专利名称：Nek2基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种NEK2基因的用途。
背景技术：
NEK2 基因(又名 NLKl、NEK2A、HsPK21，NM_002497)，位于染色体 lq32.2_q41 位区段，编码蛋白NIMA相关激酶2，属于Ser/Thr蛋白激酶类，分子量约为46KD，在有丝分裂调控过程中发挥作用。NEK2蛋白于S期开始出现并于G2末期达到最大丰度并聚集于中心体部位。NEK2的下游磷酸化作用底物包括动粒外层组分和纺锤体控制点调控蛋白Hecl，后者被证实可作为乳腺癌的预后诊断指标和治疗靶点，提示NEK2与肿瘤的发生发展存在密切的关系。NEK2与肿瘤关系的研究主要集中在乳腺癌中:NEK2与其它四个基因(BUB1B，CENPA，RACGAP1, RRM2)共同作为乳腺癌分级的分子指标用于建立乳腺癌预后诊断分子体系；其SNP位点与欧洲人群乳腺癌的预后也被证明无明显相关性。目前尚没有关于NEK2基因作为肝癌诊断标志物的报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种NEK2基因的用途，NEK2基因可作为诊断肝癌的分子标志物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:在本发明的一个方面，提供了一种 NEK2基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。优选的，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增NEK2基因的引物。所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括:与NEK2基因的核酸序列杂交的探针。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与NEK2蛋白特异性结合的抗体。在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对NEK2基因的引物或探针，或包含特异性结合NEK2蛋白的抗体。利用本发明的试剂盒，可以检测病人NEK2基因的表达情况，从而诊断病人是否患有肝癌。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15 25个核苷酸之间。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对NEK2蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人NEK2基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与NEK2蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样，表达人NEK2蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。经实验证明，本发明NEK2基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此NEK2基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1的NEK2基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的半定量RT-PCR结果图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。
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实施例1用半定量RT-PCR方法检测肝癌样本中NEK2基因的表达变化半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。运用半定量RT-PCR方法，检测20对肝癌样本中NEK2基因的表达变化，发现其在肝癌组织中呈明显的上调表达趋势。具体实验步骤如下:1.组织分离实验用组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2.RNA 抽提采用TAKARA公司的Trizol (D9108)对20对肝癌样本(癌和癌旁)组织进行抽提，并用安捷伦2100对产物的纯度和浓度进行检测。具体操作是:将碾杵和匀浆器等器皿在200°C干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzoI试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4°C离心沉淀RNA ;用75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)，结果见下表I。质量鉴定好的RNA存放在-80°c冰箱待用。表I 20对肝癌样本的RNA抽提质量检测结果
权利要求
1.一种NEK2基因的用途，其特征在于，用于制备诊断肝癌的产品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增NEK2基因的引物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括■ 与NEK2基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与NEK2蛋白特异性结合的抗体。
6.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对NEK2基因的引物对。
7.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对NEK2基因的探针。
8.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合NEK2蛋白的抗体。
全文摘要
本发明公开一种NEK2基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。本发明还公开了一种用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含特异性针对NEK2基因的引物或探针，或包含特异性结合NEK2蛋白的抗体。本发明的NEK2基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
文档编号G01N33/574GK103194533SQ20121000230
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者黄健, 刘星 申请人:上海生物芯片有限公司