专利名称：肿瘤抗原及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗及诊断领域，特别涉及KRT81、VGLL1、SLC6A3、SNX31、REG1B、Cllorf63、IGF2BP3、IQGAP3、KRT23、CLCA2、REG3A在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的试剂
盒中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤现已成为威胁人类健康的第一大杀手。近年来，在恶性肿瘤的治疗方面，手术治疗、化疗和放疗都取得了很大的进步，病人的5年生存率也不断提高。但总体而言，目前恶性肿瘤的治疗效果和预后仍然较差。因此，寻找更加有效的治疗途径极为必要。免疫治疗，作为一种新的生物治疗方法，越来越受到人们的关注和重视。现有的免疫治疗方案大致可以分为过继免疫治疗(如细胞过继转移)和主动免疫治疗(即治疗性肿瘤疫苗)两大类。要进行有效的免疫治疗，寻找免疫原性强的肿瘤抗原是关键。传统的鉴定肿瘤抗原的方法有T细胞克隆筛选(见参考文献I) ,SEREx(Seix)IogicalIdentification of antigens by Recombinant cDNA expressing cloning,重组 cDNA 表达文库的血清学分析)(见参考文献2)和抑制性删减杂交(见参考文献3)等，但这些方法普遍存在实验周期长、花费高等缺点。近年来用生物信息学策略筛选肿瘤相关抗原取得进展，缩短了研究的周期。

发明内容
本发明的目的在于运用生物信息学策略高通量地开发出新的肿瘤相关抗原。为实现本发明的目的，本发明提供了 IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因作为联合诊断标志物在制备用于肺癌诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了 IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因编码的蛋白作为联合诊断标志物在制备用于肺癌诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了一种用于肺癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有用于在PCR中合成IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。本发明还提供了一种用于肺癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有IGF2BP3、IQGAP3、KRT23 和 CLCA2 蛋白。本发明还提供了 VGLLl和SNX31基因作为联合诊断标志物在制备用于膀胱癌诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了 VGLLl和SNX31基因编码的蛋白作为联合诊断标志物在制备用于膀胱癌诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了一种用于膀胱癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有用于在PCR中合成VGLLl和SNX31基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。本发明还提供了一种用于膀胱癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有VGLLl 和 SNX31 蛋白。
本发明还提供了一种筛选肿瘤抗原抗体的方法，该方法是PARSE方法和免疫沉淀法的结合。


图Ia显示肿瘤基因在正常组织中限制性表达。图Ib显示肿瘤基因在配对的癌组织中表达上调。图2显示肿瘤基因在25种肿瘤细胞系中的表达情况。图3显示PARSE和IP肿瘤筛选新策略与传统ELISA和蛋白质印记策略对比。图4a显示肿瘤基因在癌症病人血清中能产生自发抗体(PARSE法)，其中阳性血清判断标准>正常人血清CPM值均值+3倍标准差。右下角显示的数值为标准差的倍数< 3为白色，> 3颜色随倍数的增加而变深。 图4b显示肿瘤基因在癌症病人血清中能产生自发抗体(IP法)。图5显示IGF2BP3、IQGAP3、KRT23、CLCA2可作为肺癌的联合诊断标记物。图中文字的描述图Ib =TCC =膀胱移行细胞癌；NSCLC =非小细胞肺癌；GA =胃腺癌；RCC =肾细胞癌'Ck =结肠腺癌。T =肿瘤组织；N =相应的配对正常组织。图4a Anti-His =抗 his ；cancer patent’s sera =癌症患者血清；Normal sera=正常血清。图 4b Non small cell lung carcinoma =非小细胞肺癌；Norma I =正常；Input=内参；Gastriccancer =胃癌；Renal cell carcinoma =肾细胞癌；Transitional cellcarcinoma =移行细胞癌。图5 AUC表示曲线下面积。
具体实施例方式本发明运用生物信息学策略，根据已知抗原表达谱上的特点开发出一套利用微阵列(MiCToarray)数据库筛选肿瘤相关抗原的算法(见参考文献4)，这一算法是以microarray, EST和SAGE数据库为基础，对其中的基因根据其表达的组织限制性以及在癌和正常组织表达的差异性进行打分，确定其表达的肿瘤特异性。根据该算法，我们得到一批肿瘤相关抗原候选基因，随后在人正常组织库、肿瘤组织库和肿瘤细胞系中对这些基因进行RT-PCR验证，并将鉴定出的肿瘤相关基因的全长或者片段克隆到原核表达载体pET-28a上，表达蛋白，检测在肿瘤病人血清中自发产生抗体的水平，评价其诱导免疫应答的能力。肿瘤基因介绍KRT81 KRT81 (GenBank的登记号为NM_002281)基因编码的蛋白是角蛋白基因家族的成员。作为II型毛发角蛋白，KRT81能与I型角蛋白结合成异物二聚体以形成毛发和指甲。II型毛发角蛋白主要集中在12号染色体长臂2区3带。根据结构的不同又可以将其分成两个亚家族。其中KRTHBl (KRT81)、KRTHB3和KRTHB6属于一个亚家族，KRTHB2、KRTHB4和KRTHB5属于另一个亚家族。所有的毛发角蛋白均在毛发滤泡中表达。KTR81，以及KRTHB3和KRTHB6主要表达在毛发的皮质中。该基因的突变能导致毛发念珠状改变(见参考文献5，6)。
VGLLl :在GenBank的登记号为NM_016267。与果蝇的vestigial基因有相似的结构域，能与含有TEA结构域的转录因子结合，作为TEFs的共激活分子发挥作用。在组织结构的发育、器官的发育以及形态形成等生物学过程中发挥功能(见参考文献7)。SLC6A3 SLC6A3 (GenBank的登记号为NM_001044)位于人类5号染色体，由15个外显子组成。其编码的蛋白又称多巴胺转运体。是位于突触的跨膜蛋白，能够将突触间隙的神经递质多巴胺泵入胞浆，从而使信号传递发生终止(见参考文献8)。SLC6A3蛋白参与一系列多巴胺相关疾病的发生，包括注意力不足过动症(见参考文献9)，双相情感障碍(见参考文献10),酒精中毒等(见参考文献11)。SPINK4 SPINK4 (GenBank的登记号为NM_014471)位于人类9号染色体短臂I区3号带中第3号亚带，由4个外显子组成。其编码的蛋白含有一个kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal型家族的一个成员。该家族有4个成员组成，分别是SPINKl、SPINK2、SPINK4和SPINK5。均在上皮和粘膜组织的蛋白降解过程中起保护作用(见参考文献12)。 SNX31 SNX31 (GenBank的登记号为NM_152628)编码的蛋白属于分选微管连接蛋白(sorting nexin)家族。该家族成员众多，目前已发现有33个。这些成员的共同特征是含有PX结构域(与磷酸肌醇结合的结构域)。它们主要参与细胞内的运输(见参考文献13)。REGlB =REGlB (GenBank的登记号为NM_006507)属于Reg基因家族I类亚家族的成员。Reg基因家族由I、II、III、IV四个亚家族组成。其中REG1A、REGL、PAP和REGlB串联排列在2号染色体短臂I区2号带。REGlB编码的蛋白又称胰石蛋白-1-0，由胰腺外分泌部分泌，这与REGlA蛋白十分相似。REGlA蛋白与胰岛细胞的再生和糖尿病的发生有关，并且参与胰腺结石的形成(见参考文献14)。Cllorf63 Cllorf63 (GenBank的登记号为NM_024806)位于人类11号染色体长臂2区4号带中第I号亚带，对于该基因的功能目前尚无研究。IGF2BP3 IGF2BP3 (GenBank的登记号为NM_006547)编码的蛋白含有数个KH结构域，该结构域是与RNA结合的重要结构域，参与RNA的合成和代谢(见参考文献15)。能与胰岛素样生长因子II的3号前导链mRNA结合，从而抑制其在发育晚期的翻译(见参考文献16)。另外，有报道称IGF2BP3在肿瘤组织中高表达，并且表达量与预后成反比(见参考文献 17-19)。IQGAP3 IQGAP3 (GenBank的登记号为NM_178229)基因编码的蛋白属于IQGAP家族。在人类该家族有3个成员IQGAP1、IQGAP2、IQGAP3。这三个蛋白之间同源性较高，均含有IQ结构域、Ras-GAP结构域、CH结构域和Wff结构域。IQGAP3蛋白能够促进细胞的增殖(见参考文献20)，并且能够与Racl和Cdc42发生相互作用，调节神经突触的生长(见参考文献21)。KRT23 KRT23 (GenBank的登记号为NM_015515. 3)基因编码的蛋白是角蛋白基因家族的成员。角蛋白是中间纤维蛋白，能维持上皮细胞结构完整性。其可分为细胞角蛋白和毛发角蛋白两类。KRT23属于I型细胞角蛋白。I型细胞角蛋白由酸性蛋白质组成，这些蛋白质形成异型的角蛋白链发挥作用。其编码基因主要聚集在17号染色体长臂I区2带至2区I带之间。
CLCA2 CLCA2 (GenBank的登记号为NM_006536)基因编码的蛋白被称为钙活化的氯化物通道调节因子2，属于钙敏感的氯化物传导蛋白家族。迄今为止，这个家族的所有成员都定位在I号染色体的相同位置，并且不论蛋白的大小、序列还是预测的结构都具有高度的相似性。CLCA2蛋白主要表达在气管和肺(见参考文献22)，在囊性纤维病的发病过程中起到一定的作用。它还能作为肺转移癌细胞的粘附分子，介导癌细胞的血管吸附和定居。另外，有报道称CLCA2在乳腺癌中作为肿瘤抑制基因发挥抑癌作用(见参考文献23)。REG3A REG3A(GenBank的登记号为NM_002580)基因编码一个胰腺分泌性蛋白，参与细胞的增殖和分化。该蛋白与C-型凝集素超家族相似。在胰腺炎和肝癌形成时可观察到该蛋白表达增高(见参考文献24)。通过分析一些潜在抗原在正常组织和多种配对的癌和癌旁组织表达水平，我们将我们新发现的一些肿瘤抗原分成四类。其中，Cllorf63、IGF2BP3、KRT23、IQGAP3、KRT81属于CT抗原(肿瘤-睾丸抗原);VGLL1属于CP抗原(肿瘤-胎盘抗原);REG1B、SPINK4、REG3A属于DA抗原(分化抗原)；CLCA2、SLC6A3、SNX31属于TSA抗原(肿瘤特异性抗原)。需要指出的是=VGLLl和SNX31主要在膀胱癌细胞系RT-4中高表达，而对8种癌症组织的 检测发现它们也仅在膀胱癌中表达率高。这提示这两个抗原表达具有高度的特异性，可以作为膀胱癌诊断的标志物。本发明开发了一种新的筛选肿瘤抗原抗体的方法，用体外翻译体系代替传统的蛋白原核表达和纯化，利用PARSE(基于蛋白A/G的反向血清ELISA，Protein A/G basedreverse serum ELISA)和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)来快速检测肿瘤抗原抗体，发现与ELISA相比，PARSE方法具有更高的信噪比。本发明利用PARSE方法，筛选了肺癌病人血清中IGF2BP3、IQGAP3、KRT23、CLCA2四种肿瘤抗原自发性抗体产生比率，发现在正常人血清中无针对这些抗原的抗体，而在肺癌病人血清中，自发性抗体有一定的检出率。进一步扩大样本量(肺癌血清236例，正常血清123例)，用PARSE检测血清中抗体产生情况，并绘制成ROC曲线(接受者操作特性曲线，receiver operating characteristic curve)评价其诊断效果，发现 KRT23 和 IGF2BP3 单独ROC曲线下面积分别达到0. 719和0. 731，综合ROC曲线下面积已达到0. 778，具有较高的诊断意义，可以作为诊断肺癌的联合标志物。实施例以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，主要试剂和材料引物合成(各引物根据相应基因的GenBank登记号对应序列设计)及测序委托上海生工生物技术有限公司，北京六合华大基因科技股份有限公司完成；人体16种正常组织包括脑、心、肾、肝、肺、胰腺、胎盘、骨骼肌、小肠、大肠、睾丸、卵巢、PBMC、前列腺、脾脏和胸腺的RNA均购自Clontech公司；TRIZ0L 试剂购自Invitrogen公司；Wizard PlusMiniprep DNA Purification System 和 Reverse Transcription System 购自 Promega公司；同位素[35S]蛋氨酸购自Perkin-Elmer公司；体外翻译用的TNT QuickCoupledTranscription/Translation Systems 试齐[I盒购自 Promega 公司；Protein A/G 购自 sigma公司。膀胱癌、肾癌组织及配对的癌旁组织、血清标本取自北京大学第一医院泌尿外科。人肝癌与配对的癌旁组织、血清标本取自北京大学人民医院肝胆外科。人胃癌、肠癌与配对的癌旁组织标本取自北京大学人民医院胃肠外科，血清标本取自北京大学临床肿瘤医院检验科。人肺癌与配对的癌旁组织标本取自北京大学第一医院胸外科，血清标本取自北京大学临床肿瘤医院检验科。人乳腺癌与配对的癌旁组织标本取自北京大学第三医院乳腺外科。人白血病标本取自北京大学人民医院血液研究所。正常血清标本取自北京大学第三医院检验科。本文涉及的人肿瘤细胞系包括肝癌细胞系H印G2、BEL-7402、SMMC-7721、HLE、HCC-LM3 ;膀胱癌细胞系RT-4、MGH-U1 ;肠癌细胞系SW480、HT_29 ;肺癌细胞系A549、pAa ;前列腺癌细胞系PC3、DU145 ;肾癌细胞系786-0、ACHN ;卵巢癌细胞系SK-0V-6 ;乳腺癌细胞系MCF-7 ;黑色素瘤细胞系SK-MEL-37、WM45U2. 2ETI ；白血病细胞系Jurkat、U937 ;淋巴瘤细胞系Daudi ;宫颈癌细胞系Hela ;神经母细胞瘤细胞系MR-32。其中SW480、HT-29、A549、Jurkat、U937、786-0、ACHN、Hela、MR-32 来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC) ；HepG2,BEL-7402、SMMC-7721、PC3、MCF-7来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；DU145来源于中国医学科学院基础医学研究所。所有这些细胞系cDNA均取自实验室保存的cDNA文库。实施例I、筛选的肿瘤基因在正常组织限制性表达，肿瘤组织高表达I、细胞或组织的RNA提取按照TRIZOL (Invitrogen)试剂的说明书，分别提取细胞或组织总RNA，根据紫外分光光度计(Eppendorf AG 22331) 260nm处的紫外吸收光密度值(0D值)计算RNA含量。取 I U g 总 RNA,利用 Reverse Transcription System(Promega)在 GeneAmp PCR Systerm9700PCR仪中合成第一链cDNA(逆转录条件为42°C，60分钟；95°C，5分钟;4。。，①)。2、RT-PCR (逆转录聚合酶链式反应)反应体系取2 ii I上述cDNA产物作模板进行PCR扩增(GeneAmp PCR Systerm 9700)。反应中检测引物序列如表I所示，反应条件如表2所示，GAPDH作为系统内参。表I PCR反应检测引物序列
权利要求
1.IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因作为联合诊断标志物在制备用于肺癌诊断试剂盒中的应用。
2.IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因编码的蛋白作为联合诊断标志物在制备用于肺癌诊断试剂盒中的应用。
3.一种用于肺癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有用于在PCR中合成IGF2BP3、IQGAP3、KRT23 和 CLCA2 基因 DNA 链和 / 或其 cDNA 链的 PCR 引物。
4.一种用于肺癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2蛋白。
5.VGLLl和SNX31基因作为联合诊断标志物在制备用于膀胱癌诊断试剂盒中的应用。
6.VGLLl和SNX31基因编码的蛋白作为联合诊断标志物在制备用于膀胱癌诊断试剂盒中的应用。
7.一种用于膀胱癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有用于在PCR中合成VGLLl和SNX31基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。
8.一种用于膀胱癌诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有VGLLl和SNX31蛋白。
9.一种筛选肿瘤抗原抗体的方法，该方法是PARSE方法和免疫沉淀法的结合。
全文摘要
本发明属于癌症治疗及诊断领域，涉及肿瘤抗原及其应用，特别涉及IGF2BP3、IQGAP3、KRT23和CLCA2基因或其蛋白以及VGLL1和SNX31基因或其蛋白在制备用于肿瘤诊断的试剂盒中的应用。本发明还涉及建立新的血清抗体筛选方法PARSE以筛选肿瘤抗原抗体，该方法与ELISA相比具有更高的信噪比。
文档编号G01N33/68GK102776269SQ20111012243
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者张君, 张毓, 徐清问, 王晓松, 赵伟 申请人:北京大学