专利名称：能够在体外自我复制的诱导性前癌干细胞或诱导性恶性干细胞，这些细胞的制备方法，及 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导性前癌干细胞或诱导性恶性干细胞，涉及具有内源性抑癌基因突变、内源性癌相关基因表达升高等的异常，表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因、TERT基因等的自我复制相关基因，能够在体外进行自我复制的诱导性前癌干细胞或诱导性恶性干细胞(本发明在下文中统称为“诱导性癌症干细胞”)，这些细胞的制备方法，以及这些细胞的应用。
背景技术：
近年来，通过研究胚胎干细胞(也称为“ES细胞”。在本说明书下文中记载为“胚胎干细胞”)，和通过进一步研究体细胞克隆胚胎干细胞，以及体细胞克隆动物的创造等所谓的体细胞克隆，认为可以对表观遗传学(DNA甲基化和组蛋白修饰)进行重新编程(也称 为“初始化”。在本说明书下文中记载为“重新编程”)。实际上，有人报道了这样的实验结果将作为癌细胞的小鼠黑色素瘤细胞的细胞核移植到去核卵细胞中，所述卵细胞开始胚胎发生，从所述胚胎获得的胚胎干细胞可分化为黑色素细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等的细胞(非专利文献I)。最近，报告了通过导入0CT3/4基因(也有时记载为“ 0CT3基因”、“ 0CT4基因”或“P0U5F1基因”的情况)、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因(专利文献1)，或者在存在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)的情况下，导入0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因(非专利文献2),可以从人的体细胞重新编程制备诱导性多能干细胞(induced PluripotentStemCells;也称为“iPS细胞”)，S卩，与胚胎干细胞一样未分化的细胞(专利文献2)。已知人的诱导性多能干细胞具有2个特点(I)具有向三胚层分化的分化多能性，所述三胚层是能够形成建成个体形态的所有细胞；(2)具有在人胚胎干细胞能够自我复制的培养条件下，可以维持其未分化性的情况下在培养皿中无限传代培养，即所谓的自我复制能力。因此，这类人的诱导性多能干细胞在形态、基因表达、细胞表面抗原、长期的自我复制能力、形成畸胎瘤(在体内分化为三胚层)的能力的方面，与人胚胎干细胞非常相似(非专利文献3、非专利文献4)，此外，还报道了 HLA基因型与来源细胞的体细胞完全相同(非专利文献4)。这些细胞的制备方法是只导入上述基因(即，0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因，或在存在bFGF的情况下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因)，即可使已分化的体细胞“重新编程”为诱导性多能干细胞。一方面，基于基因突变和/或表观遗传学的异常，产生基因表达的升高、降低或消失的异常，由此使细胞癌变。因此，使用上述重新编程的技术，可以将癌细胞中发生的各种异常重新编程，使其恢复为正常的细胞，丧失癌细胞的性质。实际上，最近在国际干细胞学会(ISSCR)中，有人发表了以下发现“向培养皿中的人肝癌细胞株来源的癌症干细胞(HuH7来源的CD133阳性细胞)中添加抗癌剂等2种化学物质(非环型视黄醒(acyclic retinoids)和托瑞司他(tolrestat)), 2天后,85-90%的癌细胞变成了正常的肝细胞。进一步的，添加2个基因(S0X2基因和KLF4基因)与2种化学物质(5-AZAC和TSA)，则成为诱导性多能干细胞，按照向肝细胞分化的规程(protocol)，成功地使所获得的诱导性多能干细胞分化为肝细胞(AFP或ALB阳性细胞)”(非专利文献5)。此外，使作为癌细胞的小鼠黑色素瘤细胞重新编程为诱导性多能干细胞的论文(非专利文献6)报道了通过导入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因而重新编程的结果，使从作为成癌原因的具有BCR-ABL酪氨酸激酶活性的慢性骨髓性白血病细胞(CML)制备出丧失了 BCR-ABL酪氨酸激酶依赖性的诱导性多能干细胞(非专利文献7)。此外，还报道了向癌细胞株中导入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因，通过重新编程消除了抗药性和成瘤能力，但是经过长期培养，伴随c-MYC基因的活化而产生癌变(非专利文献8)。在传统研究中，通过强制表达SV40、HPV的E6基因、E7基因、TERT基因进行细胞的永生化培养，通过导入c-MYC基因、RAS基因等癌基因引起癌变等，在建立癌细胞株后，再用于用普通的常规培养基培养的癌细胞株。然而，在用普通的常规培养基建立的癌细胞株中，存在这样的问题S卩，由于显著·地产生培养后的人为的染色体异常(转座、缺失等)、遗传学异常(基因突变)、成为基因表达异常的原因的表观遗传学异常，难以原样保持在原本作为生物体内成癌原因的原癌细胞、癌细胞中发生的异常。这些细胞株均不是通过在体外的自我复制的培养中建立的细胞株。在癌症治疗的研究和癌症相关的制药研究中，即使分析这类用传统培养基建立的癌细胞株的遗传学异常和表观遗传学异常，也极其难以判断这些异常是在哺乳动物的原有的原癌细胞、癌细胞中发生的异常，还是在培养后发生的人为异常，因此基于这些分析结果不能进行正确的癌症成因探索、创新药物靶的探索、癌症治疗药物的筛选等。此外，虽然作为创新药物靶的癌症干细胞的存在受到重视，但是存在这样的问题，即包含在新鲜的癌组织中的癌细胞是分阶层的(hierarchical)、异质的细胞群，无法弄清楚哪些癌细胞是癌症干细胞。近年来，报道了从癌细胞株或原代培养癌细胞中鉴别出癌症干细胞的研究(非专利文献9)。但是，尚未有将单克隆癌症干细胞在体外自我复制而进行了长期培养的报告，也未有将其通过自我复制增殖培养，而获得使其足以在体外应用于创新药物、或癌症研究所必需的数量的报导。(现有技术文献)(专利文献)专利文献I :日本特开2008-283972专利文献2 日本特开2008-307007(非专利文献)非专利文献I :Hochedlinger K, Jaenisch R 等人，Genes Dev. , 2004, 18 1875-1885非专利文献2:Nakagawa M, Yamanaka S等人,Nat Biotechnol. , 2008, 26 :101-106非专利文献3 :Takahashi K, Yamanaka S 等人，Cell, 2007，131 :861-872非专利文献4 Masaki H, Ishikawa T 等人，Stem Cell Res. , 2008, I :105-115非专利文献5 :国际干细胞学会、2009年、抄录序号1739 (285页)非专利文献6 :Utikal J 等人，J Cell Sci.，2009，122 (Ptl9) :3502-3510
非专利文献7 =Carette JE 等人，Blood, 2010，115 :4039-4042非专利文献8 :Nagai K 等人,Biochem Biophys Res Commun.，2010，395 :258-263非专利文献9 :Visvader JE, Lindeman GJ, Nat Rev Cancer. , 2008, 8 :755-768

发明内容
(发明要解决的问题)因此，本发明的目的，是提供具有与成癌相关的特定基因突变或基因表达异常、能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞，以及所述诱导性癌症干细胞的制备方法。本发明的其他目的，是提供使用本发明的能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞，筛选癌症创新药物靶、筛选癌症治疗药物、筛选癌症诊断药物等的筛选方法，或者使 用该诱导性癌症干细胞制备癌症疫苗的方法。本发明另一个目的，是提供将本发明的能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞移植到实验动物中，制备癌症模型动物的方法。(解决课题的手段)在本发明的第I种形态中，提供了能够在体外增殖的诱导性癌症干细胞，其特征是具有下述(I)和(2)的要素(I)表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因(自我复制相关基因)；(2)具有(a)内源性抑癌基因突变，或(b)内源性癌症相关基因的表达升高中任一种的异常。在本发明的这一形态中，所述诱导性癌症干细胞中表达的所述(I)自我复制相关基因的表达量，与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比，优选是1/8至8倍。本发明的诱导性癌症干细胞也可以是这样的细胞，S卩，除(b)所述内源性癌症相关基因表达升高外，选自下述群组中所含的基因的群中的至少I种内源性基因也发生基因表达升高，所述群组由胁迫和毒性相关基因群、表观遗传学染色质修饰酶基因群、干细胞转录因子基因群所构成；或者，除(b)所述内源性癌症相关基因表达升高外，选自肝细胞特异性基因群中所含的基因的群中的至少I种基因也发生基因表达升高。在本发明的诱导性癌症干细胞中，还可以表达中内胚层系干细胞、内胚层系干细胞中特征性表达的基因。在本发明的第2种形态中，提供了制备本发明的诱导性癌症干细胞的方法，是从选自(a)从具有抑癌基因突变的哺乳动物中采集的体细胞，以及从成癌的哺乳动物中采集的具有(a)抑癌基因突变或(b)癌症相关基因表达升闻中任一种异常的体细胞所构成的群组中选择的非胚胎的原料体细胞，制备能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞的方法，所述方法的特征在于进行使所述原料体细胞处于P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物在所述原料体细胞中存在的状态的诱导步骤。细胞是“非胚胎”的情况下，意味着该细胞不是胚胎干细胞、胚胎、生殖细胞、原始生殖细胞的细胞。在本发明中，P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物在上述原料体细胞中的存在比例可以满足P0U5F1基因> S0X2基因的关系。此外，在本发明中，优选使用P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因，或其基因产物，这些P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因，或其基因产物的使用比例可以满足P0U5F1基因> S0X2基因的关系。在本发明中，除上述诱导步骤外，还可以包括在I个孔中分选I个细胞进行增殖的步骤。在本发明中，除上述诱导步骤外，还可以包括通过鉴别能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞的恶性性质或特异性标志物而进行分选的分选步骤。所述分选步骤，是对将(a)具有内源性抑癌基因突变的哺乳动物中采集的体细胞以及从成癌的哺乳动物中采集的非胚胎原料体细胞，进行诱导处理后的，具有(a)抑癌基因突变或(b)癌症相关基因表达升高中任一种异常的诱导性癌症干细胞；以及，作为比较对象的，从哺乳动物中采集的体细胞诱导而成的诱导性中内胚层系干细胞、诱导性内胚层系干细胞或诱导性多能干细胞或者胚胎干细胞进行比较，通过鉴别恶性性质或特异性标志物的而进行分选的步骤。特别是，所述分选步骤也可以是通过鉴别与选自下述群组中所含的基因的群中的 至少I种基因相关的(b)癌症相关基因的表达升高而进行分选的分选步骤，所述群组由血管新生相关基因群、癌症相关通路基因群、间质屏障相关基因群、上皮-间充质转化相关基因群、胃癌相关基因群、自主增殖相关基因群、TGFi3 /BMP信号相关基因群、组织浸润·转移相关基因群、fct信号相关基因群、信号传递相关基因群、Notch信号相关基因群、乳腺癌和雌激素受体信号相关基因群、结肠癌相关基因群、低氧信号相关基因群、GPCR信号相关基因群、药剂耐受性相关基因群、Hedgehog信号相关基因群、PI3K-AKT信号相关基因群、药物代谢基因群、癌症分子机制基因群、SMAD信号网络相关基因群、胰腺癌相关基因群、前列腺癌相关基因群、肝癌相关基因群、肺癌相关基因群所构成。在本发明的第3种形态中，提供了选自筛选癌症创新药物靶的方法、筛选癌症治疗药物的方法和筛选癌症诊断药物的方法中的I种筛选方法，其特征在于使用权利要求I 10的任一项中记载的诱导性癌症干细胞。在本发明的第4种形态中，提供了以使用本发明的诱导性癌症干细胞为特征的癌症疫苗的制备方法；在本发明的第5种形态中，提供了以向实验动物中移植本发明的诱导性癌症干细胞为特征的癌症模型动物的制作方法。(发明的效果)通过本发明，可以实现具有(a)内源性抑癌基因突变或(b)内源性癌症相关基因的表达升高等异常，同时表达P0U5FI基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因、TERT基因等自我复制相关基因的诱导性癌症干细胞，其制备方法和这些细胞的应用。本发明的诱导性癌症干细胞，不仅原样保持了原料体细胞所具有的(a)抑癌基因突变，或(b)癌症相关基因表达升高等异常，而且一并具有作为干细胞特征之一的理论上能够无限自我复制的特征。因此，本发明的诱导性癌症干细胞实际上可以长期传代培养，易于诱导成为具有组织细胞性质的癌细胞，因而在癌症创新药物中的靶标筛选方法、癌症治疗药物的筛选方法和癌症治疗药物的筛选方法等筛选方法中，在癌症疫苗的制备方法、癌症丰吴型动物的制备等中，以及在癌症治疗的研究和癌症相关创新药物的研究中非常有效。
附图简介图I是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞GC1-5，相比人胚胎干细胞hES_BG03(GSM194391)，具有2倍以上表达升高的血管新生相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图2是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞GC1-5，相比人胚胎干细胞hES_BG03(GSM194391)，具有2倍以上表达升高的上皮-间充质转化相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图3是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞GC1-5，相比人诱导性多能干细胞hiPS-201B7,具有2倍以上表达升高的TGF β /BMP信号相关基因的图。图中，中间的线是与人诱导性多能干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图4是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞NGC1-1，相比人诱导性多能干细胞hiPS-201B7，具有2倍以上表达升高的组织浸润 转移相关基因的图。图中，中间的线是与人诱导性多能干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图5是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞NGC1-1，相比人胚胎干细胞hES_H9(GSM194390)，具有2倍以上表达升高的Wnt信号相关基因的图。图中，中间的线是与人胚 胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图6是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞GC1-5，相比人胚胎干细胞hES_H9(GSM194390),具有几乎相同程度(1/2 2倍)表达的自我复制相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图7是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞NGC1-1，相比人胚胎干细胞hES_BG03，具有几乎相同程度(1/2 2倍)表达的自我复制相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图8是描述了本发明的人诱导性恶性干细胞CC1-10，相比人胚胎干细胞hES_BG03，具有几乎相同程度(1/4 4倍)表达的自我复制相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其4倍、下方的线是其1/4倍。图9是描述了人诱导性恶性干细胞RBT203 (1_1 )，相比人胚胎干细胞hES_ES01(GSM194392)，具有2倍以上表达升高的血管新生相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。

图10是描述了本人诱导性恶性干细胞RBT203 (1_1 )，相比人诱导性多能干细胞hiPS-201B7，具有2倍以上表达升高的信号传递传递相关基因的图。图中，中间的线是与人诱导性多能干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。图11是描述了人诱导性恶性干细胞RBT203 (1_1 )，相比人胚胎干细胞hES_ES01(GSM194392)，具有几乎相同程度(1/2 2倍)表达的自我复制相关基因的图。图中，中间的线是与人胚胎干细胞的基因表达处于同等程度、上方的线是其2倍、下方的线是其1/2倍。
具体实施例方式如前所述，现在确立了这样的概念S卩，与将体细胞重新编程为诱导性多能干细胞相同，通过将癌细胞重新编程，可以使癌细胞恢复为正常的细胞。相对于此，本发明人做出了这样的假设S卩，一般而言，新鲜的癌组织和原代培养的癌细胞集团均具有异质性(heterogeneous),因此,虽通称为癌组织、癌细胞群,其中混合了具有与正常细胞相同或相似的遗传学和表观遗传学的正常细胞和非癌细胞，因此，不是将癌细胞重新编程为正常细胞，而是将新鲜的癌组织和原代培养的癌细胞集团中混在的非癌细胞和正常细胞诱导为正常的诱导性多能干细胞，同时，将存在于新鲜的癌组织和原代培养癌细胞集团中的、具有抑癌基因突变、基因表达异常等的癌细胞，诱导为具有源自该癌细胞的抑癌基因突变、基因表达异常等的癌症干细胞。基于这一假设，应用导入P0U5FI基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因，或者导入P0U5F1基因、S0X2基因和KLF4基因等制备诱导性多能干细胞的技术，可以制备出能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞，并且，所获得的诱导性癌症干细胞在体外自我复制时，在遗传学或表观遗传学上维持了癌症的恶性性质，认为所述能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞可以在培养条件下无限增殖。因此，本发明人在该假设的基础上深入研究，结果发现使用从具有内源性抑癌基因突变的哺乳动物中采集的体细胞，以及从成癌的哺乳动物中采集的非胚胎细胞作为原料，使上述原料体细胞中存在P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物，获得了能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞。
进一步的，当原料体细胞处于此类状态时，P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物在细胞内存在的比例被明确是决定分化的一个重要因素。进一步的，还发现了通过改变P0U5F1基因、KLF4基因、S0X2基因等在细胞内存在的比例，可以制备诱导性中内胚层系干细胞、诱导性内胚层系干细胞。换言之，本发明人等发现了通过改变S0X2基因、P0U5F1基因和KLF4基因的翻译产物在细胞内存在的比例，可以制备诱导性中内胚层系前癌干细胞或诱导性中内胚层系恶性干细胞、诱导性内胚层系前癌干细胞或诱导性内胚层系恶性干细胞、诱导性前癌症多能性干细胞或诱导性恶性多能性干细胞等本发明的诱导性癌症干细胞。并且，如此获得的本发明的诱导性癌症干细胞、通过用去除了 bFGF的培养基、胚胎干细胞使用的培养基以外的培养基培养，再移植到实验动物中的方法，通过诱导分化消除了自我复制，可容易的诱导为癌细胞。由此，本发明人发现了本发明的诱导性癌症干细胞，所述诱导性癌症干细胞保持了基因突变或基因表达的升高，换言之，在生物体内的癌症的恶性性质，换言之，原料体细胞所具有的异常，同时，在理论上可以无限的自我复制，实际上可以长期传代培养；同时，发现了这些细胞可以应用于在体外创新药物以及用于癌症研究，从而完成了本发明。在本说明书的下文中，“抑癌基因”是指编码具有抑制癌症发生的功能的蛋白质的基因，在本发明的诱导性癌症干细胞中，意指发生了突变的基因。本发明中的“癌症相关基因”是指通过基因表达升闻的异常，引起细胞癌变的基因，和与细胞癌变相关的基因，在本发明的诱导性癌症干细胞中，意指发生了基因表达升闻的基因。在下文中详细说明了本发明的诱导性癌症干细胞、其制备方法和这些细胞的应用。(诱导性癌症干细胞)在本发明的第I种形态中，提供了诱导性癌症干细胞，其特征是具有下述(I)和
(2)的要素:(I)表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因(自我复制相关基因)；和
(2)具有(a)内源性抑癌基因突变，或(b)内源性癌症相关基因的表达升高中任一种的异常。具有此类特征的细胞确定是能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞。在本发明中，(I)自我复制相关基因、(2) (a)内源性抑癌基因、(b)内源性癌症相关基因等中的“内源性”意味着这些基因不是通过基因导入等导入到细胞中的外源性基因，而是原本存在于细胞中的基因。在所述技术领域中，一般提及“干细胞”的情况下，表示具有可以分化为特定细胞的能力(分化能力)和可以随细胞分裂维持与原始细胞相同性质的能力(自我复制能力)的细胞。其中，在提及自我复制能力的情况下，表示可以分裂产生相同的细胞，在具有本发明的(I)的性质和(2)的性质的细胞的情况下，意味着至少可以进行3天的增殖培养或传代培养。本发明的诱导性癌症干细胞是包括“诱导性前癌干细胞”和“诱导性恶性干细胞”在内的概念。本发明中的“诱导性前癌干细胞”是指在单侧等位基因具有引起家族性肿瘤的 基因异常的体细胞，是癌变预备阶段的前癌细胞，通过表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因(自我复制相关基因)，被诱导为至少具有自我复制能力的细胞。本发明中的“诱导性恶性干细胞”是指具有内源性癌症相关基因的表达升高的细胞，通过表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因(自我复制相关基因)，诱导出的至少具有自我复制能力的细胞，或者是从至少在单侧等位基因上具有引起家族性肿瘤的基因异常的体细胞，或家族性肿瘤患者的癌组织来源的细胞所制备的、通过表达P0U5FI基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因(自我复制相关基因)，诱导出的至少具有自我复制能力的细胞。本发明的诱导性癌症干细胞中不仅含有表现出多能性的诱导性癌症干细胞，而且含有中内胚层系、内胚层系的诱导性癌症干细胞。在本文中，提及“中内胚层系”的干细胞的情况下，是具有分化为属于中胚层系或内胚层系组织的细胞的能力的干细胞，意味着表达中内胚层系基因的细胞，是分化为血管、血细胞、肌肉、骨、软骨、心肌、骨骼肌、胃、肺、胰腺、肝脏、小肠、大肠等的细胞。此外，在提及“内胚层系”的干细胞的情况下，是在分化阶段中，位于上述中内胚层系的干细胞的下位的干细胞，是具有分化为属于内胚层系组织的细胞的能力的干细胞，意味着表达内胚层系基因的细胞。这些干细胞是分化为胃、肺、胰腺、肝脏、小肠、大肠等的细胞。诱导件癌症干细胞中的基因表汰(I)本发明中的上述(I)的基因(自我复制相关基因)是已知为胚胎干细胞的标志物基因的基因。这些基因是具有能够长期传代培养本发明的诱导性癌症干细胞这一性质的细胞所特有的基因(自我复制相关基因)，所述诱导性癌症干细胞在理论上可以无限自我复制，在实际上能够在体外自我复制。这些基因的具体例子可列举下表I的基因。[表 I]
权利要求
1.诱导性癌症干细胞，是诱导性前癌干细胞或诱导性恶性干细胞，其特征在于 至少具有下述(I)和(2)的要素 (1)表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因； (2)具有(a)内源性抑癌基因突变，或(b)内源性癌症相关基因的表达升高中任一种的异常。
2.权利要求I中记载的诱导性癌症干细胞，所述诱导性癌症干细胞中表达的所述(I)自我复制相关基因的表达量，与胚胎干细胞中表达的基因的表达量相比，是1/8至8倍。
3.权利要求I或2中记载的诱导性癌症干细胞，是诱导性前癌干细胞。
4.权利要求3中记载的诱导性癌症干细胞，(a)所述抑癌基因是APC基因或RBl基因。
5.权利要求I或2中记载的诱导性癌症干细胞，是诱导性恶性干细胞。
6.权利要求5中记载的诱导性癌症干细胞，(b)所述癌症相关基因，是选自下述群组中所含的基因的群中的至少I种基因群， 所述群组由血管新生相关基因群、癌症相关通路基因群、间质屏障相关基因群、上皮-间充质转化相关基因群、胃癌相关基因群、自主增殖相关基因群、TGFP/BMP信号相关基因群、组织浸润·转移相关基因群、fct信号相关基因群、信号传递相关基因群、Notch信号相关基因群、乳腺癌和雌激素受体信号相关基因群、结肠癌相关基因群、低氧信号相关基因群、GPCR信号相关基因群、药剂耐受性相关基因群、Hedgehog信号相关基因群、PI3K-AKT信号相关基因群、药物代谢基因群、癌症分子机制基因群、SMAD信号网络相关基因群、胰腺癌相关基因群、前列腺癌相关基因群、肝癌相关基因群、肺癌相关基因群所构成。
7.权利要求5或6中记载的诱导性癌症干细胞，除(b)所述内源性癌症相关基因外，选自下述群组中所含的基因的群中的至少I种内源性基因也发生基因表达升高， 所述群组由胁迫和毒性相关基因群、表观遗传学染色质修饰酶基因群、干细胞转录因子基因群所构成。
8.权利要求5 7的任一项中记载的诱导性癌症干细胞，除(b)所述内源性癌症相关基因外，选自肝细胞特异性基因群中所含的基因的群中的至少I种基因也发生基因表达升闻。
9.权利要求5 8的任一项中记载的诱导性癌症干细胞，还表达中内胚层系干细胞、内胚层系干细胞中特征性表达的基因。
10.权利要求9中记载的诱导性癌症干细胞，所述中内胚层系干细胞中特征性的基因是GSC基因，所述内胚层系干细胞中特征性的基因，是选自GSC基因、GATA4基因、F0XA2基因、SOX17基因中的至少一种。
11.诱导性癌症干细胞的制备方法，所述诱导性癌症干细胞是诱导性前癌干细胞或诱导性恶性干细胞，是由(a)具有内源性抑癌基因突变的哺乳动物中采集的体细胞，以及从成癌的哺乳动物中采集的非胚胎的原料体细胞，制备具有权利要求I的(I)和(2)的特征的诱导性癌症干细胞的方法，其特征在于 进行使所述原料体细胞处于P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物在所述原料体细胞中存在的状态的诱导步骤。
12.权利要求11中记载的诱导性癌症干细胞的制备方法，P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因的基因产物在所述原料体细胞中的存在比例，满足P0U5F1基因> S0X2基因的关系O
13.权利要求11或12中记载的制备方法，使用P0U5F1基因、KLF4基因和S0X2基因，或这些的基因产物。
14.权利要求11 13的任一项中记载的制备方法，还包括在I个孔中分选I个细胞进行增殖的步骤。
15.权利要求11 14的任一项中记载的制备方法，还包括通过鉴别能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞的恶性性质或特异性标志物而进行分选的分选步骤。
16.权利要求15中记载的制备方法，所述分选步骤， 是对将(a)具有内源性抑癌基因突变的哺乳动物中采集的体细胞以及从成癌的哺乳动物中采集的非胚胎原料体细胞，进行诱导处理后的细胞， 以及， 作为比较对象的，从哺乳动物中采集的体细胞诱导而成的诱导性中内胚层系干细胞、诱导性内胚层系干细胞或诱导性多能干细胞或者胚胎干细胞 进行比较，通过鉴别恶性性质或特异性标志物的而进行分选的步骤。
17.权利要求15或16中记载的制备方法，所述分选步骤， 是通过鉴别与选自下述群组中所含的基因的群中的至少I种基因相关的癌症相关基因的表达升高而进行分选的分选步骤， 所述群组由血管新生相关基因群、癌症相关通路基因群、间质屏障相关基因群、上皮-间充质转化相关基因群、胃癌相关基因群、自主增殖相关基因群、TGFP/BMP信号相关基因群、组织浸润·转移相关基因群、fct信号相关基因群、信号传递相关基因群、Notch信号相关基因群、乳腺癌和雌激素受体信号相关基因群、结肠癌相关基因群、低氧信号相关基因群、GPCR信号相关基因群、药剂耐受性相关基因群、Hedgehog信号相关基因群、PI3K-AKT信号相关基因群、药物代谢基因群、癌症分子机制基因群、SMAD信号网络相关基因群、胰腺癌相关基因群、前列腺癌相关基因群、肝癌相关基因群、肺癌相关基因群所构成。
18.选自筛选癌症创新药物靶的方法、筛选癌症治疗药物的方法和筛选癌症诊断药物的方法中的I种筛选方法，其特征在于使用权利要求I 10的任一项中记载的诱导性癌症干细胞。
19.癌症疫苗的制备方法，其特征在于 使用权利要求I 10的任一项中记载的诱导性癌症干细胞。
20.癌症模型动物的制备方法，其特征在于 向实验动物中移植权利要求I 10的任一项中记载的诱导性癌症干细胞。
全文摘要
本发明提供可用于癌症治疗研究以及癌症相关性创新药物研究中的，在体外可自我复制的诱导性癌症干细胞、这些的制备方法、由这些细胞诱导的癌细胞、以及这些细胞的应用。本发明提供能够在体外自我复制的诱导性癌症干细胞，其特征在于至少具有下述(1)和(2)的要素(1)表达POU5F1基因、NANOG基因、SOX2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因这6种基因；(2)具有(a)内源性抑癌基因突变，或(b)内源性癌症相关基因的表达升高中任一种的异常。
文档编号G01N33/50GK102906249SQ201180025960
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者石川哲也 申请人:独立行政法人国立癌症研究中心