专利名称：一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量pcr鉴别检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种人血清、动物血清及其产品、食品以及环 境中通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法。
背景技术：
戊型肝炎(Hepatitis Ε)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)引起，是一 种经粪-口传播、以黄疸为主的急性传染病，患病孕妇的病死率更可高达21%。自1955年 印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的很多国家广泛流行。近 年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等 省均有大量流行，极大的危害人类健康。有证据显示，戊型肝炎是一种动物源性疾病，被感 染的家养或野生动物可直接传播或通过污染水源传播本病。有研究表明，猪源戊型肝炎病 毒可以感染恒河猴和黑猩猩等灵长类动物，而人戊型肝炎病毒在实验条件下也能成功感染 猪等动物；血清学调查则发现与猪频繁接触的人群(如饲养员、兽医、屠工)中戊型肝炎病 毒的抗体水平明显高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的猪肝和鹿肉而引起急性戊 肝的报道，提示了猪戊型肝炎病毒在公共卫生和食品安全方面存在的重大意义。HEV是无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长约7. 5kb，有3个开放阅读框。根 据HEV各分离株的基因组序列分析，可将其分为4个主要的基因型。I型主要发生于亚非多 数国家；II型分离于墨西哥；III型发生于美国和一些欧洲国家；IV型发生于亚洲。其中I 型和II型只能感染人，III型和IV型则为人畜共患，可感染人、猪和其它动物。在我国流 行的HEV主要为由I型和IV型。但有研究表明，上海地区猪场中已有III型HEV毒株的流 行。迄今为止，对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及 早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。这就需要建立一种通用的、高度敏 感、特异和快速的检测方法用于HEV的诊断。同时，HEV主要经污染的水源和环境传播，高 度敏感的病原检测技术也将有助于分子流行病学调查和病毒溯源。而目前可同时快速鉴定 戊型肝炎病毒各个基因型的方法尚无报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，利用TaqMan 探针技术建立I、II、III和IV型HEV的多重荧光快速分型检测体系，以期填补技术空白。为此，本发明采用如下的技术方案一种不同基因型戊型肝炎病毒的四重荧光定 量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV 0RF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异 性TaqMan探针所述的扩增引物序列为HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT,HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC,
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该引物为针对不同基因型HEV 0RF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基 因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C。
所述的TaqMan探针序列为I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3,II-P R0X-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2,III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1,IV-P FAM-CGCATCTGACATffCCARCCGC-BHQ1,四条探针分别针对各自的0RF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型 的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针 为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列种Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T， R代表碱基A或G。PCR鉴别检测方法的步骤如下1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后 加入30 μ L DEPC水溶解。2)在PCR反应管中按下表所述配置反应体系
权利要求
一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针所述的扩增引物序列为HEV FTATTCATCCAACCAACCCCTT，HEV RGTCDCGCCAAGYGGAGC，该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C；所述的TaqMan探针序列为I P CY5 TGTCACCGCTGCGGCCG BHQ3，II PROX AGACGTTGCCGCTGCGTCC BHQ2，III P HEX TTTCACAAYCCGGGGCTGGA BHQ 1，IV PFAM CGCATCTGACATWCCARCCGC BHQ 1，四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列中Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G；PCR鉴别检测方法的步骤如下1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μLDEPC水溶解；2)在PCR反应管中配置反应体系，体系的总体积为25μl，其组成如下10μl荧光定量PCR Mix，1.2μl浓度为10μM的HEV F，1.2μl浓度为10μM的HEV R，0.5μl浓度为10μM的I P，0.5μl浓度为10μM的II P，0.5μl浓度为10μM的III P，0.5μl浓度为10μM的IV P，8μl HEV阳性RNA模板，双蒸水补至25μl；3)将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下第一阶段42℃，30min；第二阶段95℃，3min；第三阶段95℃，10s，60℃，45s，45个循环，并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号；4)阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做；检测样品CT值≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品35.0＜CT值＜40.0，需进行一次重复实验，若CT值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，报告样品阳性，否则报告样品阴性；检测样品CT值为零，报告样品阴性。
全文摘要
目前对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。本发明公开了一种通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针；四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。
文档编号G01N21/64GK101962689SQ20101052363
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者何永强, 吴姗, 帅江冰, 张晓峰, 陈笑梅 申请人:浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心