽变体”意指与该多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80%氨基酸序列同一性的多肽，优选活性多肽。这类多肽变体包括例如这样的多肽，其中，在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基。通常，TAT多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80%氨基酸序列同一性，备选地，具有至少约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中任一个的氨基酸序列同一性。可选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守性氨基酸取代，备选地，与天然多肽序列相比，具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一个的保守性氨基酸取代。例如与全长天然多肽相比，变体多肽可以在N端或C端截短，或者可以缺乏内部残基。某些变体多肽可以缺乏并非希望的生物学活性所必需的氨基酸残基。可以通过许多常规技术中的任一种来制备这些具有截短、缺失和插入的变体多肽。可以化学合成希望的变体多肽。另一适宜的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码希望的变体多肽的核酸片段。在PCR中的5’和3’引物上利用定义希望的核酸片段末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共有至少一种生物学和/或免疫学活性。氨基酸序列插入包括长度从一个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与增加该抗体的血清半衰期的酶或多肽融合。例如，可以希望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过在抗体核酸中引入适当的核苷酸改变或通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从多肽的氨基酸序列内缺失残基，和/或在多肽的氨基酸序列内插入残基，和/或取代多肽的氨基酸序列内的残基。产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终构建体，只要该最终构建体具有希望的特征。氨基酸改变还可以改变多肽(例如抗体)的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。通过将多肽的序列与已知的同源多肽分子的序列相比较，并最小化在高同源性区域中产生的氨基酸序列改变的数目，可以发现确定可以插入、取代或缺失哪一个氨基酸残基而不负面影响希望的活性的指导。如Cunningham和 Wells, Science 244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定多妝(例如抗体)的某些残基或区域作为优选的诱变位置的优选方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在 此，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性氨基酸或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点或针对取代位点引入进一步的变体或其他变体来精炼对取代显示功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但无需预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点上的突变的性能，在靶密码子或靶区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对希望的活性筛选所表达的抗体变体。另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对取代诱变而言，最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑FR改变。下文表I在“优选取代”的标题下显示保守性取代。如果这类取代导致生物学活性的改变，则可以引入表I中命名为“示例性取代”或如下文参考氨基酸种类进一步描述的更实质性的改变，并筛选产物。表I
初始残基I示例性取代I优选取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
Arg(R)Lys ；Gln ；AsnLys
Asn (N)Gln ；His ；Asp ；Lys ；ArgGln
Asp (D)Glu ；AsnGlu
Cys (C)Ser ；AlaSer
Gln(Q)Asn ；GluAsn
Glu(E)Asp ；GlnAsp
权利要求
1.用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法，其中，所述方法包括⑴或(ii) (i)(a)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将所述组合物加样至阳离子交换材料上和(b)将从所述阳离子交换材料回收的组合物加样至混合型材料上的顺次步骤；或 (ii)(a)将所述组合物加样至混合型材料上和(b)按高于约150g/L阳离子交换材料的加样密度将从混合型材料回收的组合物加样至阳离子交换材料上的顺次步骤。
2.权利要求I的方法，其中所述多肽具有约6和约10之间的pi。
3.权利要求2的方法，其中所述多肽具有约7和约9之间的pi。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述多肽是抗体或免疫黏附素。
5.权利要求4的方法，其中所述多肽是免疫黏附素。
6.权利要求4的方法，其中所述多肽是抗体。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.权利要求7的方法，其中所述单克隆抗体是IgG单克隆抗体。
10.权利要求6的方法，其中所述抗体是抗原结合片段。
11.权利要求10的方法，其中所述抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述至少一种污染物是中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)、浸出的A蛋白、DNA、聚集蛋白质、细胞培养基成分、庆大霉素和病毒污染物中的任意一种或多种。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中(i)和/或(ii)中的顺次步骤是连续的。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述方法是(i)。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述方法是(ii)。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述加样密度在约150g/L和约2000g/L阳离子交换材料之间。
17.权利要求16的方法，其中所述密度在约500g/L和约1000g/L阳离子交换材料之间。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述阳离子交换材料包含羧酸官能团或磺酸官能团。
19.权利要求18的方法，其中所述官能团是磺丙基、磺乙基、磺异丁基或羧基。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述阳离子交换材料是膜、monolith或树脂颗粒。
21.权利要求20的方法，其中所述阳离子交换材料是树脂。
22.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述阳离子交换材料是MustangS、Sartobind S、S03 Monolith、S Ceramic HyperD、Poros HS50、Poros HS20、横丙基-Sepharose Fast Flow (SPSFF) > SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S> Fractogel Se HiCap、Fractogel S03 或 Fractogel COO。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述混合型材料包含能够进行阴离子交换和疏水作用的官能团。
24.权利要求23的方法,其中所述混合型材料是Capto-Adhere树脂、MEPHyperCel树月旨、HEA HyperCel 树脂、PPA HyperCel 树脂或 ChromaSorb 膜。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述方法包括随同所述阳离子交换材料和/或混合型材料使用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液，且所述平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的电导率在约2mS/cm至约25mS/cm之间。
26.权利要求25的方法，其中所述平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的电导率在约3mS/cm和8mS/cm之间。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述方法包括随同所述阳离子交换材料和/或混合型材料使用平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液，且所述平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液的PH在约4. 5和约6. 5之间。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中随同所述阳离子交换材料和/或混合型材料的平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或加样缓冲液是相同的。
29.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括在步骤(a)和(b)之前或之后使包含所述多肽的组合物经受一个或多个其他纯化步骤。
30.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括回收所述纯化的多肽。
31.权利要求30的方法，其进一步包括将所述纯化的多肽与可药用载体组合。
全文摘要
本发明提供用于从包含多肽和至少一种污染物的组合物纯化多肽的方法及包含通过该方法纯化的多肽的制剂。该纯化方法包括阳离子交换材料和/或混合型材料。
文档编号G01N31/00GK102905718SQ201180025404
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者H·F·刘, B·D·凯利, D·E·麦尔斯, B·麦库伊, K·M·佩蒂 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司