专利名称：一种茶氨酸定量测定方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，特别涉及对植物样品纸层析后用分光光度计测定茶氨酸含量的方法。
背景技术：
L-茶氨酸又名谷氨酰乙胺，英文名L-Theanine，Cas号3081-61_6，分子式 C7H14N2O3,属酰胺类化合物，为白色或类白色粉状，熔点214-215度，极易溶于水，具有焦糖香和类似味精的鲜爽味。L-茶氨酸在自然界仅存在于山茶属部分植物和一种蕈中，占茶叶干重的之间，约占整个游离氨基酸的50%以上，是构成茶风味的主要物质之一，也被广泛应用于食品行业。现代医学证实茶氨酸对人体具有多方面的保健作用，尤其能够调节神经递质，平和人的情绪，用于治疗焦虑、失眠、儿童多动症等。目前测定茶氨酸的方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、毛细管电泳法、氨基酸自动分析仪法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法。这些方法具有灵敏度高和准确性强的特点，但设备购置和维护成本很高，无法满足普通实验室对茶氨酸测定的需求。分光光度计价格低廉、容易操作，是实验室的常备仪器。茚三酮反应是实验室测定氨基酸最常用的方法，其原理是氨基酸与茚三酮反应生成的产物在570nm处具有最高的吸光度，在一定范围内符合比尔定律。但用这种方法测出来的是茶中各种氨基酸的混合结果。 高小红等人2005年在《光谱实验室》杂志第3期报道“分光光度法测定茶叶中的茶氨酸”， 用浓盐酸将茶氨酸分解成乙胺，利用胺的氯代衍生物能氧化碘化钾而析出碘，加人淀粉后， 溶液的颜色即可达到最深，IOmin内吸光度稳定的性质进行茶氨酸定量测定。然而该方法涉及Na0H、NaHC03、NaC103、NaN02、淀粉、KI等诸多药品，操作步骤繁杂，尤其是中间加入NaClO3 后需要放置lmin，加入NaNO2后放置5min，当测定有数个样品时，这些时间很难控制，更有显色时间仅仅10分钟，不适合多个样品同时测定。阮宇成和王月根1981年在《茶叶通讯》第3期发表文章“茶氨酸的简化定量法”，依次用乙醚一醋酸乙酯混合液和乙醇溶液浸提茶样，浓缩浸提液，溶于乙醇溶液，离心后取上清液20— 25 μ L在圆形滤纸上点样，浓氨水熏，吹去氨气，用正丁醇冰醋酸水 =4:1: 1作展层剂，水平展谱。干燥，用新的展层剂再次展谱。纸谱干燥后用茚三酮溶液喷雾，干燥、显色，乙醇溶液洗脱，分光光度计570nm处比色测定。测定所用标准溶液由茶氨酸纯品配制，剪下纸谱茶氨酸斑点旁的一处作空白。该方法使用的乙醚极易挥发，为麻醉剂，属危险品，醋酸乙酯、正丁醇、冰醋酸、氨水皆为对人体有刺激性的低毒类药品；圆形滤纸因直径有限展谱距离较短，需要连续二次展谱才能将氨基酸分离，造成浪费药品且没有时间优势；显色反应发生在纸层析之后茚三酮喷雾，由于显色剂没有量的控制，导致色斑不均勻标准曲线通过配制而成，标样没有进行纸层析步骤，与测定样品处理不同，产生测定误差空白没有专门点样，随意剪下，这些造成测定不够精准。


发明内容
本发明的目的旨在提供一种简单、安全、可靠的茶氨酸分光光度计检测方法，以满足普通实验室进行茶氨酸生物化学实验与研究的需要。为实现所述目的，本发明采用技术方案如下 本发明的茶氨酸定量测定方法，包括下述步骤
(1)浸提以60-100ml沸水浸提0.2-4. Og干茶样30-60min,冷至室温，过滤，定容至 100ml，得茶浸提液；
(2)点样将茶氨酸标准溶液、空白对照蒸馏水和茶浸提液分别在滤纸上点样；所述标准溶液浓度在0. 06-0. 2mg/ml且选取同一浓度的标准溶液按照不同点样量至少点出三个占.
(3)展层以乙醇-水-茚三酮混合溶液作为展层剂，垂直层析；所述乙醇-水-茚三酮混合溶液中，乙醇体积分数70-80%，茚三酮体积分数0. 1-0. 3% ；
(4)洗脱将层析后的滤纸于40-8(TC烘干，裁下标准溶液茶氨酸色斑滤纸、茶浸提液中茶氨酸显色带的滤纸以及空白对照区域滤纸，乙醇溶液洗脱，得标样洗脱液、茶样洗脱液和空白对照洗脱液；
(5)比色、计算以空白对照样品为参比，使用分光光度计570nm处分别测定标样溶液和茶样溶液的吸光值；制作标准曲线，求出回归方程，计算茶样品中的茶氨酸含量。计算公式
MxL ___
茶氨酸％= ^-^χ οο
其中，M为从标准曲线上查到的茶氨酸质量(mg)，L1为样品定容体积(mL)，L2为样品点样体积(μ L)，W为样品干重(g)
优选的，步骤(2)中空白对照蒸馏水与茶浸提液的点样体积相同为20-40μ 1，且选取选取同一浓度的标准溶液按照不同点样量点出六个点为佳。步骤(3)所述乙醇-水-茚三酮混合溶液中，优选乙醇体积分数75%，茚三酮体积分数0. 2%。步骤(4)中滤纸于60°C干燥10-15min为佳。优选的，步骤(4)中乙醇溶液的乙醇体积浓度为60-70%。步骤(4)中洗脱时置于40_60°C水浴10-20min为佳。发明的有益效果如下
1、用水浸提茶样，乙醇溶液展层，避免有毒物质对操作人员的刺激和对环境的污染。2、茚三酮混入展层剂，既减少操作步骤，也保证显色反应定量化、色斑均勻。3、空白和茶氨酸工作液通过点样、层析制作标准曲线，保证了对照、标准物质与样品有相同的处理，减小误差，提高测定的准确性。4、茚三酮显色在较长时间内保持稳定，可用于多个样品的同时分析。5、整个测定步骤简单，涉及药品种类少，经济、环保。


图1为茶树根、芽叶测定茶氨酸标准曲线； 图2为茶叶测定茶氨酸标准曲线。
具体实施例方式实施例1
分别剪取当年生茶树杨树林品种7月份水培实生苗根系和芽叶，清洗，烘干，磨碎。分别称出0. 219g根和0. 391g芽叶，加蒸馏水60ml至于沸水浴中浸提45min，期间每隔IOmin 晃动搅拌一次。浸提结束后放置冷却至室温，过滤后定容至100ml。将层析滤纸裁成合适大小长方形，在距下沿1.5cm处用铅笔画一横线，从左向右每隔2. 5cm在横线上画一交叉点，从下面横向向上IOcm处画一记号，为展层停止标记。用微量吸管吸取样品在滤纸交叉点点样40 μ 1，每点一次即用吹风机吹干，样点直径不超过0. 5cm，重复操作，直至将所需点样量点完为止。在滤纸一个交叉点点与样品体积相同的蒸馏水作为空白。称取100 mg纯度不低于99%的茶氨酸(精确至0 . OOOOg)溶于100 mL水中作为母液，准确吸取5 mL母液，加水定容至50 mL作为工作液。用微量吸管分别吸取20、30、40、50、60、70μ 1上述茶氨酸工作液，按照样品点样方法分别在滤纸6个交叉点点样。点样的同时，在平整的实验台上铺上保鲜膜，将50ml配好的展层剂(含0.洲茚三酮的75%乙醇溶液)倒入直径15cm的培养皿中，扣上一个足够大的烧杯，用保鲜膜包裹密封，进行熏蒸，熏蒸时间不少于40min。点样结束待样点完全干燥后，将层析滤纸沿横边弯曲，将两个竖边用棉线或透明胶连接(两条边勿接触)卷成筒状，迅速移开已经熏蒸过的大烧杯，将筒状的层析滤纸垂直放入装有展层剂的培养皿中，立即扣上已经熏蒸过的大烧杯。 展层时间约池，直至展层剂上沿到达已经画好的上沿标记处即可。将层析完成的层析滤纸迅速挂在60°C的烘箱中干燥lOmin。裁下标准溶液(即上述六个不同点样量的茶氨酸工作液)茶氨酸色斑滤纸 (1. 5cmX 1. 5cm)、以及样品色谱上与标准溶液同样大小、同样位置包含有茶氨酸显色带的滤纸部分和空白对照区域，剪碎放入试管，加入5ml洗脱剂(60%乙醇)，轻摇后置于40°C水浴中20min，取出后放置至室温测定吸光值。预热721分光光度计，以空白样品为参比，在570nm处测定标样和各样品的吸光值。标样茶氨酸含量和吸光值如表1所示
表1茶树根、芽叶茶氨酸测定标样茶氨酸含量与吸光值
权利要求
1.一种茶氨酸定量测定方法，其特征在于包括下述步骤(1)浸提以60-100ml沸水浸提0.2-4. Og干茶样30-60min,冷至室温，过滤，定容至 100ml，得茶浸提液；(2)点样将茶氨酸标准溶液、空白对照蒸馏水和茶浸提液分别在滤纸上点样；所述标准溶液浓度在0. 08-0. 12mg/ml且选取同一浓度的标准溶液按照不同点样量至少点出三个占.(3)展层以乙醇-水-茚三酮混合溶液作为展层剂，垂直层析；所述乙醇-水-茚三酮混合溶液中，乙醇体积分数70-80%，茚三酮体积分数0. 1-0. 3% ；(4)洗脱将层析后的滤纸于40-8(TC烘干，裁下标准溶液茶氨酸色斑滤纸、茶浸提液中茶氨酸显色带的滤纸以及空白对照区域滤纸，分别以乙醇溶液洗脱，得标样洗脱液、茶样洗脱液和空白对照洗脱液；(5)比色、计算以空白对照样品为参比，使用分光光度计570nm处分别测定标样溶液和茶样溶液的吸光值；制作标准曲线，求出回归方程，计算茶样品中的茶氨酸含量。
2.如权利要求1所述的茶氨酸定量测定方法，其特征在于步骤(2)中空白对照蒸馏水与茶浸提液的点样量相同为20-40μ 1，选取同一浓度的标准溶液按照不同点样量点出六个点ο
3.如权利要求1所述的茶氨酸定量测定方法，其特征在于步骤(3)所述乙醇-水-茚三酮混合溶液中，乙醇体积分数75%，茚三酮体积分数0. H
4.如权利要求1所述的茶氨酸定量测定方法，其特征在于步骤(4)中滤纸于60°C干燥 10-15min。
5.如权利要求1所述的茶氨酸定量测定方法，其特征在于步骤(4)中乙醇溶液的乙醇体积浓度为60-70%。
6.如权利要求1所述的茶氨酸定量测定方法，其特征在于步骤(4)中洗脱时置于 40-60°C 水浴 10-20min。
全文摘要
本发明公开了一种茶氨酸定量测定方法，其包括步骤如下用水浸提茶样，将茶氨酸标准溶液、空白溶液和茶浸提液分别在长方形滤纸上点样，乙醇—水—茚三酮混合溶液作展层剂，垂直层析，烘干，乙醇溶液洗脱，分光光度计570nm比色测定茶氨酸含量。本发明用水浸提茶样，乙醇溶液展层，避免有毒物质对操作人员的刺激和对环境的污染，茚三酮混入展层剂，既减少操作步骤，也保证显色反应定量化、色斑均匀，空白和茶氨酸工作液通过点样、层析制作标准曲线，保证了对照、标准物质与样品有相同的处理，减小误差，提高测定的准确性，整个测定步骤简单，涉及药品种类少，经济、环保。
文档编号G01N1/28GK102435565SQ20111028636
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者房江育, 曹顺利, 王荡强, 邹鹏飞, 马雪泷 申请人:黄山学院