专利名称：一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的检测方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测领域，具体的，本发明涉及一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的检测技术领域。
背景技术：
链霉素(Sti^ptomycin)和双氢链霉素(Dihydrosti^ptomycin)属于氨基糖苷类抗生素中的常用药物，是从放线菌属的灰链丝菌(Sti^ptomyces griseus)的培养液中提取出来，能够有效地抑制肽链的延长和细菌蛋白质的合成，消灭革兰氏阴性好氧菌及部分革兰氏阳性菌。对多种植物细菌和真菌性病害，特别是对细菌性病害均有良好的防治效果，如可以有效的防治西红柿青枯病、西红柿溃疡病、大白菜软腐病和黄瓜细菌性角斑病等。但是，该抗生素对人有一定的毒副作用，如果食品中残留过量的链霉素，则会对人体造成严重危害，如损伤前庭神经和耳蜗神经导致听力减退，链霉素还具有潜在的致畸、致突变和致癌作用。日本肯定列表对于番茄中链霉素和双氢链霉素总量的限量为0. :3mg/kg，美国对于番茄中链霉素的限量是0.25mg/kg。目前，我国是世界第一大番茄制品出口国，番茄制品是我国重要的农产品出口品种之一。经调查，我国多数地区在农业生产中都使用上述抗生素，这就极大的增加了我国番茄制品的出口风险。如实现对番茄制品中链霉素和双氢链霉素残留量检测方法的建立，对提高我国番茄制品检测技术水平，促进我国农产品对外出口，打破国际贸易壁垒等方面具有重要意义。目前，国内外针对链霉素和双氢链霉素残留的检测技术已有大量的研究，常用的检测方法有酶联免疫法、分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。酶联免疫法易产生假阳性或假阴性结果，常用于筛查分析；液相色谱法不能有效分离链霉素和双氢链霉素，且灵敏度较低，不能实现链霉素和双氢链霉素的同时测定和确证分析，因而难以解决其混合残留的问题；液相色谱-串联质谱法是目前的主流检测方法，但文献报道的相关方法前处理比较复杂，常需要经过两次固相萃取小柱的净化，试剂消耗量大，并且需要采用离子对试剂，易污染质谱检测器，使质谱的重现性和灵敏度变差。目前，用液相色谱-质谱联用法同时检测番茄酱中链霉素与双氢链霉素残留量的方法还未见报道。番茄酱中番茄红色素的较高，且还含有矿物质、碳水化合物、氨基酸、核黄素和烟酸等物质。上述物质对于链霉素和双氢链霉素的液相色谱质谱法的测定影响很大，净化条件不佳时，待测物的峰型很差和灵敏度很低。净化处理是链霉素和双氢链霉素测定的难点。

发明内容
针对现有技术中未见报道专门对番茄酱中链霉素和双亲链霉素测定的技术现状。 本发明的目的在于提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的快速，经济、灵敏、准确、耐用的确证和定量方法。本发明具体提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量检测的确证和定量方法。
本发明的技术方案通过建立了 LC-MS/MS测定番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的方法，通过提取液提取番茄酱样品中的链霉素和双氢链霉素，离心，上清液用分散固相萃取初净化和串联双柱固相萃取净化相结合的方法来净化待测物，氮气吹干后，溶解残渣，供LC-MS/MS测定。本发明具体提供了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，番茄酱经前处理净化后，用高效液相色谱-串联质谱测定，其前处理步骤如下称取番茄酱样品于离心管中，加入提取液于样品中，涡旋，震荡，超声，离心后，取 7. Oml上述离心后的上清液于15ml的离心管中，同时往离心管中加入0. Sg的硅藻土，充分涡旋，震荡，离心后，取4. Oml上述离心后上清液用串联亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱来同时净化；串联亲水亲脂平衡固相萃取柱为柱1 ；弱阳离子交换固相萃取柱为柱2 ；依次用5. Oml甲醇，5. Oml水分别活化亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱，用6. Oml的磷酸盐缓冲溶液淋洗柱1和柱2，依次加入6. Oml的水和1. Oml 的甲醇淋洗柱2，用含3%甲酸的甲醇溶液6. Oml洗脱柱2中的待测物，氮气吹干，用0. 5ml 含0. 2%甲酸的乙腈和水的溶液溶解残渣，其中，乙腈水=70 30，供LC-MS/MS测定。本领域所熟知，链霉素和双氢链霉素的常用提取试剂有磷酸溶液和磷酸盐的缓冲溶液。本发明研究表明，用磷酸溶液提取后，净化后，测定待测物的峰型和灵敏度都不好； 而用磷酸盐的缓冲溶液提取和净化后效果较好。磷酸盐的缓冲溶液对于少量酸碱有一定的缓冲作用，能保持一个相对稳定的PH值，同时保持待测物以一种稳定状态存在。缓冲液中加入少量的乙二胺四乙酸钠能维持溶液的稳定性，同时能与一些阳离子形成稳定的水溶性络合物，这或许能减少对弱阳离子交换柱净化的干扰。因此，本发明选择含有少量乙二胺四乙酸钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 4)为提取液(称取1. 36g的KH2PO4溶解到950ml水中，用 lmol/L的HCL调节pH为4，然后加入0. 15g的Na2EDTA · 2H20,充分溶解，最后用水定容到 1000ml。)。同时，本发明技术方案确定，净化方案中，采用分散固相萃取初净化和串联双柱固相萃取净化相结合的前处理方法，前处理中试剂用量少，无需使用离子对试剂，建立了番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的液相色谱-串联质谱检测技术。众所周知，因番茄酱中成分复杂，单一固相萃取柱已不能满足番茄酱中链霉素和双氢链霉素净化的需要，这就要求使用多重净化的方法来去除番茄酱中影响测定的因素。 本发明使用分散固相萃取初步净化和利用串联两个固相萃取柱再净化的方法来去除番茄酱中影响链霉素和双氢链霉素测定的干扰物质。分散固相萃取初净化主要利用一些吸附剂，如采用聚酰胺、氧化铝、佛罗里硅土、 硅藻土和活性炭等去除样品中的极性或非极性的干扰物。本发明实验了聚酰胺、氧化铝、佛罗里硅土、硅藻土和活性炭等吸附剂。本发明研究结果表明，硅藻土能比较好的吸附番茄酱中一些色素和酸类等物质而又不会吸附待测物。再净化的目的是去除一些极性物质、非极性物质和初净化未除去的色素和酸类物质。本发明利用串联的固相萃取柱(SPE)来再净化。通常SPE柱有两种使用方式，一种是利用SPE柱保留住待测物；另一种是利用SPE柱保留住一些干扰物质。现有技术中有利用反相柱和离子交换柱分两次净化，此操作需要离子对试剂，且洗脱试剂的用量大，操作繁琐费时。本发明利用亲水亲脂平衡柱(上部柱1)和离子交换柱(下部柱幻串接起来同时净化样品。考虑到待测物极性较强，在柱1中几乎无保留，本发明以弱酸性缓冲溶液为提取液，待测物在溶液中以离子化方式存在，提取液通过柱1时，一些非极性杂质主要被保留在柱1中，而待测物无保留的通过柱1进入柱2中。柱2是弱阳离子交换柱，主要保留一些离子化合物，待测物被保留在柱2中，而一些非离子化的物质在柱2中没有保留。为了避免亲水亲脂平衡柱中有残留的待测物，用提取液再淋洗双柱，淋洗不仅洗脱了柱1中残留的待测物于柱2中，同时也洗脱掉了柱2中残留的杂质。用水和甲醇淋洗柱2，除去易溶于水相和有机相的杂质。最后，用酸化的有机相洗脱液洗脱柱2中的待测物供后续处理。双SPE柱串联起来同时净化比用两个SPE柱分别净化节省大量溶剂，且操作简单快速，净化效果好， 回收率高。本发明充分考虑到，固相萃取净化时的上样体积和洗脱条件对于链霉素和双氢链霉素残留量的测定有影响。采用上样体积为細1，用6. Oml的磷酸盐缓冲溶液淋洗柱1和柱 2，依次加入6. Oml的水和1. Oml的甲醇淋洗柱2，用含3%的甲酸6. Oml的甲醇溶液洗脱柱 2中的待测物，获得回收率高，净化效果好，方法灵敏度高。本领域熟知，最终定容溶液对于LC-MS/MS的测定有影响，用0. 5ml的70 30的乙腈水-含0.2%甲酸的溶液溶解残渣，供LC-MS/MS测定，灵敏度高，干扰小。本发明确定样品残留物用磷酸盐缓冲液(pH4)提取，经分散固相萃取净化和串联双柱固相萃取净化后，去除了众多干扰杂质。试剂用量少，无需使用离子对试剂。从而建立了一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量检测的快速，灵敏、准确、经济、耐用的确证和定量方法。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。1.回收率好用pH4磷酸盐缓冲溶液提取，经分散固相萃取净化和串联双柱固相萃取净化后，去除绝大多数的色素、极性和非极性的干扰物质。通过对选择离子监测模式选择离子的优化和基质标准曲线定量，消除基质影响，增强抗干扰能力，降低检测限和提高定量定性的准确性。链霉素和双氢链霉素的回收率介于71-101%。2.精确度高相对标准偏差小于15%。3.样品前处理简单经济本发明采用串联双柱同时净化，避免了国标中的过两次固相萃取柱，前处理中试剂用量少，避免了使用离子对试剂，省时又经济。4.前处理净的化效果好本发明经过创新优选，最终确定采用分散固相萃取净化和串联双柱固相萃取净化相结合，净化效果好，干扰的杂质少。6.操作流程简单操作性强，易于掌握，无需良好训练和较高技能便能很好完成。7.样品制备过程中所使用装置简单只需小型超声波清洗器、小型离心机、12孔固相萃取装置、氮吹仪和涡旋仪等，便于推广应用。8.成本低使用的试剂为实验室常用试剂，价格便宜，易于采购，试剂用量少。


图1所示为链霉素和双氢链霉素的MRM色谱图。图2所示为添加0. 02mg/kg链霉素和双氢链霉素的番茄酱样品的MRM色谱图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中设备和材料有Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)，AB SCIEX 5500质谱仪(美国 ABSCIEX公司)，配有电喷雾离子源(ESI)(美国AB SCIEX公司)；涡旋仪(德国IKA)；超声仪(工作频率59kHz，上海科导)；高纯水发生器(美国密理博Milli-QII)；离心机(瑞士 K0NTR0N)；固相萃取装置(美国Agilent公司)；氮吹仪(N-EVAP，美国Organomation公司)；天平(AB204-S梅特勒)。链霉素(Sti^ptomycin)和双氢链霉素(Dihydrosti^ptomycin)标准品(美国 Dr. EhrenstorferGmbH公司)；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；甲酸铵，乙酸铵，磷酸二氢钾，乙二胺四乙酸钠，甲酸和盐酸等均为优级纯试剂；实验用水为二次净化水；反相固相萃取柱(200mg/6ml，Phenomenex公司)和弱阳离子交换柱 (200mg/6ml, Phenomenex公司)；固相萃取柱转接头(Agilent公司)；硅藻土(分析纯，上海化学试剂厂)；有机系滤膜(Agilent公司)；番茄酱样品来自当地企业生产。实施例一称取番茄酱样品于离心管中，加入提取液于样品中，涡旋，震荡，超声，离心后，取 7. Oml上述离心后的上清液于15ml的离心管中，同时往离心管中加入0. Sg的硅藻土，充分涡旋，震荡，离心后，取4. Oml上述离心后上清液用串联亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱的双柱来同时净化；串联亲水亲脂平衡固相萃取柱为柱1 ；弱阳离子交换固相萃取柱为柱2 ；依次用用5. Oml甲醇，5. Oml水分别活化亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱，用6. Oml的磷酸盐缓冲溶液淋洗柱1和柱2，依次加入6. Oml的水和1. Oml的甲醇淋洗柱2，用含3% (ν/ν)甲酸的甲醇溶液6. Oml洗脱柱2中的待测物， 氮气吹干，用0.5ml含0.2% (ν/ν)甲酸的乙腈水的溶液溶解残渣，其中，按照体积比计， 乙腈水=70 30，供LC-MS/MS测定。链霉素和双氢链霉素常用的提取剂有磷酸溶液和磷酸盐的缓冲溶液。主要是由于链霉素和双氢链霉素比较易溶于硫酸盐、磷酸盐和盐酸的水溶液中，考虑到硫酸的腐蚀性比较强，且易与溶液中离子形成沉淀，盐酸易挥发等的缺点，所以本发明选择了磷酸或磷酸盐溶液。用磷酸盐的缓冲溶液提取和净化后效果较好。磷酸盐的缓冲溶液对于少量酸碱有一定的缓冲作用，对于样品中带来的酸碱有一定的缓冲作用，能保持一个相对稳定的PH 值，本发明采用盐酸调节磷酸盐的缓冲液PH值为4，同时保持链霉素和双氢链霉素以一种稳定阳离子状态存在，便于保留在阳离子交换柱中。缓冲液中加入少量的乙二胺四乙酸钠能维持溶液的稳定性同时能与一些金属阳离子形成稳定的水溶性络合物，本发明净化中采用了阳离子交换柱，乙二胺四乙酸钠络合和一些阳离子，这或许能减少对弱阳离子交换柱净化的干扰。因此，本发明选择含有少量乙二胺四乙酸钠的磷酸盐缓冲溶液(PH 4)作为提取液。实施例二 本发明考虑到番茄酱中番茄红色素的含量较高，且还含有各种矿物质、碳水化合物、胡萝卜素、维生素、蛋白质、脂肪、核黄素、烟酸和叶酸等物质。番茄酱中的成分非常复杂繁多。上述杂质对于链霉素和双氢链霉素的液相色谱串联质谱法的测定影响很大，净化条件不佳时，基质的干扰十分严重，待测物的峰型很差和灵敏度很低。净化处理是链霉素和双氢链霉素测定的难点问题。分散固相萃取初净化主要利用一些吸附剂，比如采用聚酰胺、氧化铝、佛罗里硅土、硅藻土和活性炭等来除去样品中的极性或非极性的干扰物。本发明研究实验了聚酰胺、 氧化铝、佛罗里硅土、硅藻土和活性炭等吸附剂，结果表明硅藻土有比较好的能吸附番茄酱中一些色素等杂质而又不会吸附待测物。硅胶和氧化铝主要吸附极性较大的化合物，链霉素和双氢链霉素的极性比较大，净化时可能吸附了待测物。聚酰胺属于化学吸附，主要通过氢键作用吸附物质，链霉素和双氢链霉素中含有多个羟基，比较易于和聚酰胺形成氢键作用吸附。活性炭的吸附是没有选择性的，对目标物也可能有较强的吸附。佛罗里硅土吸附剂主要有三种成分组成，二氧化硅(84% )，氧化镁(15. 5% )和硫酸钠(0. 5% )，通常吸附极性化合物，与水混合会失活。综合比较后选择硅藻土来初步净化样品。实施例三再净化的目的是去除一些极性物质和初净化未去除的色素和酸类物质。本发明主要利用固相萃取柱(SPE)，通常SPE柱通常有两种使用方式，一种是利用SPE柱保留住待测物；另一种是利用SPE柱保留住一些杂质。现有技术中主要利用反相柱和离子交换柱分别净化两次，此操作需要离子对试剂，洗脱试剂的消耗量大，操作繁琐费时。本发明利用亲水亲脂平衡柱(上部柱1)和离子交换柱(下部柱幻串联起来同时净化样品。首先，本发明考虑到待测物极性较强，不使用离子对试剂时，在亲水亲脂平衡柱中(柱1)中几乎无保留，本发明以PH值为4的弱酸性缓冲溶液为提取试剂，待测物在溶液中主要是以离子化方式存在，当提取溶液通过柱1时，一些非极性杂质主要被保留在柱1中，而待测物几乎无保留的通过柱1而进入柱2中。考虑到可能有极少量的待测物会残留在柱1中，本文使用PH 值为4的弱酸性缓冲提取液再次淋洗固相萃取柱1，尽可能完全的淋洗去除柱1中残留的待测物。由于柱2为弱的离子交换柱，本发明使用pH值为4的弱酸性缓冲溶液提取，待测物主要是以离子化的方式存在。因此，待测物会被保留在柱2中，而一些非离子化的杂质在柱 2中几乎没有保留。为了避免反向柱中有残留的待测物和进一步的洗脱弱离子交换柱中的干扰物质，本发明采用提取液再淋洗双柱，淋洗不仅洗脱了柱1中残留的待测物于柱2中， 同时也洗脱掉了柱2中残留的杂质。本发明试验研究表明，大部分的色素和非极性物质保留在了亲水亲脂平衡柱中，净化后柱1中上部颜色较深，进入柱2中的液体几乎为无色。对于柱2，考虑到可能会残留部分极性化合物，本发明用水再次淋洗柱2，最后再用少量甲醇淋洗柱2，可以去除柱2中残留的易溶于有机相的极性物质，同时去除柱2中残留的水，便于后续的浓缩。弱阳离子固相萃取柱中待测物的洗脱通常用酸性甲醇溶液。酸的含量太少， 不利于待测物从柱2中的洗脱，酸的含量太多，可能会有较多的干扰物质洗脱下来。本文试验了甲酸含量为2^^3^^4%和5%的甲醇溶液，试验表明，甲酸含量为3%的甲醇溶液洗脱，待测物的干扰小，回收率较好。因此，最后只需用3%甲酸的甲醇溶液洗脱柱2中的待测物。双SPE柱串联起来同时净化比用两个SPE柱分别进化节省大量溶剂，且操作简单快速， 净化效果好，回收率高。实施例四采用阴性番茄酱样品作为空白基质，配制不同浓度的基质标准溶液，链霉素和双氢链霉素的浓度分别为0. 01,0. 02,0. 05,0. 1和0. 2mg/L0链霉素的线性回归方程为Y =1.8X106 ·Χ+5. 5X 103，相关系数为0. 9993，线性范围为0. 01 0. 2mg/L ；双氢链霉素的线性回归方程为Y = 8. 1X106 ·Χ+2. 3 X 104，相关系数为0. 9996，线性范围为0. 01 0. 2mg/ L。检出限LOD为0.01mg/kg，是通过信号与噪音的比值大于3(S/N>3)来确定的。定量限 LOQ是0. 02mg/kg，是通过信号与噪音的比值大于10(S/N> 10)来确定的。实施例五在空白番茄酱样品中进行3个添加水平的回收实验，每个水平重复5次。链霉素和双氢链霉素的添加量均是0. 02,0. 05和0. lmg/kg三个水平。空白番茄酱中添加三个水平待测物的回收率和精密度的实验结果见下表1。表1 番茄酱中的回收率及精密度结果(n = 5)
权利要求
1.一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，番茄酱样品经前处理后，用液相色谱-串联质谱测定，其特征在于，其前处理步骤如下称取番茄酱样品于离心管中， 加入提取液于样品中，涡旋，震荡，超声，离心后，取7. Oml上述离心后的上清液于15ml的离心管中，同时往离心管中加入0. Sg的硅藻土，充分涡旋，震荡，离心后，取4. Oml上述离心后上清液用串联亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱的双柱来同时净化； 串联的亲水亲脂平衡固相萃取柱为柱1 ；弱阳离子交换固相萃取柱为柱2 ；依次用5. Oml甲醇，5. Oml水分别活化亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱，用6. Oml的磷酸盐缓冲溶液淋洗柱1和柱2，依次加入6. Oml的水和1. Oml的甲醇淋洗柱2，用含3% (ν/ ν)甲酸的甲醇溶液6. Oml洗脱柱2中的待测物，氮气吹干，用0.5ml含0.2% (ν/ν)甲酸的乙腈和水的溶液溶解残渣，其中，按体积比计，乙腈水=70 30，供LC-MS/MS测定。
2.根据权利要求1所述的番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液采用含有乙二胺四乙酸钠的磷酸盐缓冲溶液PH值为4。
全文摘要
本发明公开一种番茄酱中链霉素和双氢链霉素残留量的测定方法，称取番茄酱样品于离心管中，加入提取液，涡旋，震荡，超声，离心后，取7.0ml上清液于离心管中，同时加入0.8g的硅藻土，涡旋，震荡，离心后，取4.0ml上清液用串联的亲水亲脂平衡固相萃取柱和弱阳离子交换固相萃取柱来同时净化；依次用5.0ml甲醇和5.0ml水分别活化两柱，上样，依次用6.0ml的提取液，6.0ml的水和1.0ml的甲醇淋洗双柱，含3％甲酸的6.0ml的甲醇洗脱，氮气吹干，用0.5ml含0.2％甲酸的乙腈和水溶液溶解残渣，供LC-MS/MS测定。本发明检测快速、灵敏、准确和经济等特点，具有广泛的实用性。
文档编号G01N30/02GK102393425SQ20111031959
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者员丽娟, 季新成, 尚德军, 巩志国, 李世雨, 苏敏 申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心