专利名称：定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用。
背景技术：
鱼类的发育分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期、未成熟期、成鱼期和衰老期，各时期的划分与鱼类性腺的发育有着直接的关系，对于雌鱼而言，其卵巢中主要的物质为卵黄蛋白，卵黄蛋白在鱼类整个生命周期中起着重要的作用。首先，卵黄蛋白是受精卵的重要物质，为鱼类胚胎发育和仔鱼早期生长提供营养物质和能量来源。其次，在卵黄生成期，卵细细胞从血液中摄取卵黄原蛋白，经加工后以卵黄粒和油滴的形式储存于卵母细胞中，卵黄蛋白的含量直接影响胚胎的存活及仔鱼的生长发育。卵黄原蛋白由雌鱼的肝脏产生，随血液循环到达卵巢，在组织蛋白酶D的作用下，迅速裂解成三种主要卵黄蛋白卵黄脂磷蛋白、卵黄高磷蛋白和P ’组分，储存于卵黄粒中，其中以卵黄脂磷蛋白的含量最为丰富。与卵黄原蛋白相似，卵黄脂磷蛋白也是一种典型的糖脂蛋白，并且含有少量的磷，在胚胎的生长和发育过程中具有多种生物学功能。在卵母细胞的成熟过程中，卵黄脂磷蛋白进一步裂解，释放出脂质，并产生游离氨基酸，为胚胎与稚鱼提供蛋白质合成的原料和有氧能量生产的主要底物，并且在特定的发育时期提供所需的脂质。目前已经研究了黑线鳕、条斑星鲽、杂交鲟等多种鱼类卵黄脂磷蛋白在卵母细胞或胚胎发育过程中变化，并证实卵黄脂磷蛋白通过降解成游离氨基酸，为早期胚胎和稚鱼的发育提供能量和营养物质；卵黄脂磷蛋白还具备调节渗透压的功能，在卵细胞的发育过程中，浮性卵因吸收水分，体积显著增大，发育成熟时，浮性卵中水分含量达到85 95%，卵细胞体积增大:T5倍，为胚胎的发育提供备用水。在这一过程中，游离氨基酸含量的增加，为产生水分流入所需要的渗透压起到重要作用，同时，水含量的增加提供了鱼卵漂浮在水体中所需的浮力。Reith等(2001)、Reading等(2009)和Ohkubo等(2006)证实，浮性卵中的游离氨基酸主要来源于卵黄脂磷蛋白的重链；此外，卵黄脂磷蛋白还具备免疫学功能，在大多数情况下，鱼类的受精和发育要在水环境中进行，而水中往往含有能够引起多种疾病的病原体，在发育初期，胚胎和稚鱼无法合成足够的免疫相关分子，也未形成淋巴器官。因此，在免疫系统发育成熟之前，只能依靠母系物质抵挡入侵的病原菌。师晓栋(2003)发现玫瑰无须鈀的卵黄脂磷蛋白能够抵制多种病原菌的生长；Zhang J和Zhang SC(2011)研究发现，玫瑰无须鈀的卵黄脂磷蛋白与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的结合能力，并能能够增强巨噬细胞的吞噬能力，推测卵黄脂磷蛋白既能够识别入侵的病原菌，又能诱发巨噬细胞消化病原菌，从而保护胚胎和稚鱼免受病害。可见，研究鱼类的卵黄脂磷蛋白对了解鱼类早期发育状况具有极大帮助。目前，国内外已经报道了多种鱼类卵黄脂磷蛋白的纯化与鉴定方法，但大多采用其含有糖、磷、脂基团的特性，采用特异性染色或者分析其糖、磷、脂含量来确定其是否为卵黄脂磷蛋白。这种方法是费时、费力，并且非常不经济。
鲤科鱼类是鲤形目中分布最广、种类也最多的一群，全世界共有鲤科鱼类210属，2000种以上，都是淡水鱼类，在我国各大河流、湖泊中广泛分布，也是我国自古以来农家鱼塘中主要的养殖鱼种。因此，开发鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的检测试剂盒具有广泛的应用前景和科学价值。

发明内容
本发明的目的在于提供一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用，以克服现有技术的不足。—种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有1)PVDF膜2张；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗I支；3)封闭液、洗涤液、显色液各I支，所述的洗涤液为TBST ;封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST ;显色液为含0. 06%(m/V)3’ - 二氨基联苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于该盒体还装有4)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品I支；5)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体I支。上述金鱼卵黄脂憐蛋白纯品为IOOii g/ml金鱼卵黄脂憐蛋白溶液。上述定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒制备方法，包括以下步骤1)制备金鱼卵黄脂磷蛋白纯品；2)利用步骤I)得到的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体；3)将步骤I)得到的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品I支、步骤2)得到的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清I支、PVDF膜2张，以及封闭液、洗涤液、显色液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗I支共同装入盒体，得到鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白定性检测的试剂盒。上述试剂盒在定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白中的应用。目前国内外鉴定鱼类卵黄脂磷蛋白大多采用其含有糖、磷、脂基团的特性，采用特异性染色、氨基酸组成分析或者分析其糖、磷、脂含量来鉴定纯化的蛋白是否为卵黄脂磷蛋白，这种方法是费时、费力，并且非常不经济。此外氨基酸组成分析和糖、磷、脂含量测定对仪器的要求较高，操作复杂。而本发明的试剂盒利用抗原抗体之间的特异性结合能力，能够灵敏、方便地定性检测鲤科鱼类(包括金鱼、鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼等)卵巢或仔鱼体内的卵黄脂磷蛋白，并且检出敏感度要明显高于以上方法。研究鱼类的卵黄脂磷蛋白对了解鱼类早期发育状况具有极大帮助，本发明能够为评价鱼类的生长和生殖状况提供重要参考。


图1为本发明的金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体对金鱼卵黄脂磷蛋白的检测结果；图2为本发明的金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体对鲤鱼卵黄脂磷蛋白的检测结果；图3为本发明的金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体对鲫鱼卵黄脂磷蛋白的检测结果；图4为本发明的金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体对斑马鱼卵黄脂磷蛋白的检测结果。
具体实施例方式一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有1)PVDF膜2张；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗I支；3)封闭液、洗涤液、显色液各I支，所述的洗涤液为TBST ;封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST ;显色液为含0. 06%(m/V) 3’ - 二氨基联苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于该盒体还装有4)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品I支；5)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体I支。上述金鱼卵黄脂磷蛋白纯品为IOOii g/ml金鱼卵黄脂磷蛋白溶液。上述试剂盒中的4)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品，是以如下方法制备的取卵黄形成后期的雌性金鱼卵巢组织，去除结缔组织，收集鱼卵，加入3倍体积4°C预冷的匀浆缓冲液(25mM Tris-HCl,内含 70mM NaCl, IOmM EDTA和 ImM PMSF，pH7. 5)混合，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，40C，IOOOOg离心20分钟，收集上清液；向上清液中缓缓加入(NH4)2SO4粉末至70%的饱和度，盐析过液；10小时后，在4°C下，以8000g离心10分钟，弃去上清，将沉淀重新溶解于25mM Tris-HCl (内含0. 07M NaCl，pH7. 5)，获得卵匀浆提取液；取Iml卵匀浆提取液加入S印hacryl S-300层析柱，用含0. 07M NaCl的25mM Tris-HCKpH 7.5)洗脱，收集含有金鱼卵黄脂磷蛋白的样品用于离子交换层析(DEAE-Sepharose FastFlow),用分别含 0. 07M、0. 1M、0. 2M、0. 3M 和1. OM NaCl 的 Tris-HCl缓冲液(25mM, pH 7. 5)进行不连续洗脱，收集0. 2M脱组分，鉴定为金鱼卵黄脂磷蛋白纯品，_80°C保存。上述试剂盒中的5)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体，是以如下方法制备的采用腹腔注射雄性小鼠的方式，每只小鼠注射纯化的金鱼卵黄脂磷蛋白50y g，注射前将等体积抗原与弗氏完全佐剂充分混匀；此后，在第14、21、28、35、38天分别注射，注射剂量为50 yg，注射前将等体积抗原与弗氏完全佐剂充分混匀；第40天采血，采血前一天停食。采用眼眶取血法取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体；采用硫酸铵沉淀的方法制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体首先将鼠抗血清与阴性对照血浆2:1混合，4°C摇晃过夜，离心去除非特异性的抗体，然后加入(NH4)2SO4粉末至20%的饱和度，4°C摇晃2个小时，离心除去纤维蛋白；加50%的饱和硫酸铵，4°C摇晃2个小时，离心除去白蛋白；加33%的饱和硫酸铵，4°C摇晃2个小时；4°C,8000g离心10分钟，即获得鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体，_80°C保存。经过以上操作，得到的定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒具体组成如下I) PVDF膜2张；2)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品I支，使用前用PBS稀释至I U g/ml ；3)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体I支，使用前用封闭液按1:300的体积比稀释；4)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗I支，使用前用封闭液按1:500的体积比稀释；5)封闭液、洗涤液、显色液各I支，所述的洗涤液为TBST (IOOmM Tris-HCl、150mMNaCl、0. 05%Tween_20，pH7. 5);封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST ;显色液为含0.06%(m/V)3’ - 二氨基联苯胺(DAB)的IOmM Tris-HCl，使用前向显色液中加入0. 05%(v/v)双氧水。本发明的试剂盒可用于鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的定性检测。利用本发明的试剂盒定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的方法，具体包括以下步骤I)将试剂盒中的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品和待测的样品稀释后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述的待测的样品包括从鱼类卵巢中纯化的蛋白、雌鱼卵巢匀浆液或者仔鱼的匀浆液；2)把电流凝胶上的蛋白转印到PVDF膜；3)用封闭液封闭PVDF膜的非特异性结合位点，4°C孵育过夜，弃去封闭液；4)加入用封闭液稀释的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体(1:300)，室温下震荡孵育，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；5)加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:500)，室温下震荡孵育，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；6)加入显色液，待蛋白质条带清晰后，弃去显色液，用蒸馏水终止显色反应，PVDF膜拍照后于避光处保存；7)在样品中发现有显色条带，表明纯化的蛋白为鱼类卵黄脂磷蛋白，颜色的深浅及条带的宽度代表了样品中卵黄脂磷蛋白的含量多少；此外，可以利用光密度测定软件半定量分析各样品中卵黄脂磷蛋白的含量。如附图1-4所示，其结果依次为图1对金鱼卵黄脂磷蛋白的检测；图2对鲤鱼卵黄脂磷蛋白的检测；图3对鲫鱼卵黄脂磷蛋白的检测；图4对斑马鱼卵黄脂磷蛋白的检测。可以看到在PVDF膜上均出现了明显的条带，即本发明的试剂盒及其检测方法在定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白方面有很好的应用。
权利要求
1.一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有1)PVDF膜2张；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗I支；3)封闭液、洗涤液、显色液各I支，所述的洗涤液为TBST ;封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST ;显色液为含O. 06%(m/V) 3’ - 二氨基联苯胺的IOmM Tris-HCl ;其特征在于该盒体还装有4)金鱼卵黄脂磷蛋白纯品I支；5)鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体I支。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品为100 μ g/ml金鱼卵黄脂磷蛋白溶液。
3.如权利要求1所述的鉴定与定性检测鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，其特征在于所述的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品的制备方法如下取卵黄形成后期的雌性金鱼卵巢组织，去除结缔组织，收集鱼卵，加入3倍体积4°C预冷的匀浆缓冲液混合，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，4°C，IOOOOg离心20分钟，收集上清液；向上清液中缓缓加入(NH4)2SO4粉末至70%的饱和度，盐析过液；10小时后，在4°C下，以8000g离心10分钟，弃去上清，将沉淀重新溶解于25mM Tris-HCl (内含O. 07M NaCl，pH7.5)，获得卵匀浆提取液；取Iml卵匀浆提取液加入S印hacryl S-300层析柱，用含O. 07M NaCl的25mMTris-HCKpH 7.5)洗脱；收集含有金鱼卵黄脂磷蛋白的样品进行离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分别含 O. 07Μ、0· 1Μ、0· 2Μ、0· 3Μ和1. OM NaCl 的 Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 7. 5)进行不连续洗脱，收集O. 2M脱组分，鉴定为金鱼卵黄脂磷蛋白纯品。
4.如权利要求3所述的鉴定与定性检测鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒，其特征在于所述的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体的制备方法如下采用腹腔注射雄性小鼠的方式，每只小鼠注射纯化的金鱼卵黄脂磷蛋白50μ g，注射前将等体积抗原与弗氏完全佐剂充分混匀；此后，在第14、21、28、35、38天分别注射，注射剂量为50μ g，注射前将等体积抗原与弗氏不完全佐剂充分混匀；第40天采血，采血前一天停食；采用眼眶取血法取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体；采用硫酸铵沉淀的方法制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体首先将鼠抗血清与阴性对照血浆2:1混合，4°C摇晃过夜，离心去除非特异性的抗体，然后加入(NH4)2SO4粉末至20%的饱和度，4°C摇晃2个小时，离心除去纤维蛋白；加50%的饱和硫酸铵，4°C摇晃2个小时，离心除去白蛋白；加33%的饱和硫酸铵，4°C摇晃2个小时；4°C,8000g离心10分钟，即获得鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体。
5.权利要求1所述的鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白定性检测试剂盒，其特征在于该试剂盒在鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的鉴定中的应用。
6.利用权利要求1所述的试剂盒定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)将试剂盒中的金鱼卵黄脂磷蛋白纯品和待测的样品稀释后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述的待测的样品包括从鱼类卵巢中纯化的蛋白、雌鱼卵巢匀浆液或者仔鱼的匀浆液；2)把电泳凝胶上的蛋白转印到PVDF膜；3)用封闭液封闭PVDF膜的非特异性结合位点，4°C孵育过夜，弃去封闭液；4)加入用封闭液按1:300的体积比稀释的鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体，室温下震荡孵育4小时，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；5)加入用封闭液按1:500的体积比稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温下震荡孵育4小时，弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；6)加入显色液，待蛋白质条带清晰后，弃去显色液，用蒸馏水终止显色反应，PVDF膜拍照后于避光处保存； 7)在样品中发现有显色条带，表明纯化的蛋白为鱼类卵黄脂磷蛋白，颜色的深浅及条带的宽度代表了样品中卵黄脂磷蛋白的含量；或者利用光密度测定软件半定量分析各样品中卵黄脂磷蛋白的含量。
全文摘要
定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用。其试剂盒含有金鱼卵黄脂磷蛋白纯品与鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体。其制备方法为首先纯化出金鱼卵黄脂磷蛋白，通过免疫小鼠制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清，进一步纯化获得鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体。本试剂盒可以用于鲤科鱼类卵巢和仔鱼体内卵黄脂磷蛋白的鉴定和定性分析，避免了传统的糖、磷、脂染色、氨基酸组成分析等复杂方法，在一定程度上减少了财力、时间和工作量，并在提高工作效率的基础上，极大得提高了检测敏感度，最低检出限约为100ng/ml。
文档编号G01N33/68GK103033630SQ201210557080
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者汝少国, 王军, 王蔚, 田华 申请人:中国海洋大学