专利名称：呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试 盒及制备及检测方法。
(二)
背景技术：
呕吐毒素(Vomitoxin)，化学上称作脱氧腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol， DON),属于霉菌的单端孢菌素族，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中， 其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，具有很高的细胞毒性及免疫 抑制性质，是由几种粉色镰刀霉真菌属产生的。呕吐毒素在小麦、玉米以及稻 米中的含量通常是mg/kg级。
目前，呕吐毒素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC), 薄层层析法(TLC)等，由于以上诸分析方法的样品前处理比较复杂、操作时需 专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
(三)

发明内容
针对上述问题，本发明提供了呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒， 其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品 纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量 样品的检测，为此本发明还提供了专用测试盒的制备及检测方法。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显 色液B和终止液，其特征在于其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、 呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的 羊抗鼠抗体冻干品。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于其包括以 下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素-牛血清白蛋 白DON-BSA偶联物的制备、呕吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶联物的制备、抗 呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福氏佐剂的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A的 制备；显色液B的制备；终止液的制备。
其进一步特征在于所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48 或24孔微孔板，用10 mmol / L 1 OOmmol / L pH9~l0 Na2C03-NaHC03的缓 冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1|ig/mL ~1.0|iig/m L， 96或48或24孔微孔板各孔加lOOpl， 2t: 8。C放置过夜，弃去包被液，洗 涤2次 5次，按加入含l。/。 5。/。牛血清白蛋白(溶于pH7 8的磷酸盐缓冲液)，2 'C 8"C封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(rC -4(TC冷冻保存。
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释 液为去离子水，DON浓度为0.001ng/mL~ 1000ng/mL。
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁 基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应 瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3 —氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇;将吡啶在室温吹干后，加入少量的水， 然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟~30分钟后， 6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶 解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，室温振荡10min 60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋 白(溶于O.Ol M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2'C 8。C振荡2 hr 3 hr，然后，在 0.01 M -0.2M PBS (pH 7 8)溶液中透析，换透析液3次 8次；冷冻干燥， 偶联物-2(TC 4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀 酸酐=(l(MOOO)mg : (30 4000)mg : (10掘0)mg， 3 一氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: BSA = (10~2000)mg : (3~1000)mg : (5-2000)mg: (10-6000)mg。
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应
瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的 水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟 30分钟后， 6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋 溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，室温振荡10分钟 60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白 (溶于O.Ol M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2"C 8'C振荡2 hr 3 hr，然后，在 0.01 M 0.2M PBS pH 7 8溶液中透析，换透析液3次 8次；冷冻干燥， 偶联物-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: l—丁基硼酸琥珀 酸酑二(10 1000)mg : (30 4000)mg : (10-2000)mg， 3—氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: OVA = (10 2000)mg : (3 1000)mg : (5-2000)mg: (10掘0)mg。
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清 白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1^ig/nl 10^ig/nl抗原溶液，与等 体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完 全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量 为10ng/只 100pg/只小鼠，以后每隔2周 4周加强免疫一次，加强免疫采用尾 静脉注射，免疫剂量10jxg/只 100 pg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后 取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/0以 10:1比例混合，离心，去除上清，在50S 90S内将0.1ml 10ml50X聚乙二 醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1 min 3min后加入10ml 50mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止10 min 30 min后离心，去除上清； 将融合细胞用含5%~30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为 1 X 104~1 X 106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培 养板中，于5%~10%(:02， 35'C 45'C条件下培养，5天 10天后，每培养孔更换 2/3HT培养液，10天 20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上 清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白 (DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细 胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A微-A加)/(A对照-A ^)>2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞 吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ ml，再取lml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔 的培养上清均呈阳性为止；对10周龄 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡 0.3 ml/只 0.5 ml/只，8天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5xl05 细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-2(TC -4(TC保 存；上述反应成分的比例为DON-BSA :生理盐水=(10-1000) pg : (O.卜lO)ml。
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗= (6 24) g: (10~40) ml: (0.05 0.5) g;所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比 而成，液体石蜡:羊毛脂=(6~24) g: (10 40) ml。
所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品； 所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含有过氧化 氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液;所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液； 所述终止液为硫酸溶液。
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方法，其特征在于取包 被有DON -OVA的微孔包被板，加入50pL~100 的DON标准品或处理好的 样品到各自的微孔中，加50pL 100nL抗DON抗体，35T^45'C孵育0.5 h~l h， 洗涤液洗3次~5次，加50pL ~100nL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体， 35。C 45。C孵育0.5h-l h，用洗涤液洗3次 5次，加50nL~100 |iL显色液A和 50piL~100 显色液B，暗处静置10分钟 20分钟后加终止液，在450 nm处测 其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
本发明的呕吐毒素酶联免疫吸附检测方法操作简便，检测快速、灵敏、准 确，专用测试盒使用方便、价格低，适用于大批量样品的检测。 C四)


图1为呕吐毒素DON标准曲线图，横坐标为DON标准溶液浓度的对数，纵坐标为百分比，即各标准品孔和样品孔光密度值除以0 ng/mL标准品孔光密度 值(A0)再乘以100%所得；光密度值(标准孔或样品孔)/光密度值(A0)xl00。/。二 % (纵坐标)。 具体实施例方式
呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显 色液B和终止液，其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON) 标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
下面结合实施例描述本发明中呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的 制备，
实施例1
包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用lOmmol /L pH9 Na2C03-NaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白 (DON-OVA)稀释至1.0pg/m L， 96或48或24孔微孔板各孔加lOOpl， 8'C放置 过夜，弃去包被液，洗涤4，按加入含5%牛血清白蛋白，pH7.5酸盐缓冲液，2 "C封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(TC冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释 液为去离子水，DON浓度为0.001 ng/mL;
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶 中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7, 15 — 氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密 封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌120min，产生3—氧一半琥珀酰一7， 15 — 氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然 后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理20钟后，10500rpm下离心5 分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将 上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 、 二环己基碳化 二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡35min，离心； 将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.2MNaHCO3溶液中)，在5。C振荡3 hr，然后，在0.01M PBS (pH 7.5)溶液中透析，换透析液3次；冷冻干燥， 偶联物-3(TC保存。上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀酸酐=lOOOmg : 2015mg : 10mg， 3—氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一 (丁基硼) 一脱氧 雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: BSA = 2000mg : 495mg : lOOOmg: 3000mg ;
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁 基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应 瓶，混合物在沸水浴中搅拌105min，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一(丁 基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残 余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理30分钟后，15000rpm下离心5分钟，取 上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减 压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺 (DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡35min，离心，将上清 液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.2MNaHCO3溶液中)，在8'C振荡2hr，然后， 在0.2M PBS (pH 7.5)溶液中透析，换透析液6次；冷冻干燥，偶联物-2(TC保
存；上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀酸酐二 495mg : 4000mg : 995mg， 3—氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一 (丁基硼) 一脱氧雪腐镰刀 菌烯醇浓縮物NHS: DCC: OVA=2000mg : 3mg : 995mg: 3995mg;
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清 白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成IO Hg/W抗原溶液，与等体积完全 福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐 剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10Mg/只 小鼠，以后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量55Mg/ 只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与 处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:l比例混合，离心，去除上清，在50 S内将0.1ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合， 3 min后加入50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止20 min后离心，去除 上清；将融合细胞用含30X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度 为1Xl(f饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板 中，于7.5%002， 4(TC条件下培养，10天后，每培养孔更换2/3HT培养液，20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结 果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非
竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A微-Aa自)/(A对照-A空自)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进 行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置 显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ ml ，再取1 ml稀释20倍，接种入 96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周 龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5 ml/只，8天后，腹腔注射培养至对数期的 杂交瘤细胞，5X10S细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加
甘油于-40'C保存；上述反应成分的比例为DON-BSA :生理盐水=10|llg :
4.95ml;
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗= 6g:25mL0.5g;所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂= 24g:衡l。
实施例2
所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用 100mmol/L pHIO Na2C03-NaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋 白(DON-OVA)稀释至O.lPg/m L, 96或48或24孔微孔板各孔加lOOpl, 5°(3放 置过夜，弃去包被液，洗涤2次，按加入含1%牛血清白蛋白，pH7的磷酸盐缓 冲液，8'C封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-4(TC冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释 液为去离子水，DON浓度为1000ng/mL;
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶 中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 — 氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密 封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90 min，产生3 —氧一半琥珀酰一 7， 15 — 氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水， 然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟后，6000rpm下离心30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液， 将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳 化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min，离心； 将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01MNaHC03溶液中)，在2'C振荡2 hr，然后，在0,2M PBS (pH7)溶液中透析，换透析液8次；冷冻干燥，偶
联物-2(TC保存。上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀酸酐= 10mg:30mg:2000mg， 3—氧一半琥泊酰一 7， 15—氧一 (丁基硼) 一脱氧雪腐镰 刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: BSA =10mg:1000mg:2000mg:6000mg ;
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁 基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应 瓶，混合物在沸水浴中搅拌120min，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一(丁 基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残 余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理20分钟后，6000rpm下离心30分钟，取上 清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压 浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 、二环己基碳化二亚胺(DCC) 溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡60min,离心，将上清液缓慢滴 加到卵清蛋白(溶于0.01MNaHCO3溶液中)，在2"C振荡2hr，然后，在0.01M PBS (pH7)溶液中透析，换透析液3次；冷冻干燥，偶联物-4(TC保存；上述反 应成分的比例为DON: l—丁基硼酸琥珀酸酐=1000mg :30mg :2000mg， 3 一氧一半琥珀酰一7， 15—氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS-DCC: OVA =995mg:1000mg:2000mg:8000mg;
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清 白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成O. lpg^l抗原溶液，与等体积完全 福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐 剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为100pg/ 只小鼠，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10pg/ 只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与 处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在90S内将4.95ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合， 1 min后加入10 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10 min后离心，去除 上清；将融合细胞用含17.5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓 度为1乂104饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板 中，于5%C02， 45。C条件下培养，5天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，10 天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结 果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非 竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A微-A舶)/(A对照-A空白)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进 行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置 显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取lml稀释20倍，接种入 96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对13周 龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3ml/只，10天后，腹腔注射培养至对数期的 杂交瘤细胞，5Xl()S细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加 甘油于-20。C保存；上述反应成分的比例为DON-BSA :生理盐水=1000 10ml;
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗二24g: 40ml:0.05g;所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂= 6g:25ml。
实施例3
所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用 55mmol / L pH9.5 Na2C03-NaHC03的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素-卵清蛋白 (DON-OVA)稀释至4.95|ig/m L， 96或48或24孔微孔板各孔加10(^1， 2'C放置 过夜，弃去包被液，洗涤5次，按加入含3%牛血清白蛋白，pH8的磷酸盐缓冲 液，5。C封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-3(TC冷冻保存；
所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得到，稀释 液为去离子水，DON浓度为500ng/mL;
呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 — 氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密 封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌105min，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15 — 氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水， 然后将残余物溶解于5ml乙酸乙酯中，超声波处理30分钟后，15000rpm下离 心17.5分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清 液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己 基碳化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡60min, 离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.095MNaHC03溶液中)，在8°C 振荡2.5hr，然后，在0.095M PBS (pH8)溶液中透析，换透析液6次；冷冻干
燥，偶联物-40。C保存。上述反应成分的比例为DON: 1 —丁基硼酸琥珀酸
酐=495mg : 4000mg : 995mg， 3 —氧一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼) 一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS:DCC:BSA二995mg : 3mg : 5mg: 10mg ;
呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在吡啶中， 在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁 基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应 瓶，混合物在沸水浴中搅拌90min，产生3—氧一半琥珀酰一 7， 15—氧一(丁 基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残 余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟后，10005rpm下离心17.5分钟， 取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液 减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺 (DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温振荡10min，离心，将卵清 蛋白OVA溶于0.095MNaHC03溶液中，然后将上清液缓慢滴加到溶于NaHC03 溶液的卵清蛋白中，反应混合物在5'C振荡3hr，然后，在0.095M PBS (pH 8) 溶液中透析，换透析液8次；冷冻干燥，偶联物-3(TC保存。上述反应成分的比 例为DON: l—丁基硼酸琥珀酸酐=10mg : 1985mg : 10mg， 3—氧一半 琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物NHS: DCC: OVA = 10mg : 498.5mg : 5mg: 10mg ;
所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成4.95pg/nl抗原溶液，与等体积完全 福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐 剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55pg/ 只小鼠，以后每隔3周加强免疫一次，加强免疫釆用尾静脉注射，免疫剂量100 pg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细 胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:l比例混合，离心，去除上清， 在70S内将10ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其 融合，2 min后加入30 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止30 min后离心， 去除上清；将融合细胞用含5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后 浓度为1乂105饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养 板中，于10%(302， 35'C条件下培养，8天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，15 天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结 果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非 竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A微-A舶)/(A对照-A加)〉2.1;对分泌阳性抗体的细胞进 行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置 显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取lml稀释20倍，接种入 96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对11.5 周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.4 ml/只，9天后，腹腔注射培养至对数期 的杂交瘤细胞，5"05细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加 甘油于-30。C保存；上述反应成分的比例为DON-BSA :生理盐水=495吗 O.lml ;
所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介苗= 15g:10ml:0.25g;所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂 =15g:10ml;
酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体冻干品；所述洗 涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液;所述显色液A为含有过氧化氢的柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液；
上述实施例中，所述PBS溶液为磷酸盐缓冲液。
下面结合实施例描述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方
法
实施例l，取包被有DON -OVA的微孔包被板，加入50 ^L的DON标准 品或处理好的样品到各自的微孔中，力n 10(HiL抗DON抗体，35。C孵育0.5 h， 洗涤液洗3次，加lOO)iL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，45'C孵育0.75 h，用洗涤液洗3次，加100nL显色液A和100pL显色液B，暗处静置20min 后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
实施例2，取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入100pL的DON标准 品或处理好的样品到各自的微孔中，加50pL抗DON抗体，45-C孵育lh，洗涤 液洗5次，加50juL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35。C孵育0.5h，用 洗涤液洗5次，加50 显色液A和75 pL显色液B,暗处静置10min后加终 止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
实施例3，取包被有DON-OVA的微孔包被板，加入75pL的DON标准品 或处理好的样品到各自的微孔中，加75pL抗DON抗体，4(TC孵育0.75h，洗涤 液洗4次，加75pL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，40'C孵育lh,用洗 涤液洗4次，加75 显色液A和50 nL显色液B，暗处静置15 min后加终止 液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
权利要求
1、呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
2、 呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于其包括 以下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素-牛血清白 蛋白DON-BSA偶联物的制备、呕吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶联物的制备、 抗呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福 氏佐剂的制备、的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A 的制备；显色液B的制备；终止液的制备。
3、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔 板，用10mmol/L~100mmol/L pH9~10 Na2C03-NaHC03的缓冲液作为包 被液，将呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀释至0.1pg/mL l.(^g/mL, 96或48 或24孔微孔板各孔加10(^1， 2"C 8匸放置过夜，弃去包被液，洗涤2次 5次， 按加入含1%~5%牛血清白蛋白(溶于pH 7~8的磷酸盐缓冲液)，2'C 8'C封闭 过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-2(TC—4(TC冷冻保存。
4、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于所述呕吐毒素(DON)标准品从呕吐毒素(DON)纯品中稀释得 妾IJ，稀释液为去离子水，DON浓度为0.001ng/mL 1000ng/mL。
5、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物的制备将DON溶 解在吡啶中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 —氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气； 密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3—氧一半琥珀 酰一7， 15—氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟~30分钟 后，6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙 酯溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰 胺(DMF)中，室温振荡10min 60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白 蛋白(溶于0.01M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2。C 8。C振荡2 hr 3 hr，然后， 在0.01 M -0.2M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(pH 7 8)中透析，换透析液3次 8 次；冷冻干燥，偶联物-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: 1 — 丁基硼酸琥珀酸酐=(10~1000)mg : (30~4000)mg : (10-2000)mg， 3 —氧一 半琥珀酰一7， 15—氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: BSA=(10~2000)mg : (3~1000)mg : (5画2000)mg: (10画6000)mg。
6、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于，呕吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)偶联物的制备将DON溶解在 吡啶中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7， 15 一氧一(丁基硼)-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气， 密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟 120分钟，产生3—氧一半琥珀 酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加 入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟 30分钟后， 6000rpm 15000rpm下离心5分钟 30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋 溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓縮后备用；取浓縮物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N,N-二甲基甲酰 胺(DMF)中，室温振荡10分钟 60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋 白(溶于0.01 M 0.2MNaHCO3溶液中)，在2。C 8。C振荡2 hr 3 hr，然后，在 0.01 M (X2M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(pH 7 8)中透析，换透析液3次 8 次；冷冻干燥，偶联物-20"C -4(TC保存；上述反应成分的比例为DON: l — 丁基硼酸琥珀酸酐=(10 1000)mg : (30 4000)mg : (10-2000)mg， 3 一氧 一半琥珀酰一 7， 15 —氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓縮物NHS: DCC: OVA = (10 2000)mg : (3 1000)mg : (5-2000)mg: (10-8000)mg 。
7、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于所述抗呕吐毒素(DON)单克隆抗体及其溶液的制备取呕吐毒素-牛血清白蛋白(DON-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1iig4il 10pig4il抗原溶 液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同 量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射， 免疫剂量为1(Hig/只 100^ig/只小鼠，以后每隔2周 4周加强免疫一次，加强免 疫采用尾静脉注射，免疫剂量10pg/只 100pg/只，最后一次免疫采用脾内注射， 4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞 SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50 S 90 S内将0.1 ml 10 ml 50 %聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，lmin 3min后 加入10 ml 50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10 min ~30 min后离心， 去除上清；将融合细胞用含5X 30X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以 最后浓度为1 X 104 1 X 106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层 的96孔培养板中，f5%~10%CO2， 35'C 45'C条件下培养，5天 10天后，每 培养孔更换2/3HT培养液，10天 20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培 养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克 隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素-卵清蛋白 (DON-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细 胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A加)/(A对照-A 空白)>2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞 吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ ml，再取lml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔 的培养上清均呈阳性为止；对10周龄 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡 0.3 ml/只 0.5 ml/只，8天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5xl05 细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于-2(TC—4(TC保 存；上述反应成分的比例为DON-BSA :生理盐水=(10~1000) |Ug : (0.1~10)ml 。
8、根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于所述完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂:卡介 苗=(6~24) g: (10-40) ml: (0.05~0.5) g;所述不完全福氏佐剂是由下列材料配比而成，液体石蜡:羊毛脂=(6 24) g: (10 40) ml。
9、 根据权利要求2所述呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备， 其特征在于所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体 冻干品；所述洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液；所述显色液A为含 有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述显色液B为四甲基联苯二胺的 乙醇溶液；所述终止液为硫酸溶液。
10、 呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的检测方法，其特征在于 取包被有DON -OVA的微孔包被板，加入50[iL~100 juL的DON标准品或处理 好的样品到各自的微孔中，加50iliL 100juL抗DON抗体，35'C 45。C孵育0.5 h lh，洗漆液洗3次 5次，加50pL 100iiL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗 体，35。C 45t:孵育0.5h 1 h，用洗涤液洗3次 5次，力口 50|iiL~100 显色液 A和50pL 100 pL显色液B，暗处静置10分钟 20分钟后加终止液，在450 nm 处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
全文摘要
本发明为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了专用测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。检测时，取包被板，加入50μl～100μl的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl～100μl抗DON抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，用洗涤液洗3次～5次，加50μl～100μl显色液A和50μl～100μl显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。
文档编号G01N33/543GK101413954SQ20081023633
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者张建中, 徐祖奇, 毛丽华 申请人:无锡益达生物技术有限公司