专利名称：甘蔗花叶病毒云南分离物tas－elisa检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术产品，具体涉及一种甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
植物病毒是农作物病毒病害的重要病原，随着植物脱病毒种苗产业化的发展和现代设施农业的兴起，植物病毒的检测与防控技术日益受到重视。目前植物病毒的检测技术有血清学技术、指示植物测定、电子显微镜检测、分子检测(包括对病毒核酸及蛋白的检测)4个方面的方法。各种方法相互印证，同时又存在检测的灵敏度、专化性、设备设施条件及成本等因素的局限。各国都在探索简便、快速、准确而又经济的检测办法，其中以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked immunosorbent assay，ELISA)是被广泛改进和应用的方法。
1969年，Avrameas将酶联抗体应用于血清学技术中，1971年Engvall和Perlmann将该方法进一步完善发明了ELISA方法。1974年Voller等将ELISA技术应用于人和动物的抗体检测，Voller等和Clark、Adams分别于1976年和1977年将ELISA方法应用于植物病毒的检测。之后，ELISA方法得到进一步发展，并广泛应用人和动植物病毒的检测中。与其它检测方法相比，ELISA方法具有成本显著降低，检测的设备设施简单，快速高效的特点，并始终在不断被改进中，有直接ELISA、间接ELISA(I-ELISA)、单抗体ELISA(SPA-ELISA)。微波ELISA、双抗体夹心ELISA(Double-antibody sandwich-ELISA，DAS-ELISA)等。目前市售的ELISA检测试剂盒主要有I-ELISA和DAS-ELISA。如美国的Agdia公司，英国的PD公司、意大利的Agritest公司、德国的Loewe生物技术公司、瑞士的BIOREBA公司是植物病毒检测试剂盒的主要营销公司。我国的植物病毒检测试剂盒销售公司大多为这些公司的代理或进口试剂盒分装销售，也有自行研制的报道，但涉及植物病毒种类较少。
目前市售的ELISA检测试剂盒可用于脱毒种苗和植物病毒样品的批量化检测，但同时也存在非特异性反应(即假阳性或假阴性反应)、检测灵敏度不够高(一般为1ng/ml-10ng/ml病毒浓度)。尤其在我国，许多种类的植物病毒抗体依赖于进口，一方面受到进口血液制品的限制，难以稳定供应，另一方面国外的抗体生产成本高而导致价格昂贵，未能满足生产的需求。近年来国外的相关公司对植物病毒检测试剂盒进行了改进，进一步简化了操作程序，如英国PD公司的试纸条检测方法已实现商品化生产，但价格高昂，每样次的检测需100多元人民币。国内外生产中规模化应用的仍然是I-ELISA和DAS-ELISA检测试剂盒，根据病毒种类的不同，每样次的试剂成本约10-30元人民币不等。
Roggero和Ogliara等1996年在DAS-ELISA基础上，加入单克隆抗体，开展了番茄班萎病毒(TSWV)的三抗体夹心ELISA(Triple-antibody sandwich ELISA，TAS-ELISA)检测，继承了DAS-ELISA简便快速的优势，同时结合了单克隆抗体专化性强、灵敏度高的特点，可高效、快速和灵敏地检测待测样中的病毒抗原。本发明的技术人员近年来用TAS-ELISA检测了双生病毒云南分离物(已发表多篇相关论文)，郭兴启等(2003)应用TAS-ELISA检测了马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)、美国和我国台湾分别报道了TAS-ELISA检测康乃馨蚀环病毒(CarERV)和坏死病毒(LNV)，Franconi(2002)报道了TAS-ELISA检测PVX，Bowman等(2002)应用该办法检测黄瓜花叶病毒(CMV)，Tavert等(2002)应用TAS-ELISA检测烟草花叶病毒(TMV)运动蛋白。目前从现有的文献报道来看，有关TAS-ELISA方法研究植物病毒的报道近年虽然有所增加，但专门研制TAS-ELISA检测试剂盒应用于植物病毒的规模化检测尚未发现，同时市场中尚无TAS-ELISA检测试剂盒的出现。

发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、准确性强、高效的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法简便易行、易于规模化生产。
为了实现本发明目的，本发明的甘蔗花叶病毒云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，其特征在于，盒体内的用液还包括烟草花叶病毒多克隆抗体、甘蔗花叶病毒单克隆抗体，所述的甘蔗花叶病毒多克隆抗体和所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由35-45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成。
所述的甘蔗花叶病毒提取液的制备方法为先将含有甘蔗花叶病毒(SCMV)的病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1～3(克/毫升)，匀浆，过滤，滤液中加入滤液体积的20～30％氯仿，搅拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至浓度为4～10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后静置取沉淀，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮离心处理，沉淀用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，离心，重复三次，合并上清，取上清液加入离心管离心，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，离心，上清液即为病毒提纯液。
具体地说，所述的甘蔗花叶病毒提取液的制备方法为1)病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1(克/毫升)，搅拌充分匀浆，纱布过滤；2)滤液中加入滤液体积20～30％氯仿，搅拌20～40min，4℃下离心力为3000g下离心10～30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇(PEG)至浓度为4～10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；4)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.4～7.5下悬浮；4℃下离心力为10000g下离心10～20min；5)沉淀用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)在pH7.4～7.5下悬浮，4℃下离心力为10000g下离心10～20min。重复三次，合并上清，取上清液；6)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下10000g，离心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，，取上清液即为病毒提纯液。
经检测，本发明所述的病毒提纯液为乳白色液体，病毒浓度为35～45mg/ml。本发明所述的病毒提纯液纯度及含量采用电镜负染法及紫外分光光度仪进行检测，具体方法为1.电镜负染法检测病毒的纯度病毒提纯液上置电镜铜网吸附3min，2％钼酸铵染色3min，放置5min，置于JEM100CX-II型透射电子显微镜下观察。在电镜下观察，可见其含大量的SCMV病毒粒子，未见杂质。
2.检测病毒的纯度及含量病毒提纯液用PBS缓冲液稀释10倍于BECKMAN DU640型紫外分光光度仪上测定190nm-450nm全波长扫描图、260nm和280nm吸收值。
病毒提纯液经紫外分光光度仪检测，190nm～450nm全波长扫描图显示为典型病毒扫描图，所得病毒浓度为35～45mg/ml。其中优选的提纯样品稀释100倍液中A260＝1.140，A280＝1.382，A260/A280＝0.825，病毒浓度＝A260/A0.1％260＝1.140/2.7×10＝42.22mg/ml。每100克病叶得病毒45mg。
所述的抽提缓冲液为0.02M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH为7.4～7.5，含0.1％巯基乙醇，0.01M EDTA。
本发明所述的匀浆、过滤、离心和悬浮，均为本领域技术人员公知技术。
其中，所述的甘蔗花叶病毒(SCMV)云南分离物多克隆抗体由35～45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，采用免疫注射法制备而成。其制备方法为选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分离物多克隆抗体。
对所采集的SCMV云南分离物多克隆抗体进行检测分析，将病毒提纯液稀释至0.01mg/ml，备用。将多克隆抗体倍比稀释为1/10、1/20、1/40......1/20480，以间接ELISA法测定抗体效价。结果，经四次免疫家兔后采血，分离得到40ml抗血清，间接ELISA法测的效价为1∶5000-6000。
将多克隆抗体稀释至1mg/ml，备用。将病毒提纯液稀释为1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以间接ELISA法测定抗体灵敏度。结果，经四次免疫家兔后采血，分离得到40ml抗血清，最低检出浓度(检测灵敏度)达0.01-0.001 ng/ml。
在组装本发明所述的试剂盒时，所述的多克隆抗体可将所得的多克隆抗血清中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封、冷贮(-70℃)、备用。在使用时可保存于4℃中，不宜反复冻融，有效期2年。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由35-45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，采用克隆抗体法制备而成。其制备方法选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
单克隆抗体制备流程为将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体。
对所得单克隆抗体进行分析，筛选出一个SCMV广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效价为1∶5000～10000。
在组装本发明所述的试剂盒时，所述的单克隆抗体可将制备的抗体中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封，4℃保存，备用。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
本发明所述的甘蔗花叶病毒云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒中，所述的阳性对照采用含甘蔗花叶病毒的病叶，加入病毒抽提缓冲液研磨，离心力2000g下离心10min，取上清在冷冻干燥机制成粉末状而成，可分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
所述的阴性对照采用无病毒烟叶，同制备阳性对照方法制备而成；分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
本发明所述的试剂盒中所述的酶标抗体为羊抗鼠AP-IgG，分装，4℃保存，备用。每个试剂盒中5ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释，可由Sigma公司购买。
其他主要材料及药品可按溶液体积称量分装，常温下保存。
所述的缓冲液包括包被缓冲液、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液，具体用量如下①包被缓冲液每个试剂盒中4.52g，加1000ml双蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml双蒸水中，调pH值为9.6；
②PBST每个试剂盒中90.4g或124.8g，加8000ml双蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g溶解于1000ml双蒸水中，加入0.5％tween20(吐温-20)充分混合；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，调pH值为7.4；④封闭缓冲液PBST中加入5％的脱脂奶粉，溶解；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸盐(p-NPP)。
本发明所述的试剂盒可根据应用单位的实际需求，可组装成每个试剂盒检测500个样次的抗体及药品试剂量，可备用适量的滴管，比如20个一次性滴管。
本发明所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤先将甘蔗花叶病毒进行分离提纯得病毒提取液，然后采用病毒提取液进行甘蔗花叶病毒多克隆抗体及单克隆抗体的制备，再对阳性对照、阴性对照、多克隆抗体、单克隆抗体、酶标抗体、缓冲液和底物进行制备组装而成。
具体地说，所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤1.所述的甘蔗花叶病毒的分离提纯先将含有甘蔗花叶病毒(SCMV)的病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1-3(克/毫升)，匀浆，过滤，滤液中加入滤液体积的20-30％氯仿，搅拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇(PEG)至浓度为4-10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后静置取沉淀，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮离心处理，沉淀用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，离心，重复三次，合并上清，取上清液加入离心管离心，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，离心，上清液即为病毒提纯液，所得病毒浓度为35～45mg/ml；2.SCMV多克隆抗体的制备选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；
7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分离物多克隆抗体。
3.SCMV单克隆抗体的制备选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
单克隆抗体制备流程为将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体。
4.试剂盒的组装(1)阳性对照采用含甘蔗花叶病毒的病叶，加入病毒抽提缓冲液研磨，2000g离心10min，取上清在冷冻干燥机制成粉末状而成，可分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
(2)阴性对照采用无病毒甘蔗叶，同制备阳性对照方法制备而成；分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
(3)多克隆抗体将所得的多克隆抗血清中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封、冷贮(-70℃)、备用。在使用时可保存于4℃中，不宜反复冻融，有效期2年。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
(4)单克隆抗体将制备的抗体中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封，4℃保存，备用。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
(5)酶标抗体酶标抗体为羊抗鼠AP-IgG，分装，4℃保存，备用。每个试剂盒中5ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶1000稀释。
(6)其他主要材料及药品①包被缓冲液每个试剂盒中4.52g，加1000ml双蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml双蒸水中，调pH值为9.6；②PBST每个试剂盒中90.4g或124.8g，加8000ml双蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g溶解于1000ml双蒸水中，加入0.5％tween20(吐温-20)充分混合；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3g
NaN30.2g溶解于1000ml PBST中，调pH值为7.4；④封闭缓冲液PBST中加入5％的脱脂奶粉，溶解；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸盐(p-NPP)。
其中，所述的甘蔗花叶病毒分离提纯的方法为1)病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1(克/毫升)，搅拌充分匀浆，纱布过滤；2)滤液中加入20-30％氯仿，搅拌20-40min，4℃下离心力为3000g下离心10-30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇(PEG)至浓度为4-10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后4℃下放置4h-24h；4℃下离心力为10000g下离心10-30min；4)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.4-7.5下悬浮；4℃下离心力为10000g下离心10-20min；5)沉淀用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)在pH7.4-7.5下悬浮，4℃下离心力为10000g下离心10-20min。重复三次，合并上清，取上清液；6)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下10000g，离心2-3h，沉淀用pH7.4-7.5，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，取上清液即为病毒提纯液。
本发明的研究人员在已有ELISA检测试剂盒的基础上，经过多年的研究，研制出TAS-ELISA检测试剂盒，采用本发明所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，检测灵敏度高，检测灵敏度可达到0.005～0.01ng/ml，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高100～1000倍。而且采用本发明所述的方法制备的TAS-ELISA检测试剂盒，试剂成本便宜，易于实现批量化生产，仅2元人民币/样次，在性价比上具有明显的市场竞争力，对于研究、免疫和防治甘蔗病毒有很大帮助，可应用于脱病毒种苗(薯)、种球、工厂化育苗检测及种质材料进出口检疫。


图1多克隆抗体免疫注射程序图2单抗体克隆制备流程具体实施方式
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实验例1本实验例的目的在于研究SCMV云南分离物的TAS-ELISA检测试剂盒的检测方法。
本发明的研究人员对试剂盒的检测方法进行研究，总结出本发明所述的TAS-ELISA检测试剂盒进行甘蔗病毒检测时的检测方法，具体如下1.SCMV多克隆抗体以1∶500倍用包被缓冲液稀释，加入酶标板，每孔100ul，37℃下放置3h。
2.PBST洗板6次，快速3次，慢速3次，3min/次，拍干。
3.样品加入5-10倍病毒抽提缓冲液研磨样品，加入酶标板，每孔100ul，每个样品加两个孔，4℃下放置过夜。同时如法设置阳性、阴性、空白对照。
4.同上洗板。
5.每孔加入150ul封闭缓冲液，37℃下放置30min。
6.抛弃孔中液体，拍干。
7.SCMV单抗以1∶500倍用PBST稀释，加入酶标板，每孔100ul，37℃下放置3h。
8.同上洗板。
9.酶标抗体羊抗鼠AP-IgG以1∶10000倍用PBST稀释，加入酶标板，每孔100ul，37℃下放置3h。
10.同上洗板。
11.用底物缓冲液溶解底物至1mg/ml，加入酶标板，每孔100ul，室温25℃下至充分显色，每孔加入50ul 1N NaOH终止显色。肉眼或酶标仪405nm读数判别检测结果。
实验例2本实验例验证阴阳性判别、检测灵敏度与准确率比较。
应用酶标仪进行检测结果判别时，记录酶标仪在405nm波长下酶标板每孔的OD数值，首先进行空白孔系统调零，若空白孔出现明显的颜色反应，或经空白孔调零后，系统检测出现大量的负值时，整个系统测定无效；每一样品测定双孔的OD值应基本一致，若两孔测定值差别较大(一般指同一样品相同稀释度两孔的OD值超过其均值的0.5-1.5倍范围)，该酶标板测定无效。若阳性对照OD值低于或接近阴性对照OD值时，测定也无效。待测样品OD值与阴性对照OD值检测之比大于等于2.1时，待测样品为阳性，否则为阴性。
肉眼判别检测结果时，首先也是观察空白孔、阴性孔、阳性孔的颜色，若空白孔、阴性孔颜色较深或阳性孔无颜色或颜色较浅时，则本块酶标板测定无效。目测待测样品颜色反应与阴性对照颜色反应深浅对比，较深则为阳性，较浅则为阴性。
本发明所述的TAS-ELISA检测试剂盒检测灵敏度达到0.005-0.01ng/ml，与电镜检测结果比较准确率相符，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高100-100倍。
实施例1本实施例所述的甘蔗花叶病毒云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，及甘蔗花叶病毒多克隆抗体和甘蔗花叶病毒单克隆抗体，所述的甘蔗花叶病毒多克隆抗体和所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由42.2mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成。
本实施例所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤1.甘蔗花叶病毒的分离提纯在田间采集病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量SCMV，样品采集后放入-70℃冰箱中保存备用。抽提缓冲液为0.2M的磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4，含0.5％巯基乙醇，0.01M EDTA)提纯方法1)病叶剪碎。
2)加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1(克/毫升)，电动搅拌机充分匀浆，双层纱布过滤。
3)滤液中加入30％氯仿，4℃下，离心力为3000g离心30min，收集上清。
4)上清中加入PEG至浓度为8％(克/毫升)，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃放置4h。
5)4℃下，离心力为10000g离心20min。
6)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.4下悬浮。
7)4℃下，离心力为10000g离心10min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下悬浮，4℃下，离心力为10000g离心10min。重复三次，合并上清。
9)上清液即为粗提纯液。
10)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下，离心力为10000g离心2h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，上清液即为病毒提纯液。
对所述的病毒提纯液纯度及含量采用电镜负染法及紫外分光光度仪进行检测，在电镜下观察，可见其含大量的SCMV病毒粒子，未见杂质；提纯样品稀释100倍液中A260＝1.140，A280＝1.382，A260/A280＝0.825，病毒浓度＝A260/A0.1％260＝1.140/2.7×10＝42.22mg/ml。每100克病叶得病毒45mg。
2.SCMV多克隆抗体的制备选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；
一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分离物多克隆抗体。
对所采集的SCMV云南分离物多克隆抗体进行检测分析，将病毒提纯液稀释至0.01mg/ml，备用。将多克隆抗体倍比稀释为1/10、1/20、1/40......1/20480，以间接ELISA法测定抗体效价。
结果，经四次免疫家兔后采血，分离得到50ml抗血清，间接ELISA法测的效价为1∶5120。
将多克隆抗体稀释至1mg/ml，备用。将病毒提纯液稀释为1mg/ml、0.1mg/ml0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml，以间接ELISA法测定抗体灵敏度。
结果，经四次免疫家兔后采血，分离得到40ml抗血清，最低检出浓度(检测灵敏度)达0.01ng/ml。
3.SCMV单克隆抗体的制备选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。
单克隆抗体制备流程为将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体。
对所得单克隆抗体进行分析，筛选出一个SCMV广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效价为1∶5000。
4.试剂盒的组装(1)阳性对照采用含甘蔗花叶病毒的病叶，加入病毒抽提缓冲液研磨，2000g离心10min，取上清在冷冻干燥机制成粉末状而成，可分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
(2)阴性对照采用无病毒甘蔗叶，同制备阳性对照方法制备而成；分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
(3)多克隆抗体将所得的多克隆抗血清中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封、冷贮(-70℃)、备用。在使用时可保存于4℃中，不宜反复冻融，有效期2年。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
(4)单克隆抗体将制备的抗体中加防腐剂0.1％叠氮化钠(NaN3)，无菌分装后，密封，4℃保存，备用。每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释。
(5)酶标抗体酶标抗体为羊抗鼠AP-IgG，分装，4℃保存，备用。每个试剂盒中5ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶1000稀释。
(6)其他主要材料及药品
①包被缓冲液每个试剂盒中4.52g，加1000ml双蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml双蒸水中，调pH值为9.6。
②洗涤液PBST每个试剂盒中90.4g或124.8g，加8000ml双蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O 7.2gKCl 0.2g加水至1000ml，加入0.5％tween20(吐温-20)充分混合；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，调pH值为7.4；④封闭缓冲液PBST中加入5％的脱脂奶粉，溶解；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸盐(p-NPP)。
本实施例所述的试剂盒可根据应用单位的实际需求，可组装成每个试剂盒检测500个样次的抗体及药品试剂量，可备用适量的滴管，比如20个一次性滴管。
本实施例所述的检测试剂盒可用于常规规程检测，检测灵敏度可达到0.01ng/ml，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高100倍。
实施例2其他同实施例1，不同的是，甘蔗花叶病毒的分离提纯在田间采集病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量SCMV，样品采集后放入-70℃冰箱中保存备用。抽提缓冲液为0.2M的磷酸盐缓冲液PBS(pH7.5含0.5％巯基乙醇，0.01M EDTA)提纯方法1)病叶剪碎。
2)加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶3(克/毫升)，电动搅拌机充分匀浆，双层纱布过滤。
3)滤液中加入25％氯仿，4℃下，离心力为3000g离心20min，收集上清。
4)上清中加入PEG至浓度为9％(克/毫升)，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃放置24h。
5)4℃下，离心力为10000g离心25min。
6)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.5下悬浮。
7)4℃下，离心力为10000g离心20min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下悬浮，4℃下，离心力为10000g离心15min。重复三次，合并上清。
9)上清液即为粗提纯液。
10)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下，离心力为10000g离心2.5h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，上清液即为病毒提纯液。
对所述的病毒提纯液纯度及含量采用电镜负染法及紫外分光光度仪进行检测，病毒浓度为36.8mg/ml。
由此病毒提纯液所得多克隆抗体进行检测分析，间接ELISA法测的效价为1∶5550，最低检出浓度(检测灵敏度)达0.006ng/ml。
所得单克隆抗体进行分析，筛选出一个TMV广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效价为1∶8000。
该试剂盒的检测灵敏度可达到0.006ng/ml，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高500倍。
实施例3其他同实施例1，不同的是，甘蔗花叶病毒的分离提纯在田间采集病株样品，经电子显微镜和标准抗体检测含有大量SCMV，样品采集后放入-70℃冰箱中保存备用。抽提缓冲液为0.2M的磷酸盐缓冲液PBS(pH7.5含0.5％巯基乙醇，0.01M EDTA)提纯方法1)病叶剪碎。
2)加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶2(克/毫升)，电动搅拌机充分匀浆，双层纱布过滤。
3)滤液中加入20％氯仿，4℃下，离心力为3000g离心40min，收集上清。
4)上清中加入PEG至浓度为6％(克/毫升)，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃放置4h。
5)4℃下，离心力为10000g离心30min。
6)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.4下悬浮。
7)4℃下，离心力为10000g离心15min。
8)沉淀用0.01M PBS在pH7.4下悬浮，4℃下，离心力为10000g离心20min。重复三次，合并上清。
9)上清液即为粗提纯液。
10)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下，离心力为10000g离心3h，沉淀用pH7.4，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，上清液即为病毒提纯液。
对所述的病毒提纯液纯度及含量采用电镜负染法及紫外分光光度仪进行检测，病毒浓度为40.2mg/ml。
由此病毒提纯液所得多克隆抗体进行检测分析，间接ELISA法测的效价为1∶6000，最低检出浓度(检测灵敏度)达0.001ng/ml。
所得单克隆抗体进行分析，筛选出一个TMV广谱单克隆抗体细胞株，间接ELISA测定抗体效价为1∶10000。
该试剂盒的检测灵敏度可达到0.008ng/ml，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高1000倍。
权利要求
1.甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，其特征在于，盒体内的用液还包括烟草花叶病毒多克隆抗体、甘蔗花叶病毒单克隆抗体，所述的甘蔗花叶病毒多克隆抗体和所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由35～45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成。
2.根据权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的甘蔗花叶病毒提取液的制备方法为先将含有甘蔗花叶病毒的病叶破碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1～3(克/毫升)，匀浆，过滤，滤液中加入滤液体积的20～30％氯仿，搅拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇至浓度为4～10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后静置取沉淀，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮离心处理，沉淀用0.01M PBS悬浮，离心，重复三次，合并上清，取上清液加入离心管离心，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，离心，上清液即为病毒提纯液。
3.根据权利要求1或2所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的甘蔗花叶病毒提取液的制备方法为1)病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1(克/毫升)，搅拌充分匀浆，纱布过滤；2)滤液中加入滤液体积20～30％氯仿，搅拌20～40min，4℃下离心力为3000g下离心10～30min，收集上清；3)上清液中加入聚乙二醇至浓度为4～10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；4)沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液在pH7.4～7.5下悬浮；4℃下离心力为10000g下离心10～20min；5)沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下悬浮，4℃下离心力为10000g下离心10～20min。重复三次，合并上清，取上清液；6)加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下10000g，离心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01M MgCl2的0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，低速离心，取上清液即为病毒提纯液。
4.根据权利要求3所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的抽提缓冲液为0.02M磷酸盐缓冲液，pH为7.4～7.5，含0.1％巯基乙醇，0.01M EDTA。
5.根据权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的甘蔗花叶病毒云南分离物多克隆抗体由35～45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，采用免疫家兔制备而成，其制备方法为选用健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存；然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分离物多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由35-45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，采用克隆抗体法制备而成，其制备方法选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存；单克隆抗体制备流程为将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照采用含甘蔗花叶病毒的病叶，加入病毒抽提缓冲液研磨，离心力2000g下离心10min，取上清在冷冻干燥机制成粉末状而成，可分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用；所述的阴性对照采用无病毒烟叶，同制备阳性对照方法制备而成；分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2mlPBST或蒸馏水溶解、稀释即可用。
8.根据权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液包括包被缓冲液、病毒抽提缓冲液、PBST、封闭缓冲液、底物缓冲液，具体用量如下①包被缓冲液每个试剂盒中4.52g，加1000ml双蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml双蒸水中，调pH值为9.6；②PBST∶每个试剂盒中90.4g或124.8g，加8000ml双蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O7.2gKCl0.2g溶解于1000ml双蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，调pH值为7.4；④封闭缓冲液PBST中加入5％的脱脂奶粉，溶解；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸盐。
9.制备权利要求1所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤先将甘蔗花叶病毒进行分离提纯得病毒提取液，然后采用病毒提取液进行甘蔗花叶病毒多克隆抗体及单克隆抗体的制备，再对阳性对照、阴性对照、多克隆抗体、单克隆抗体、酶标抗体、缓冲液和底物进行制备组装而成。
10.根据权利要求9所述的甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)所述的甘蔗花叶病毒的分离提纯先将含有甘蔗花叶病毒的病叶破碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1～3(克/毫升)，匀浆，过滤，滤液中加入滤液体积的20～30％氯仿，搅拌，收集上清液，然后在上清液中加入聚乙二醇至浓度为4～10％(克/毫升)，氯化钠终浓度为0.1M，溶解后静置取沉淀，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮离心处理，沉淀用0.01M PBS悬浮，离心，重复三次，合并上清，取上清液加入离心管离心，沉淀用0.05M柠檬酸缓冲液悬浮，离心，上清液即为病毒提纯液，所得病毒浓度为35～45mg/ml；2)SCMV多克隆抗体的制备选用健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存。然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得SCMV云南分离物多克隆抗体；3)SCMV单克隆抗体的制备选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存；单克隆抗体制备流程为将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体；4)试剂盒的组装(1)阳性对照采用含甘蔗花叶病毒的病叶，加入病毒抽提缓冲液研磨，离心力2000g下离心10min，取上清在冷冻干燥机制成粉末状而成，可分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用；(2)阴性对照采用无病毒甘蔗叶，同制备阳性对照方法制备而成；分装成1000mg/每管，-20℃保存，使用时加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释即可用；(3)多克隆抗体将所得的多克隆抗血清中加防腐剂0.1％叠氮化钠，无菌分装后，密封、-70℃冷贮，每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释；(4)单克隆抗体将制备的抗体中加防腐剂0.1％叠氮化钠，无菌分装后，密封，4℃保存，备用；每个试剂盒中100ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释；(5)酶标抗体酶标抗体为羊抗鼠AP-IgG，分装，4℃保存，备用。每个试剂盒中5ul，使用时可用PBST或蒸馏水按1∶500稀释；(6)其他主要材料及药品①包被缓冲液每个试剂盒中4.52g，加1000ml双蒸水使用Na2CO31.59gNaHCO32.93g溶解于1000ml双蒸水中，调pH值为9.6；②PBST每个试剂盒中90.4g或124.8g，加8000ml双蒸水使用每1000ml PBST中含有NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4.2H2O 2.9g或Na2HPO4.12H2O7.2gKCl0.2g溶解于1000ml双蒸水中，加入0.5％ tween20充分混合；③病毒抽提缓冲液每个试剂盒中10ml，1∶100使用Na2SO31.3gNaN30.2g溶解于1000ml PBST中，调pH值为7.4；④封闭缓冲液PBST中加入5％的脱脂奶粉，溶解；⑤底物缓冲液每个试剂盒中10ml，含500mg底物，1∶10使用10％乙二醇胺(pH9.8)⑥底物硝基苯磷酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种甘蔗花叶病毒云南分离物TAS－ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，盒体内的用液还包括甘蔗花叶病毒云南分离物多克隆抗体、甘蔗花叶病毒云南分离物单克隆抗体，所述的甘蔗花叶病毒多克隆抗体和所述的甘蔗花叶病毒单克隆抗体由35～45mg/ml病毒浓度的甘蔗花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫注射法、单克隆抗体法制备而成；本发明所述的检测试剂盒检测灵敏度高，检测灵敏度可达到0.005～0.01ng/ml，比间接ELISA和DAS－ELISA检测灵敏度提高100～1000倍。
文档编号G01N1/28GK1611944SQ200410033668
公开日2005年5月4日 申请日期2004年4月15日 优先权日2004年4月15日
发明者张仲凯, 周雪平, 丁铭, 方琦, 张丽珍, 彭潞波, 李婷婷, 苏晓霞, 李展 申请人:云南省农业科学院生物技术研究所