专利名称：一种定量检测乙型肝炎病毒(hbv)的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学临床诊断领域，具体指一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)核 酸方法及试剂盒。
背景技术：
在我国多种流行性传染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，结核，梅毒等，对 人类健康造成了巨大危害。临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进 行检测和诊断，由于其灵敏性低和周期长等限制，仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不 能及时准确地诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优 势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度好、特异性强和诊断快速等优点。但这项技术在进行确 定病原体载量时仍存在操作复杂和灵敏性低等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决 的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标准化。核酸分子检测技术中的荧光定量PCR技术已广泛应用于分子生物学研究和医学 研究等领域。这项技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能 实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，可以对人类免疫缺陷病毒、肝炎 病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋菌、结核分 枝杆菌、淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。目前，常用的病原 微生物实时荧光定量PCR技术包括探针类和染料类两种。近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的核酸提 取技术。主要涉及两种类型技术离心柱法病毒核酸提取技术和磁珠法病毒核酸提取技 术。前者由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及 推广。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异 的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。再在磁场作用下，使磁性 颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。 磁珠法不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发 展的一个重要方向。另外，磁珠提取核酸能够获得较高的回收产率。在实际进行核酸检测的过程中运用PCR技术，为了排除假阴性结果和确定PCR的 反应效率，需要在PCR反应体系中加入内标(内对照分子)。内标可以监控PCR反应，避免样 本抑制物、DNA (RNA)提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的 定量误差进行修正。如中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内标，CN1664098A 采用beta-肌动蛋白作为内标，CN1687454A采用res_l基因作为内标，CN1940087A采用了 RNA内标。然而，相对于PCR检测方法，人们对内标的研究工作却相对很少，特别是竞争
性内标，其设计有一定的技术难点。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染 可导致阳性结果，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物 污染是最严重、但又是可以避免的因素之一。为防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种 dU化的PCR产物与UNG —起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键， 可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板 无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分 子则无任何作用。采用一种能识别核酸双链分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次 PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家 药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了 UNG酶作为审批条件之一。 但在目前仍然存在一些技术性问题，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相应 的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的方法目前已有很多，且有很多商业化试剂盒生产。 但大部分技术获试剂盒仍存在操作复杂和灵敏性低，准确性差等缺点，检测技术需要改进 和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标 准化。针对这些问题，本发明应用磁珠法获得高纯度核酸，采用竞争性内标和防污染系统降 低假阳性和假阴性，大大提高了检测效率，灵敏度和准确性。

发明内容
本发明的目的是为了提供一种可精确定量检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的方法及 其试剂盒，从根本上解决现有乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确 性差等问题，其设计的hqMan荧光探针具有灵敏度高，特异性强、稳定性好的优点。同时， 核酸DNA提取方法简单，纯度好，采用竞争性内标和防污染体系提高检测精确度，容易操 作，灵敏度度高，成本较低，特别适用于乙型肝炎病毒(HBV)精确的定量检测，灵敏度可达20 IU/ml，基本达到WHO对HBV病毒载量检测的要求。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是
一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan荧光探针技术完成 对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测 样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；其中通过专用软件，根据分析比较乙型肝 炎病毒目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及竞争 性内标的探针和引物，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜 色的荧光基团FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET ；所述实时PCR产物在60-120个碱基对范围； 在实时PCR反应液中，加入一种前述TaqMan荧光探针和引物，通过监测实时PCR反应体系 中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒(HBV)的定量检测。所述纳米磁珠法提取样品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸的步骤为首先，取冻存的 样品溶化，加入裂解液重悬样品沉淀，65°C水浴lOmin，裂解液与样品的体积比为1 :2 ；然 后，加入与样品等体积的结合液混勻，加入25 μ 1磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清； 加入3倍样品体积的洗液于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入 洗脱液，65°C水浴2min，吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4°C或_20°C保存。所述实时PCR反应体系为包括5mM的MgCl2,0. 6mg/ml的BSA，pH8. 3的20mM Tris-HCl，75 mM 的 KCl，2. 5 mM 的 dNTP，HotStar Taq 酶，PCR 增强剂，保护剂，10-50 nMHBV荧光探针，10-50 nM内标荧光探针，10-50 nM HBV上下游引物。所述样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)方法的试剂盒，包括核酸提取试剂、核酸扩增 试剂、对照品、标准品、内标，其特征在于所述核酸提取试剂中包括蛋白酶K、纳米磁珠、裂 解液、结合液、洗液A、洗液B、洗脱液；其中裂解液组成为其中裂解液组成为pH8. 0的50 mM Tris-HCl、pH8.0的10 mM EDTA、1%SDS、4 M异硫氰酸胍；结合液组成为5M异硫氰酸 胍、pH6. 6 的 20 mM Tris_HCl、37. 5% 乙醇；洗液 A、B 组成为20 mM NaCl、pH7. 5 的 2 mM Tris-HCl,70% 乙醇；洗脱液组成为pH8. 0 的 10 mM Tris_HCl、pH8. 0 的 1 mM EDTA ；所述核 酸扩增试剂由HBV PCR反应液、酶混合液-Taq酶& UDG酶、探针1、探针2组成，所述HBV PCR反应液中包含针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸而设计的引物；所述对照品中的阳性对照 为非感染性乙型肝炎病毒DNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感染性病毒DNA ； 所述标准品为含有乙型肝炎病毒(HBV) DNA序列质粒的梯度稀释物；所述内标为竞争性内 标，内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测内标是否正常 来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。所述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒HBV和竞争性内标设计的TaqMan荧光探针和 引物的序列如下
HBV 探针FAM-5' TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG ‘ 3-BHQ-1 上游引物5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3 ； 下游弓I物5，agcgccgacgggacgtagac，3 ； 内标探针HEX-5，CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC，3-BHQ-1 所述试剂盒为检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的单一试剂盒。本发明的优点及所产生的积极的技术效果是
1、引物设计特异性强，具有广谱交叉反应由于本定量检测病原微生物遗传物质的方 法应用TaqMan-荧光探针技术完成对标本模板实时PCR检测过程，其通过专用软件，根据分 析比较各种病原微生物的目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan探针和 引物，所设计的iTaqMan探针标记下列其中一种不同颜色的荧光基团FAM，Alexa546, JOE, HEX, ΤΕΤ。所列举的应用本检测方法的试剂盒中针对乙肝病毒HBV设计的TaqMan探针和引 物，具有高度保守性，可以覆盖其病原体不同的亚型或变种，有利于应用和推广。2、检测技术灵敏性强，特异和精确该检测技术使用自主开发的纳米磁珠法从样 品中获得高纯度乙型肝炎病毒(HBV)核酸，减低提取物对PCR反应的干扰，加大检测样本 量，提高检测灵敏度；采用竞争性内标和UDG酶系统完成对样品中提取的病原微生物核酸 的实时PCR检测，降低了交叉污染的可能性；优化的PCR反应体系，使检测灵敏度达到20 IU/ml，达到7个数量级的动态范围。3、竞争性内标设计设计竞争性内标，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避 免出现假阴性结果。4、技术易操作，应用范围广泛本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为 自动化检测系统，以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品中包括人源或动物源 的血液、精液、唾液。适合常规血液样品的检测，也适合自动化和高通量检测。可以判断传 染病的病情、预后和传染性，预测抗病毒治疗的效果，监测和评价抗病毒药物的疗效，提高血液和血液制品的筛选质量和应用于流行病学调查领域，为临床病原体载量的监测和治疗 方案以及药物的筛选提供了重要参考。本项发明技术和试剂盒中高纯度核酸，竞争性内标，UDG酶和优化PCR反应体系的 使用，可提供灵敏、特异和精确的实时PCR扩增和检测，提高了实时PCR反应的效率、特异 性和稳定性。本试剂盒检测25份HBV的阳性样品，与目前市场主流核酸诊断试剂相比，我们的 发明有更宽的线性范围，有更高的灵敏度。


图1是荧光实时PCR检测HBV病毒核酸的标准曲线； 图2是荧光实时PCR检测HBV病毒核酸的内标设计曲线；
具体实施例方式
该定量检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的方法，包括采用顺磁纳米磁珠法提取样品中病 毒核酸作为标本模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并 设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR 假阴性。在实时PCR反应液中，加入两种不同颜色的TaqMan探针(目的基因探针和内标探 针)，通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒(HBV) 核酸定量检测，灵敏度可达20 IU/ml。通过专用软件，根据分析比较乙型肝炎病毒(HBV)目 的基因序列，分别设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan探针和引物以及竞争性内标的 探针和引物；TaqMan探针和竞争性内标探针标记下列其中一种不同颜色的荧光基团FAM、 Alexa546、JOE、HEX、ΤΕΤ, TaqMan的PCR产物在60-120个碱基对范围。该检测方法可以检 测的样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。1、本发明实施例中所涉及的主要材料，仪器设备和样品来源如下
(1)试剂HotStarTaq酶，Proteinase K，dUTP，UDG等购自大连宝生物工程有限公司； I1aqMan荧光探针，普通PCR引物等由上海生工生物工程有限公司合成。Tris，MgCl2, BSA, 盐酸胍，异硫氰酸胍，NaOH, HAC, SDS，EDTA等购自宝泰克生物科技公司；纳米磁珠购自上海 奥润微纳新材料科技有限公司。(2)主要仪器荧光定量PCR仪(BIO-RAD)；超纯水系统(MILLIP0RE)；生物超净台 (江苏医疗设备厂)；单道移液器(EPPEND0F)；恒温水浴(江苏太仓)，恒温振荡器(江苏太仓) 等。样品含有乙肝病毒，以及正常血液样品各5份。(3) TaqMan荧光探针和引物设计通过专用软件，根据GENBANK的乙肝病毒的核 酸信息，分析比较乙肝病毒不同亚型的目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的 TaqMan探针和引物以及竞争性内标的探针，目的基因探针和内标探针分别标记下列其中一 种不同颜色的荧光基团FAM、Alexa546、JOE、HEX、ΤΕΤ, TaqMan的PCR产物在60-120个碱
基对范围。探针和引物由上海生工生物工程有限公司合成并进行荧光标记。本发明所列举的 TaqMan荧光探针及引物的序列如下
HBV-Probe :FAM_5’ TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG‘ 3-BHQ-1 HBV primer-1 :5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3 ； HBV primer-2 5' agcgccgacgggacgtagac‘ 3 ；内标-Probe :HEX_5’ CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’ 3-BHQ-1。2、HBV国家病毒标准品的检测
所述实时荧光定量PCR反应体系为50 μ 1，成分见表1，PCR反应程序见表2。以中国食品药品检定研究院提供的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的4 种浓度的HBV阳性病毒血清为待测样本，浓度分别为1 X 108IU/ml, 1 X 107IU/ml, 1 X IO6IU/ ml，和1 X 105IU/ml，采用本发明方法进行检测，每一个浓度重复实验3次，结果如图1所示。 CT值的变异系数分别为0. 52%, 0. 23%, 0. 35%和0. 39%。变异系数非常小，这表明我们的试 剂检测血清样本的重复性很好。表1 PCR反应液组分
权利要求
1.一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测 样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；其中通过专用软件，根据分析比较乙型肝 炎病毒目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及竞争 性内标的探针和引物，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜 色的荧光基团FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET ；所述实时PCR产物在60-120个碱基对范围； 在实时PCR反应液中，加入一种前述TaqMan荧光探针和引物，通过监测实时PCR反应体系 中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒(HBV)的定量检测。
2.根据权利要求1所述一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，其特征在于所述纳 米磁珠法提取样品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸的步骤为首先，取冻存的样品溶化，加入裂 解液重悬样品沉淀，65°C水浴lOmin，裂解液与样品的体积比为1 :2 ；然后，加入与样品等 体积的结合液混勻，加入25μ 1磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清；加入3倍样品体积 的洗液于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入洗脱液，65°C水浴 2min,吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4°C或_20°C保存。
3.根据权利要求1或2所述一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，其特征在于所述实时PCR反应体系为包括5mM的MgCl2,0. 6mg/ml的BSA，pH8. 3的20mMTris-HCl，75 mM 的 KCl，2. 5 mM 的 dNTP，HotStar Taq 酶，PCR 增强剂，保护剂，10-50 nM HBV荧光探针，10-50 nM内标荧光探针，10-50 nM HBV上下游引物。
4.根据权利要求3所述一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，其特征在于所述样 品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。
5.一种如权利要求1所述定量检测乙型肝炎病毒(HBV)方法的试剂盒，包括核酸提取 试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标，其特征在于所述核酸提取试剂中包括蛋白酶 K、纳米磁珠、裂解液、结合液、洗液A、洗液B、洗脱液；其中裂解液组成为其中裂解液组成 为pH8. 0 的 50 mM Tris-HCl, pH8. 0 的 10 mM EDTA、1%SDS、4 M 异硫氰酸胍；结合液组成 为5M异硫氰酸胍、pH6. 6的20 mM Tris_HCl、37. 5%乙醇；洗液A、B组成为20 mM NaCl, pH7. 5 的 2 mM Tris-HCl,70% 乙醇；洗脱液组成为pH8. 0 的 10 mM Tris-HCl, pH8. 0 的 1 mM EDTA ；所述核酸扩增试剂由HBV PCR反应液、酶混合液-Taq酶& UDG酶、探针1、探针2 组成，所述HBV PCR反应液中包含针对乙型肝炎病毒(HBV)核酸而设计的引物；所述对照 品中的阳性对照为非感染性乙型肝炎病毒DNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感 染性病毒DNA ；所述标准品为含有乙型肝炎病毒(HBV) DNA序列质粒的梯度稀释物；所述内 标为竞争性内标，内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测 内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
6.根据权利要求5所述的定量检测乙型肝炎病毒(HBV)方法的试剂盒，其特征在于所 述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒HBV和竞争性内标设计的TaqMan荧光探针和引物的序列 如下HBV 探针FAM-5' TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG‘ 3-BHQ-1上游引物5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC，3 ；下游弓I物5，agcgccgacgggacgtagac，3 ；内标探针HEX-5，CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC，3-BHQ-1。
7.根据权利要求5所述定量检测乙型肝炎病毒(HBV)方法的试剂盒，其特征在于所述 试剂盒为检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的单一试剂盒。
全文摘要
一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法及其试剂盒，包括采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为标本模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET；通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒(HBV)的定量检测；试剂盒包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标。本发明从根本上解决现有荧光探针定量PCR技术存在的准确性差和灵敏性低的问题。适用于临床血液检测和诊断，监测和评价药物的疗效，也可用于中心血站血液筛查以及流行病学调查。
文档编号G01N21/64GK102140558SQ201110099880
公开日2011年8月3日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者刘立侠, 周凯, 李望丰, 李静芝 申请人:东北制药集团辽宁生物制药有限公司